CN109071525A - 二聚化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式I化合物，它们的制备，含有它们的药物组合物和它们作为治疗活性物质单独或与DR5/FAP激动剂抗体组合的用途，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用。本发明的活性化合物可用于改善、治疗或控制癌症，特别是实体瘤。

Description

二聚化合物
技术领域
本发明涉及二聚化合物，其作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶(caspase)蛋白结合IAP的抑制剂起作用。这些分子用于改善、治疗或控制癌症，特别是实体瘤。它们可与其他药剂诸如DR5/FAP激动剂抗体组合。
这些化合物结合IAP蛋白(包括XIAP和cIAP)的BIR2和/或BIR3区域，导致半胱天冬酶级联的激活或再激活，从而可用于治疗增殖性疾病，包括癌症。
背景技术
癌症是一种由于细胞生长失控导致肿瘤局部扩张并有可能导致向远端转移的疾病。癌细胞生长的一个机制是通过避免细胞凋亡或程序性细胞死亡。细胞凋亡途径的改变已经与癌细胞耐受标准治疗(例如，化疗或放射)联系起来，并且与癌症的发病率和进展联系起来。参见，例如，E.Dean等人，“X-linked inhibitor of apoptosis protein as atherapeutic target,”Expert Opin.Ther.Targets(2007)11(11):1459-1471。
凋亡性细胞死亡的两个基本途径是内源性途径和外源性途径。所述内源性凋亡途径可通过多种机制启动，包括细胞应激和药物-诱导的DNA损伤。所述外源性途径可由趋化因子激活死亡受体(death receptors)开启。任一途径的启动均导致被称作半胱天冬酶的蛋白酶家族的激活。一旦所述半胱天冬酶被激活，其可切割各种底物，从而产生级联反应事件，该事件导致效应半胱天冬酶3和7的激活，并最终导致细胞死亡。该IAP蛋白家族可结合至半胱天冬酶并抑制其活性，因此抑制了细胞凋亡。参见，例如，Dean，同上1460页。
IAP可以包括最多三个相同结构域，称为杆状病毒的IAP重复(baculoviral IAPrepeat，BIR)结构域：BIR1、BIR2和BIR3。典型的IAP(cIAP和XIAP)的BIR3结构域可结合并抑制活化的半胱天冬酶9。不同的是，BIR2结构域结合并抑制半胱天冬酶3和7。促凋亡蛋白Smac(也称为DIABLO)可阻断IAP的BIR2和BIR3结构域与活化的半胱天冬酶竞争，导致活化的半胱天冬酶从IAP释放并完成凋亡程序。参见，例如，S.Wang，“Design of Small-Molecule Smac Mimetics as IAP Antagonists,”Current Topics in Microbiology andImmunology 348，DOI 10.1007/82_2010_111，89-113页。
已经报道肽和小分子结合XIAP和cIAP的BIR3区域，模拟Smac蛋白的作用，并释放活化的半胱天冬酶。参见，例如，Dean，同上；和M.Gyrd-Hanse等人，“IAPs:From caspaseinhibitors to modulators of NF-κB，inflammation and cancer,”Nature Review/Cancer，August 2010，Vol 10:561-574。
XIAP抑制剂可有效地使先前抗性的人癌细胞系对DR5诱导的细胞凋亡敏感。
WO 2014060770涉及新的二环杂环，其可以是IAP蛋白质家族(IAP)的拮抗剂。WO2014161845涉及双特异性抗体(其包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点)、对DR5具有特异性的抗体、其制备方法、含有所述抗体的药物组合物及其用途。
本领域仍然存在这样的问题，即仅使用XIAP抑制剂或与DR5/FAP激动剂抗体组合，找到靶向癌症的有效疗法的方法。
发明内容
本发明一方面为式I化合物或其药学上可接受的盐：
其中，L、A和R1如本申请中所述。
本发明还涉及药物组合物，其包含一种或多种本发明化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明进一步涉及在哺乳动物(特别是人)中改善、控制或治疗癌症(包括特别是实体瘤，例如肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、骨癌和前列腺癌)的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。
具体实施方式
定义
除非另外提及，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，以下术语应具有以下定义。
单独或与其他基团组合的术语“C1-6-烷基”是指1至6个碳原子的单价直链或支链饱和烃，可单独或与其他术语组合使用。实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基、异丙基、丁基(也称为正丁基)、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
单独或与其他基团组合的术语“C1-6-烷氧基”代表-O-C1-6-烷基，其可以是直链或支链的(具有单支链或多支链)，其中烷基通常包括1至6个碳原子，例如，甲氧基(OMe，MeO)、乙氧基(OEt)、丙氧基、异丙氧基(异-丙氧基)、正丁氧基、异-丁氧基(异丁氧基)、2-丁氧基(仲丁氧基)、叔-丁氧基(叔丁氧基)、异戊氧基(异-戊氧基)等。具体的“C1-6-烷氧基”是具有1至4个碳原子的基团，特别是2-甲氧基丙基。
单独或与其他基团组合的术语“C1-6-烷氧基-C1-6-烷基”是指如本文所述的“C1-6-烷基”，其被如本文所述的“C1-6-烷氧基”取代。实例包括-C(H,Me)-OMe等。
术语“卤素”是指选自F、Cl、Br或I的原子。在具体实施方案中，卤素是指F。
单独或与其他基团组合的术语“C3-6-杂环烷基”是指3至6元碳环，其具有至少一个如O、N或S的杂原子，特别是一个O。具体实例是四氢吡喃基。
术语“半数最大抑制浓度”(IC50)表示在体外获得50％生物学过程抑制所需的特定化合物的浓度。IC50值可对数转换为pIC50值(-log IC50)，其中较高的值表示指数级更大的效力。IC50值不是绝对值，而是取决于实验条件，例如使用的浓度。可使用Cheng-Prusoff方程(Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099)将IC50值转换为绝对抑制常数(Ki)。术语“抑制常数”(Ki)表示特定抑制剂与受体的绝对结合亲和力。它使用竞争结合测定法测量，并且如果不存在竞争性配体(例如放射性配体)，则其等于特定抑制剂占据50％受体时的浓度。Ki值可对数转换为pKi值(-log Ki)，其中较高的值表示指数级更大的效力。
“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病状态时足以实现对疾病状态的这种治疗的化合物的量。“治疗有效量”会取决于化合物、所治疗的疾病状态、所治疗的疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、施用途径和形式、主治医师或兽医的判断等因素而变化。
“药学上可接受的”例如药学上可接受的载体、赋形剂等是指药理学上可接受的且对施用了具体化合物的受试者而言基本上是无毒的。
“药学上可接受的盐”是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化合物的生物学效应和性质，且由合适的无毒的有机或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸)和衍生自有机酸(诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、三氟乙酸等)的那些盐。碱加成盐的实例包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物(诸如四甲铵氢氧化物)的那些盐。将药学化合物(即药物)转化为盐的化学修饰是药物化学家公知的技术，以获得化合物改进的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解度。参见例如Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1995)atpgs.456-457。
如本申请所用，如果结构式或基团出现取代基缺失，也就是说化合价显示不完全，则推测该缺失的取代基为H。
每当手性碳存在于化学结构中时，该结构意图涵盖所有与该手性碳相关的立体异构体，其为纯立体异构体及其混合物。
本发明还提供药物组合物、上述化合物的使用方法及其制备方法。
术语“特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体”是指能够以足够的亲和力结合DR5和FAP的双特异性抗体，使得该抗体可用作靶向表达DR5和FAP的细胞的诊断和/或治疗剂。具体地，“特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体”是指靶向肿瘤细胞上的DR5和围绕所述肿瘤的基质中的FAP的双特异性抗体。在一个实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体与不相关的非FAP或非DR5蛋白的结合程度小于所述抗体与DR5或FAP结合的约10％，其例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于表面等离子体共振(SPR)的测定(例如Biacore)或流式细胞术(FACS)所测量。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体结合DR5或FAP的表位，所述表位在来自不同物种的DR5或FAP中是保守的。优选地，所述双特异性抗体与人和食蟹猴DR5以及与人、食蟹猴和小鼠FAP结合。
术语“特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体”是指能够以足够的亲和力结合DR5的抗体，使得该抗体可用作靶向表达DR5的细胞的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体与不相关的非DR5蛋白的结合程度小于所述抗体与DR5结合的约10％，其例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)所测量。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体结合DR5的表位，所述表位在来自不同物种的DR5中是保守的。具体地，所述抗体与人和食蟹猴DR5结合。术语“特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体”还涵盖能够结合DR5和第二抗原的双特异性抗体。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出期望的抗原结合活性。
术语“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合与完整抗体结合的抗原的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)。此外，抗体片段包含单链多肽，其具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起组装，或VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起组装，结合功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
术语“Fab片段”是指这样的抗体片段，其包含轻链片段，所述轻链片段包含VL结构域和轻链的恒定结构域(CL)，以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。由于可变区或恒定区的交换，所述Fab片段也称为“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“跨界Fab片段”。跨界Fab分子的两种不同链组成是可能的并且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即所述跨界Fab分子包含由以下组成的肽链：轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该跨界Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。另一方面，当交换Fab重链和轻链的恒定区时，跨界Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该跨界Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。包含跨界Fab片段的双特异性抗体形式已描述于例如WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080251、WO2009/080254、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中。
术语“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL，经由CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定化。此外，经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链第44位和可变轻链第100位)，可通过产生链间二硫键进一步稳定这些单链Fab分子。
术语“N-末端”表示N-末端的最后一个氨基酸。术语“C-末端”表示C-末端的最后一个氨基酸。
短语“与相同表位结合的抗体”作为参考抗体是指在竞争测定中阻断所述参考抗体与其抗原的结合50％或更多的抗体，相反，参考抗体在竞争试验中阻断所述抗体与其抗原的结合50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体，通常通过重组DNA技术制备。包含兔可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的其他优选形式的“嵌合抗体”是其中恒定区已经由原始抗体的修饰或改变以产生本发明的特性的那些，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。这种嵌合抗体也称为“类别转换抗体”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，其包含编码免疫球蛋白可变区的DNA节段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA节段。产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，并且基因转染技术是本领域公知的。参见例如Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；第5,202,238和5,204,244号美国专利。
术语“效应功能(Effector function)”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
术语“工程、工程化、工程化的”被认为包括肽骨架的任何操作或天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程包括氨基酸序列，糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
本文使用的术语“氨基酸突变”意在涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如与Fc受体的结合降低，或与另一种肽的结合增加。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸取代该种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)取代。可使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。预期通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，从Fc结构域的第329位的脯氨酸到甘氨酸的取代可表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有至少一部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991所述。本文使用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚化Fc结构域的两种多肽之一，即包含能够稳定自我接合的免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
短语“促进Fc结构域的第一和第二亚基结合的修饰”是指肽骨架的操作或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或阻止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽接合形成同源二聚体。本文使用的修饰促进的结合特别包括对期望接合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)中的每一个进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进两个Fc结构域亚基的接合。例如，促进接合的修饰可改变Fc结构域亚基中的一个或两个的结构或电荷，以便分别在空间上或静电上有利于其接合。因此，(杂)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，其在与每个亚基(例如抗原结合部分)融合的其他组分不同的意义上可能是不相同的。在一些实施方案中，促进接合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个具体实施方案中，修饰促进接合包括Fc结构域的两个亚基中的每一个中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“人抗体”是具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的，或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。同样如本发明的嵌合和人源化抗体所述，本文使用的术语“人抗体”还包括在恒定区中被修饰以产生本发明特性的抗体，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即Fc部分的改变或突变(例如从IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
术语“人源化”抗体是指嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR都对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指已经历人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经从原始抗体的另外修饰或改变以产生本发明特性的那些，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。。
本文使用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区，其在序列中是高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102氨基酸残基。(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。)高变区(HVR)也称为互补决定区(CDR)，并且这些术语在本文中可互换使用，指的是形成抗原结合区的可变区的部分。Kabat等人,U.S.Dept.of Healthand Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)和Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)已经描述了该特定区域，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体的CDR或其变体意图在本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上文引用的每篇参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基在下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表A.CDR定义1
CDR Kabat Chothi<sub>a</sub> AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub>CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub>CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub>CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub>CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub>CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub>CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人阐述的编号惯例(参见下文)。
2表A中使用的具有小写“b”的"AbM"是指由Oxford Molecular的"AbM"抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。本文使用的“Kabat编号”是指Kabat等人,U.S.Dept.of Health and HumanServices,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)阐述的编号系统。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。
除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩写CDR或a-CDR的CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在L1的31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、H3的95-102氨基酸残基。(参见Almagro和Fransson Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(同上)编号。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
本文使用的的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的变体抗体，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、用于制备本文所述单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
术语“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可被分配为两种类型中的一种，称为卡帕(κ)和兰布达(λ)。
术语“药品说明书(package insert)”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这些治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
短语“无实质交叉反应性”是指分子(例如，抗体)不识别或特异性结合不同于分子的实际靶抗原的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别是当与该靶抗原相比时。例如，抗体可与不同于实际靶抗原的抗原结合少于约10％至少于约5％，或者可以以小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，优选小于约2％，1％或0.5％，最优选小于约0.2％或0.1％不同于实际靶抗原的抗原的量结合不同于实际靶抗原的所述抗原。
关于参考多肽序列的短语“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，在比对序列，并且如果必要，引入缺口以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括实现相对于所比较的序列的全长的最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经在U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559提交用户文档，其以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的基因泰克公司公开获得，或者可从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统上使用，包括数字化UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A的氨基酸序列与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表示为具有或包含与给定氨基酸序列B具有一定的％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)，如下计算：
X/Y分数的100倍，
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在A和B的程序比对中得到的相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。可以理解，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A与B的％氨基酸序列同一性不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有说明，否则本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
除非另有说明，否则本文使用的术语“死亡受体5(DR5)”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然DR5，包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未加工的DR5以及由细胞中的加工产生的任何形式的DR5。该术语还涵盖天然存在的DR5变体，例如剪接变体或等位基因变体。WO 2011/039126中公开了示例性人DR5的氨基酸序列。
除非另有说明，否则本文使用的术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未加工的FAP以及由细胞中的加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖天然存在的FAP变体，例如剪接变体或等位基因变体。优选地，本发明的抗-FAP抗体结合FAP的细胞外结构域。WO 2012/020006中公开了示例性FAP多肽序列的氨基酸序列，包括人FAP的序列。
本文使用的术语癌症是指增殖性疾病，诸如所述癌症是结肠直肠癌、肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和间皮瘤，包括任何上述癌症的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌，并且任选地化学治疗剂是伊立替康(Irinotecan)。本文使用的“肉瘤”是指在结缔组织中生长的癌症类型。肉瘤包括胃肠道间质瘤(一种存在于胃和肠的软组织肉瘤，通常称为GIST)、软组织肉瘤(例如平滑肌肉瘤、成纤维细胞肉瘤、脂肪肉瘤、卡波西肉瘤(KS)、血管肉瘤、恶性外周神经鞘肿瘤(MPNST)、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤)和骨肉瘤(例如软骨肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、脊索瘤)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
当在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合位点”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链可变结构域包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的N-至C-末端。特别是，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大并且定义抗体的特性的区域。CDR和FR区根据Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)和/或来自“高变环”的那些残基的标准定义来确定。
抗体特异性是指针对抗原的特定表位选择性识别抗体。例如，天然抗体是单特异性的。根据本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体对两种不同的抗原具有特异性，即作为第一抗原的DR5，作为第二抗原的FAP。
本文使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
本文使用的术语“双特异性”抗体表示具有至少两个结合位点的抗体，每个结合位点结合相同抗原或不同抗原的不同表位。
本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文提供了双特异性抗体，其具有针对FAP和DR5的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合DR5的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达DR5的细胞。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见例如第5,731,168号美国专利)。多特异性抗体还可通过以下方式制备：通过工程化静电转向效应制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，第4,676,980号美国专利号，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；并使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体(如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述)。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双作用FAb”或“DAF”，其包含至少一个结合FAP或DR5以及另一种不同抗原的抗原结合位点(例如，参见US2008/0069820)。
本申请中使用的术语“价”表示抗体分子中存在指定数量的结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本发明的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价的”或“多价的”(例如“四价的”或“六价的”)。
本发明的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。换言之，即使在存在多于两个结合位点的情况下(即抗体是三价或多价的)，抗体也可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如，多价单链抗体、双抗体和三抗体，以及具有全长抗体的恒定域结构的抗体，其他抗原结合位点(例如，单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)2)经由一个或多个肽-接头与所述抗体连接。抗体可以是来自单个物种的全长，或可以是嵌合的或人源化的。
本申请中使用的术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这些名称包括后代(progeny)。因此，词语“转染子”和“转染的细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解，由于故意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不完全相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同功能或生物活性的变体后代。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则本文使用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述如下。
本文使用的术语“结合”或“特异性结合”是指抗体与抗原表位在体外测定中的结合，优选在表面等离子共振测定(SPR,BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体接合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。结合或特异性结合是指结合亲和力(KD)为10-8mol/l或更低，优选10-9M至10-13mol/l。
可通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)研究抗体与死亡受体的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体接合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链，磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是抗原被抗体所结合的区域。
本文使用的术语“工程、工程化、工程化的”，特别是前缀“糖-”，以及术语“糖基化工程”被认为包括对天然存在的或重组多肽或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机制的代谢工程，包括寡糖合成途径的遗传操作，以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的改变。在一个具体实施方案中，该工程导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
可以组合所有单独的实施方案。
在一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物
其中
A选自
n＝0或1，
R1选自H、卤素或C1-6-烷基，
R2选自H、卤素或C1-6-烷基，
R3选自H、卤素或C1-6-烷基，
R4选自C1-6-烷基、C1-6-烷氧基-C1-6-烷基或C3-6-杂环烷基，
R5选自H、卤素或C1-6-烷基，
R6选自H、卤素或C1-6-烷基，
L选自
m＝1、2或3，
k＝1、2或3，
或其药学上可接受的盐。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中所述基团L-A选自
L-6-A，其中m＝1、2或3且k＝1、2或3。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中R1为F。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-1。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-1且n为0。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-1且n为1。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-1且R2和R3为F。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-1，n为0且R2和R3为F且R4选自
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-1，n为1且R2和R3为F且R4选自
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-2。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-2且R5为F或其中A为A-4且R6为F。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-2且R5为F。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-3。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中A为A-4且R6为F。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-1、L-2或L-3。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-1。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-2。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-2且m为1。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-2且m为2。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-2且m为3。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-3。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-4或L-6。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-4。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-5。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-5且k为3。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物，其中L为L-6。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的化合物，其选自
N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3R)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-(噁烷-4-基)乙酰基]-1,3-二氢异吲哚-5-基]氨基]-2-氧代乙基-]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-(噁烷-4-基)乙酰基]-1,3-二氢异吲哚-5-基]氨基]-2-氧代乙基-]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-N-(2,6-二氟苯基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(R)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(R,R,R)-N,N'-(乙烷-1,2-二基)双(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺)三盐酸盐，
(S)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺，
(S)-N-(2-(((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3R)-3-甲氧基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3S)-3-甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)戊酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(3-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-4-氧代丁基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
N-(2-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐，
N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
N-(4-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，和
N1-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-N3-(3-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-基)丙基)丙二酰胺三盐酸盐。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的化合物，其用作治疗活性物质。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的化合物，其用于治疗性和/预防性治疗癌症。
本发明的一个实施方案涉及式I的二聚化化合物的式I-a的单体
其中
R1选自H、卤素或C1-6-烷基，且
R选自
本发明的一个实施方案涉及药物组合物，其包含任意本文所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的一个实施方案涉及本文所述的式I化合物，其用作治疗活性物质。
本发明的一个实施方案涉及本文所述的式I化合物，其用于癌症的治疗性和/或预防性治疗。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)，并且包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点。
本发明的一个实施方案涉及权利要求1-8中任一项的式I化合物与如本文所述的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其用作与本文所述的双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ IDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物与如本文所述的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用，其中所述双特异性抗体包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与本文所述的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合疗法，其中所述癌症是结肠直肠癌、肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和间皮瘤。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合如本文所述的死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)，其中SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂和双特异性抗体交替施用。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物与如本文所述的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用，其中所述双特异性抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:18、19和20或所述双特异性抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:17、19和20。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的式I化合物与如本文所述的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用，其中所述双特异性抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:18、19和20或所述双特异性抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:17、19和20。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合如本文所述的死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)，其中抗体是人的。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合如本文所述的死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)，其中抗体是人源化的。
本发明的一个实施方案涉及药物组合物，其包含作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，所述化合物在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合如本文所述的死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
本发明的一个实施方案涉及试剂盒，其包含含有化合物的第一容器和包含含有双特异性抗体的第二容器，所述化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用，所述化合物在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合如本文所述的死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
本发明的一个实施方案涉及作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物和双特异性抗体在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中的用途，其中所述双特异性抗体结合如本文所述的死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗性和/或预防性治疗癌症的药物中的用途。
本发明的一个实施方案涉及结合DR5和FAP的双特异性抗体特异性地交联死亡受体并诱导靶细胞的凋亡。这些双特异性死亡受体激动剂抗体优于常规死亡受体靶向抗体的优点在于仅在表达FAP的位点诱导细胞凋亡的特异性。如上所述，与已知的DR5结合物相比，本发明的发明人开发了具有优异特性的DR5结合部分，所述DR5结合物可掺入新颖和有利的DR5-FAP双特异性抗体中。
本发明的一个实施方案涉及包含结合DR5和FAP的双特异性抗体的治疗组合，其包含
至少一种对DR5具有特异性的抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO.:1的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO.:2的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO.:3的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO.:6的轻链CDR3；和
至少一种对FAP具有特异性的抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO.:9的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO.:10的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO.:11的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO.:14的轻链CDR3。
本发明的一个实施方案涉及双特异性抗体，其包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含含有SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含含有SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的一个实施方案涉及包含SEQ ID NO.:18、SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20的双特异性抗体。
本发明的一个实施方案涉及包含SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20的双特异性抗体。
本发明的一个实施方案涉及结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO.:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列，和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包括SEQ ID NO.:15的可变重链和SEQ ID NO.:16的可变轻链。
本发明的一个实施方案涉及具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列，其含有相对于参考序列的取代(例如保守取代)、插入或缺失，但结合DR5和FAP的双特异性抗体包含保留结合FAP和DR5的能力的序列。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:7中已经取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO.:7中的VH序列，其包括该序列的翻译后修饰。
本发明的一个实施方案涉及结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO.:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列，和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含SEQ ID NO.:15的可变重链和SEQ ID NO.:16的可变轻链。
本发明的一个实施方案涉及具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列，其含有相对于参考序列的取代(例如保守取代)、插入或缺失，但结合DR5和FAP的双特异性抗体包含保留结合DR5和FAP的能力的序列。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:8中已经取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO.:8中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。
本发明的一个实施方案涉及提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含SEQ ID NO.:8的可变轻链和SEQID NO.:7的可变重链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO.:15的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有相对于参考序列的取代(例如保守取代)、插入或缺失，但结合DR5和FAP的双特异性抗体包含保留结合FAP和DR5的能力的序列。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:15中已经取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO.:15中的VH序列，其包括该序列的翻译后修饰。
本发明的一个实施方案涉及提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含SEQ ID NO.:8的可变轻链和SEQID NO.:7的可变重链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO.:16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有相对于参考序列的取代(例如保守取代)、插入或缺失，但结合DR5和FAP的双特异性抗体包含保留结合FAP和DR5的能力的序列。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:16中已经取代、插入和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO.:16中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。
本发明的一个实施方案涉及结合DR5和FAP的双特异性抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH，和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，和SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中的VH和VL序列，其包括那些序列的翻译后修饰。
本发明的一个实施方案涉及根据任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，根据任何上述实施方案的结合DR5和FAP的所述双特异性抗体是人抗体。
式I化合物及其盐具有至少一个不对称碳原子，并且因此可作为不同立体异构体的混合物存在。各种异构体可通过已知分离方法分离，例如色谱法。
本文公开的并且由上式I覆盖的化合物可表现出互变异构或结构异构。本发明旨在涵盖这些化合物的任何互变异构或结构异构形式，或这些形式的混合物，并且不限于上式中所示的任何一种互变异构或结构异构形式。
序列
1.噬菌体展示衍生的DR5结合物的氨基酸序列
2.FAP结合物的氨基酸序列
3.包含噬菌体展示衍生的DR5结合物的双特异性分子的氨基酸序列
剂量
本发明化合物优选与IAP的BIR域结合，防止了IAP与其他蛋白结合。Bir结合蛋白的实例包括，但不限于，半胱天冬酶3、半胱天冬酶7、半胱天冬酶9、Smac等。IAP的实例包括，但不限于，XIAP、cIAP1、cIAP2或NAIP。一方面。本发明化合物与XIAP、cIAP1和/或cIAP2的BIR2和/或BIR3域结合。另一方面，本发明化合物与XIAP、cIAP1和/或cIAP2的BIR2域结合。
本发明化合物可用于在细胞中诱导凋亡或使细胞(特别是癌细胞)对凋亡信号敏感。凋亡信号可在癌细胞中通过例如放射治疗或抗肿瘤化疗来诱导。或者，凋亡信号可在癌细胞中通过死亡受体激动剂激活死亡受体来诱导。死亡受体激动剂可以为天然存在的，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)，或非天然存在的，例如合成的抗体，诸如DR4或DR5抗体。
因此，本发明化合物用于改善、控制或治疗细胞增殖性病症，例如特别是肿瘤病症。这些化合物和含有所述化合物的制剂可预期用于治疗或控制血液癌症，例如急性髓细胞样白血病或实体瘤，例如，乳腺癌、直肠癌、肺癌和前列腺癌。
本发明化合物的“治疗有效量”或“有效量”是指有效预防、减轻或改善疾病的症状或延长所治疗的受试者存活时间的化合物的量。治疗有效量的确定在本领域技术范围内。
本发明化合物的治疗有效量或剂量在宽的范围内变化，并且可通过本领域已知的方式来确定。在每种具体情况下，可对所述剂量进行调整以适应个体需要，包括所施用的具体化合物、施用途径、所治疗的病症以及被治疗的患者。通常，在向约70Kg体重的成人口服或肠胃外施用的情况下，每天约10mg至约10,000mg的剂量，优选约200mg至约1,000mg的剂量应当是合适的，但是在有指示的情况下可以超出上限。日剂量可以按单一剂量或分份剂量施用，或者对于肠胃外施用，其可以一次或多次推注或连续输注形式给予。
可用于本发明实践的药物制剂，即，包含本发明化合物的药物制剂可通过内部，诸如口服(例如片剂、包衣片剂、糖衣丸(dragées)、硬和软明胶胶囊、溶液、乳剂或混悬液的形式)、经鼻(例如鼻腔喷雾的形式)或经直肠(例如栓剂形式)施用。然而，也可以通过肠胃外施用，诸如肌内或静脉内(例如注射溶液的形式)。此外，可进行局部施用(例如软膏剂、乳膏剂或油的形式)。
组合物/制剂
在另一实施方案中，本发明包括药物组合物，其包含至少一种式I化合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。
这些药物组合物可适于口服、经鼻、局部(包括含服和舌下)、经直肠、经阴道给药和/或肠胃外施用。所述制剂可方便地以单位剂量形式存在并且可通过制药领域公知的方法来制备。可与载体物质组合以产生单一剂量形式的活性成分的量可根据所治疗的宿主以及具体施用模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂量形式的活性成分的量通常为式I化合物产生治疗作用的量。通常，以100％计，该量可在1％至99％活性成分的范围内变化，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明化合物与载体以及任选的一种或多种辅助成分组合。通常，所述制剂是通过使本发明化合物与液体载体或微细分散的固体载体或二者均匀且充分的组合制备的，然后根据需要使产品成形。
式I化合物及其药学上可接受的盐和酯可用药学上惰性的、无机或有机佐剂处理以制备片剂、包衣片剂、糖衣丸和硬明胶胶囊。例如，可使用乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等作为片剂、糖衣丸和硬明胶胶囊的佐剂。
软明胶胶囊的合适佐剂例如，植物油、蜡类、脂肪、半固体物质和液体多元醇等。用于制备溶液和糖浆的合适佐剂，例如H2O、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖等。注射溶液的合适的佐剂例如，H2O、醇、多元醇、甘油、植物油等。栓剂的合适佐剂例如，天然或硬化油、蜡类、脂肪、半固体或液体多元醇等。局部制剂的合适佐剂为甘油酯、半合成和合成甘油酯、氢化油、液体蜡、液体石蜡、液体脂肪醇、甾醇、聚乙二醇和纤维素衍生物。
此外，所述药物制剂可含有防腐剂、增溶剂、增加粘度的物质、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。它们还可含有其他治疗性物质。
本发明化合物(通式I化合物)可使用下面方案所列的总反应方案进行制备。
方案1
步骤A：溴衍生物II与合适的有机金属试剂诸如(4-氟苄基)氯化锌(II)偶联形成衍生物III可通过以下方式实现：使用钯催化剂诸如[1,1-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)或[1,1-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物，于合适的溶剂诸如二噁烷、四氢呋喃、二甲氧基乙烷或二甘醇二甲醚中，在60℃至120℃保持1小时至24小时。具体条件是于四氢呋喃中在90℃在密封管中使用[1-(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)二氯甲烷络合物18小时。
步骤B：氨基保护基团从衍生物III中的裂解可用本领域已知的各种方法进行。叔丁氧基羰基基团可使用无机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0至60℃裂解。具体的保护基团PG是叔丁氧基羰基基团。优选的条件是在50℃于二噁烷中使用HCl 5小时。
步骤C：酰胺偶联可通过胺IV与酸V在酰胺偶联试剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)，丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中反应来实现。具体条件是于乙酸乙酯中在室温使用丙基膦酸酐和N-甲基吗啉18小时。
步骤D：酯VI的皂化可通过用碱诸如氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钠于水或水和有机溶剂诸如四氢呋喃、乙醇或甲醇的混合物中处理来实现。具体条件是于乙醇和水的混合物中在60℃使用氢氧化锂3小时。
步骤E：酰胺偶联可通过酸VII和胺VIII在酰胺偶联剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)，丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中反应来实现。具体条件是于乙酸乙酯中在室温使用丙基膦酸酐和N-甲基吗啉18小时。
步骤F：Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
步骤G：酰胺偶联可通过酸VII和氨基酯X在酰胺偶联剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)，丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中反应来实现。具体条件是于乙酸乙酯中在室温使用HATU和N-甲基吗啉18小时。
步骤H：酯XI的皂化可通过用碱诸如氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钠与水或水和有机溶剂诸如四氢呋喃、乙醇或甲醇的混合物中处理来实现。具体条件是于乙醇和水的混合物中在60℃使用氢氧化锂3小时。
步骤I：酰胺偶联可通过酸XII和胺VIII在酰胺偶联剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)，丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中反应来实现。具体条件是于乙酸乙酯中在室温使用丙基膦酸酐和N-甲基吗啉18小时。
步骤J：Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
方案2
酯IVa通过手性分离可分离成其对映异构形式IVa-1和IVa-2。优选的手性分离是使用手性固定相诸如Chiralpak AD和合适溶剂诸如异丙醇和庚烷的混合物的手性色谱。
方案3
步骤A：溴衍生物XIV与合适的有机金属试剂如(4-氟苄基)氯化锌(II)偶联形成衍生物XV，可通过以下方式实现：使用钯催化剂诸如[1,1-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)或[1,1-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物，于合适的溶剂诸如二噁烷、四氢呋喃、二甲氧基乙烷或二甘醇二甲醚中，在60℃至120℃保持1小时至24小时。具体条件是于四氢呋喃中在90℃在密封管中使用[1,1-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物2小时。
步骤B：氨基保护基团衍生自衍生物XV的裂解可用本领域已知的各种方法进行。叔丁氧基羰基基团可使用无机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0至60℃裂解。具体保护基团PG是叔丁氧基羰基基团。优选的条件是在室温使用HCl/甲醇2小时。
步骤C：酰胺偶联可通过胺XVI与酸V在酰胺偶联剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)、丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺，二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中完成。具体条件是于二甲基甲酰胺中在室温使用HATU和二异丙基乙胺18小时。
步骤D：腈的还原可通过以下方式实现：在镍盐存在下与硼氢化物试剂反应，或使用合适的催化剂诸如Raney镍，于溶剂诸如甲醇或乙醇中，在室温或升高的温度下，添加或不添加氨。具体条件是在大气压使用Raney镍(作为催化剂)和7N氨/甲醇(作为溶剂)溶液在60℃使用氢气18小时。
步骤E：胺XVIII与丙二酸单苄基酯XIX的酰胺偶联可在酰胺偶联剂诸如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)、丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中实现。具体条件是于二甲基甲酰胺中在室温使用HATU和二异丙基乙胺18小时。
步骤F：酯XX的皂化可通过用碱诸如氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钠于水或水和有机溶剂诸如四氢呋喃、乙醇或甲醇的混合物中处理，或通过在常压或升高的压力下与催化剂诸如Pd-C于溶剂诸如甲醇或乙醇中氢化实现。具体条件是在室温使用常压氢气和钯/炭作为催化剂与溶于甲醇中的化合物6小时。
步骤G：酰胺偶联可通过酸XXI与胺VIII在酰胺偶联剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC),O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU),O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)、丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃或乙酸乙酯中完成。具体条件是在室温于乙酸乙酯中使用丙基膦酸酐和N-甲基吗啉18小时。
步骤H：Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
方案4
步骤A：胺VII与乙二胺XXIV的酰胺偶联可在酰胺偶联剂诸如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)、丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中完成。具体条件是于二甲基甲酰胺中在室温使用HATU和二异丙基乙胺18小时。
步骤B：Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
方案5
步骤A：酯VI通过与还原剂诸如硼氢化锂、硼氢化钠或红铝(Red-Al)于合适的溶剂诸如1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、甲苯、甲醇或乙醇中在-78℃至回流反应1至24小时，可转化为醇XXVII。具体条件是用于与硼氢化钠于甲醇中在0℃反应5小时，并使混合物温热至室温过夜。
步骤B：Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
方案6
Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
方案7
步骤A：胺VII与胺XXX的酰胺偶联可在酰胺偶联剂诸如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(TBTU)、丙基膦酸酐(T3P)等和碱诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶存在下于溶剂诸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中完成。具体条件是于二甲基甲酰胺中在室温使用HATU和二异丙基乙胺18小时。
步骤B：Cbz基团的除去可通过在常压或高压下用催化剂诸如Pd-C于溶剂诸如甲醇或乙醇中氢化实现。具体条件是在室温使用常压氢气和钯/炭作为催化剂与溶于甲醇中的化合物6小时。
步骤C：Boc N-保护基团的除去可用无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸诸如三氟乙酸、二氯乙酸、乙酸或对甲苯磺酸于溶剂诸如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇或水中在0℃至80℃进行。具体条件是于二噁烷和乙酸乙酯的混合物中在室温使用HCl 18小时。
基于本公开，进行上述反应和方法的方法对于本领域普通技术人员而言是显而易见的，或者可类似地从实施例中推断出来。起始原料可商购获得，或者可通过类似于下面实施例中所述的方法制备。
晶体形式
当本发明的化合物是固体时，本领域技术人员应理解，这些化合物及其盐可以不同的晶体或多晶型物形式存在，所有这些都在本发明和特定式的范围内。
测定
XIAP BIR2和BIR3的TR-FRET测定
测试化合物抑制XIAP蛋白的BIR2和/或BIR3结构域与肽A(下文描述的SMAC衍生的肽)结合的能力证明测试化合物做SMAC模拟物起作用，导致细胞的凋亡途径的再活化。
如前所述(WO 2014/090709 A1)，肽AVPIAQKSEK(SEQ ID NO.:21)被鉴定为在该测定中使用的最佳肽。用生物素衍生肽序列以得到AVPIAQKSEK-(ε-生物素)-OH 1:2 TFA作为TR-FRET测定的底物。
XIAP蛋白质序列获自SWISS-PROT蛋白质序列数据库，且BIR2和BIR3结构域来源于此。用于TR-FRET测定的BIR2结构域的序列是
MRHHHHHHRDHFALDRPSETHADYLLRTGQVVDISDTIYPRNPAMYSEEARLKSFQNWPDYAHLTPRELASAGLYYTGIGDQVQCFACGGKLKNWEPGDRAWSEHRRHFPNCFFVLGRNLNIRSE(SEQ ID NO.:22)。
用于TR-FRET测定的BIR3结构域的序列是
MRHHHHHHRSDAVSSDRNFPNSTNLPRNPSMADYEARIFTFGTWIYSVNKEQLARAGFYALGEGDKVKCFHCGGGLTDWKPSEDPWEQHAKWYPGCKYLLEQKGQEYINNIHLTHSLEECLVRTT(SEQ ID NO.:23)。
对于Bir2测定，将3.5纳摩尔浓度的6x组氨酸标记的BIR2结构域(对应于XIAP的氨基酸124-240)与3.6nM的肽AVPIAQKSEK-(ε-生物素)-OH 1:2 TFA在50mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM NaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)存在下混合。45分钟后在37℃温育，添加铕-链霉亲和素(Eu-8044链霉亲和素,PerkinElmer)和别藻蓝蛋白缀合的抗-组氨酸抗体(Columbia Biosciences)至终浓度分别为0.6nM和1nM。在1小时后在室温测量时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)信号。在10个连续稀释的浓度评估测试化合物效力。确定每种浓度的抑制百分比以产生每种测试化合物的IC50值。
对于Bir3测定，将13.3纳摩尔浓度的BIR3结构域(对应于XIAP的氨基酸241-356)与25.2nM的肽AVPIAQKSEK-(ε-生物素)-OH 1:2 TFA在50mM Tris-Cl(pH 7.5)、100mMNaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)存在下混合。45分钟后在37℃温育，添加铕-链霉亲和素和别藻蓝蛋白缀合的抗-组氨酸抗体至终浓度分别为0.6nM和2.5nM。在0.5小时后在室温测量时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)信号。在10个连续稀释的浓度评估测试化合物效力。确定每种浓度的抑制百分比以产生每种测试化合物的IC50值。
cIAP BIR2和BIR3的TR-FRET测定
用生物素衍生肽AVPIAQKSEK得到AVPIAQKSEK-(ε-生物素)-OH 1:2 TFA作为TR-FRET测定的底物。
cIAP蛋白质序列获自SWISS-PROT蛋白质序列数据库，BIR2和BIR3结构域来源于此。用于TR-FRET测定的BIR2结构域的序列是
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASENLYFQGTNPYSYAMSTEEARFLTYHMWPLTFLSPSELARAGFYYIGPGDRVACFAC GGKLSNWEPKDDAMSEHRRHFPNCPFLENS LET
用于TR-FRET测定的BIR3结构域的序列是
MAHHHHHHENLYFQGSSISNLSMQTHAARMRTFMYWPSSVPVQPEQLASAGFYYVGRNDDVKCFCCDGGLRCWESGDDPWVEHAKWFPRCEFLIRMKGQEFVDEIQGRY
对于Bir2测定，将12纳摩尔浓度的6x组氨酸标记的BIR2结构域(对应于cIAP的氨基酸174-256)与19.3nM的肽AVPIAQKSEK-(ε-生物素)-OH 1:2 TFA在50mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM NaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)存在下混合。45分钟后在37℃温育，添加铕-链霉亲和素和别藻蓝蛋白缀合的抗-组氨酸抗体至终浓度分别为0.6nM和4nM，且在室温温育60分钟。在4℃最终过夜温育后测量时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)信号。在10个连续稀释的浓度评估测试化合物效力。确定在每种浓度的抑制百分比以产生每种测试化合物的IC50值。
对于Bir3测定，将25.5纳摩尔浓度的BIR3结构域(对应于cIAP的氨基酸260-352)与41nM的肽AVPIAQKSEK-(ε-生物素)-OH 1:2 TFA在50mM Tris-Cl(pH 7.5)、100mM NaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)存在下混合。45分钟后在37℃温育，添加铕-链霉亲和素和别藻蓝蛋白缀合的抗-组氨酸抗体至终浓度分别为0.6nM和6.4nM，且在室温温育60分钟。在4℃最终过夜温育后测量时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)信号。在10个连续稀释的浓度评估测试化合物效力。确定每种浓度的抑制百分比以产生每种测试化合物的IC50值。
细胞活力测定
SK-OV-3和HCT-116细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC,10801UniversityBoulevard Manassas,VA 20110USA)且保持在补充有10％FBS和2mmol/L L-谷氨酰胺的McCoy's 5A培养基中。所有培养基和补充剂均购自Invitrogen(Life Technologies GmbH,Frankfurter Straβe 129B 64293 Darmstadt Germany)。
按照制造商的方案(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Eschenstr.5 82024Taufkirchen Germany)，通过添加3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑鎓溴化物(MTT)评估细胞活力。对于单一药剂活性，将SK-OV-3细胞以每孔2000个细胞接种于96孔板(BD Biosciences,Tullastrasse 8-12 69126 Heidelberg Germany)中，且24小时后用指定浓度的N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(实施例2)温育。将化合物以等分试样储存为于-20℃的DMSO中的10mM储备溶液。为了组合，将HCT-116细胞以每孔2000个细胞接种于96孔板(BDBiosciences,Tullastrasse 8-12 69126 Heidelberg Germany)中，且24小时后用指定浓度的N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐单独或与DR5-FAP双特异性抗体X AB(DR5结合物:VH SEQ ID NO.:7,VL SEQ ID NO.:8,FAP结合物:VH SEQ ID NO.:15,VL SEQ ID NO.:16)组合温育。温育5天后，用MTT处理细胞1小时，用乙醇提取染料。在570nm处(Tecan Infinite 200 PRO,TecanGroup Ltd.Seestraβe 103 8708Switzerland)测量吸光度，且使用620nm的参考波长。所有测定均一式两份进行，且将数据标准化以使用XLfit软件进行对照和分析。
确定每种浓度的抑制百分比以产生每种测试化合物的IC50值。这些值列在下表中。
附图说明
图1：N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐在SK-OV-3细胞的细胞活力测定中的单一药剂活性。
图2：N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐在HCT-116细胞的细胞活力测定中作为单一药剂和与DR5-FAP双特异性抗体X AB组合(滴定FAP-DR5浓度)的活性。
图3：N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐在HCT-116细胞的细胞活力测定中作为单一药剂和与DR5-FAP双特异性抗体X AB组合(使用固定浓度的FAP-DR 5,1.5μg/ml))的活性。
图4：FAP-DR5双特异性抗体分子设计和作用模式的示意图。
实施例
可以根据已知技术合成本发明的化合物。提供以下实施例和参考文献以帮助理解本发明。然而，这些实施例不旨在限制本发明，本发明的实际范围在所附权利要求中阐述。
实施例1
N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)6-溴-3-甲基-吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯
在0℃，将Boc-酐(1.49g,1.59ml,6.84mmol,Eq:1.09)添加至6-溴-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(1.696g,6.28mmol,Eq:1)(述于WO 2012143726A1)于二氯甲烷(30ml)与DIPEA(933mg,1.26ml,7.22mmol,Eq:1.15)中的溶液中。继续搅拌经过整个周末，同时慢慢温热至室温。添加饱和NaHCO3溶液且用二氯甲烷萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用庚烷/乙酸乙酯(0-50％乙酸乙酯)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到6-溴-3-甲基-吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯(1.725g,74.2％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝357.0
b)6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1,3-二甲酸叔丁酯·甲酯
将(dppf)PdCl2.CH2Cl2(56mg,68.6μmol,Eq:0.01)和(4-氟苄基)氯化锌(II)于THF中的溶液(27.4ml,13.7mmol,Eq:2)添加至6-溴-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯(2.539g,6.86mmol,Eq:1)于无水THF(13.9ml)中的溶液中。将混合物在密封小瓶在90℃搅拌过夜。在添加几滴水之后将粗混合物施加至硅胶上并通过使用庚烷/乙酸乙酯(0-30％乙酸乙酯)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯(1.44g,52.6％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝399.1
c)6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯
将盐酸/二噁烷(8.63g,8.21ml,32.9mmol,Eq:9.12)添加至6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯(1.44g,3.6mmol,Eq:1)于甲醇(10ml)中的溶液中并在50℃搅拌5小时。真空浓缩反应混合物且将残余物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用饱和NaHCO3水溶液淬灭且滤出固体。水相用萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上且通过使用庚烷/乙酸乙酯(0-50％乙酸乙酯)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯(1.05g,97.3％)，其为浅棕色油状物。MS:m/z(M+H)+＝300.14
d)1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯
将6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(403mg,1.35mmol,Eq:1)溶于乙酸乙酯(4.5ml)，添加2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酸(500mg,1.35mmol,Eq:1)(述于WO2012143726A1)、N-甲基吗啉(1.36g,1.48ml,13.5mmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(2.57g,2.4ml,4.04mmol,Eq:3)且在室温搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释且用饱和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥且真空浓缩.将粗品施加于硅胶上且通过使用庚烷/乙酸乙酯(0-50％乙酸乙酯)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯(588mg,66.9％)，其为白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝653.37
e)1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(2.1g,3.22mmol,Eq:1)于乙醇(13ml)和(5.2ml)中搅拌。添加氢氧化锂(231mg,9.65mmol,Eq:3)并在60℃继续搅拌3小时。蒸发溶剂且用1N HCl水溶液将水相酸化至pH7。混合物用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发，得到1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸(2.04g,99.3％)，其为类白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝639.35
f)3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(100mg,157μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(96.4mg,157μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(158mg,172μl,1.57mmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(299mg,280μl,470μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(600μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(120mg,62％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1236.23
g)N-[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(110mg,89μmol,Eq:1)与HCl/二噁烷4M(2ml,8mmol,Eq:89.9)于乙酸乙酯(1.5ml)中在室温搅拌过夜。滤出析出物且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到N-[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(99.4mg,97.5％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1036.52
实施例2
N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-(2-(6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(500mg,783μmol,Eq:1)与2-氨基乙酸甲酯盐酸盐(113mg)、DIPEA(405mg,547μl,900μmol,Eq:1.15)和HATU(387mg,1.02mmol,Eq:1.3)在室温搅拌过夜。将反应混合物倾入0.5M HCl水溶液中且用乙酸乙酯萃取三次，用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-(2-(6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(369mg,520μmol,66.4％)，其为浅黄色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝710.39
b)2-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸
将(2R,5S)-4-(2-(6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(360mg,507μmol,Eq:1)于乙醇(2.5ml)和水(1ml)中搅拌。添加氢氧化锂(36.4mg,1.52mmol,Eq:3)且在60℃继续搅拌3小时。蒸发溶剂且用2N HCl水溶液将水相酸化至pH 5-6。混合物用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发，得到2-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(306mg,440μmol,86.7％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝696.38
c)(2R,5S)-4-[2-[3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(50mg,71.9μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(44.2mg,71.9μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(72.7mg,79μl,719μmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(137mg,128μl,216μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(300μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(48mg,51.6％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1293.65
d)N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯于乙酸乙酯(600μL)中与4M HCl/二噁烷(750μl,3mmol,Eq:92.4)在室温搅拌过夜。将析出物滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(35.5mg,90.9％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1093.54
实施例3
(R,R,R)-N,N'-(乙烷-1,2-二基)双(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺)三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[3-[2-[[1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]乙基氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(75mg,117μmol,Eq:2)与乙烷-1,2-二胺(3.53mg,3.93μl,58.7μmol,Eq:1)、DIPEA(60.7mg,79.9μl,470μmol,Eq:8)和HATU(58.1mg,153μmol,Eq:2.6)于DMF(500μl)中在室温搅拌过夜。混合物用0.5M HCl水溶液淬灭且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[2-[[1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]乙基氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(56mg,73.2％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1301.75
b)6-[(4-氟苯基)甲基]-N-[2-[[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(R,2R,2'R,5S,5'S)-4,4'-((3,3'-((乙烷-1,2-二基双(azanediyl))双(羰基))双(6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3,1-二基))双(2-氧代乙烷-2,1-二基))双(2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯)(49mg,37.6μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(850μl,3.4mmol,Eq:90.3)于乙酸乙酯(750μl)中在室温搅拌过夜。将析出物滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到(R,R,R)-N,N'-(乙烷-1,2-二基)双(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺)三盐酸盐(39.4mg,86.4％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1101.65
实施例4
N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-[(4-甲氧基羰基苯基)氨甲酰基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(300mg,470μmol,Eq:1)与4-氨基苯甲酸甲酯(71mg,470μmol,Eq:1.0)、DIPEA(182mg,246μl,1.41mmol,Eq:3)和HATU(232mg,611μmol,Eq:1.3)在室温搅拌过夜。将反应混合物倾入0.5M HCl水溶液中且用乙酸乙酯萃取三次，用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上且通过使用庚烷/乙酸乙酯(0-100％乙酸乙酯)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-[(4-甲氧基羰基苯基)氨甲酰基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(182mg,50.2％)，其为橙色油状物。MS:m/z(M+H)+＝772.4
b)4-[[1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]苯甲酸
将(2R,5S)-4-(2-(6-(4-氟苄基)-3-((4-(甲氧基羰基)苯基)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(175mg,227μmol,Eq:1)于乙醇(1.2ml)和水(500μl)中搅拌。添加氢氧化锂(16.3mg,680μmol,Eq:3)且在60℃继续搅拌3小时。蒸发溶剂且用1N HCl水溶液将水层酸化至pH 6。混合物用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发，得到4-[[1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]苯甲酸(87mg,50.6％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝758.4
c)(2R,5S)-4-[2-[3-[[4-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]苯基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)苯甲酸(40mg,52.8μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(32.5mg,52.8μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(53.4mg,58μl,528μmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(101mg,94.3μl,158μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(250μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3且混合物用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上且通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)洗脱的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[[4-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]苯基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(26mg,36.3％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1355.7
d)N-[4-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]苯基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
(2R,5S)-4-(2-(3-((4-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)苯基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(22mg,16.2μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(400μl,1.6mmol,Eq:98.6)于乙酸乙酯(1000μl)中在室温搅拌过夜。将析出物滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(12.1mg,59％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1155.6
实施例5
(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(40mg,62.6μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-1-((S)-7-氨基-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(38.8mg,62.6μmol,Eq:1)(述于WO2013/192286A1)、N-甲基吗啉(63.3mg,68.8μl,626μmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(120mg,112μl,188μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(350μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-(2-(3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(44.1mg,56.8％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1240.72
b)(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]-N-[(1R)-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(39mg,31.4μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(700μl,2.8mmol,Eq:89.1)于乙酸乙酯(1ml)中在室温搅拌过夜。将析出物滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐(30mg,83％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1040.62
实施例6
(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(40mg,57.5μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-1-((S)-7-氨基-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(35.6mg,57.5μmol,Eq:1)、N-甲基吗啉(58.1mg,63.2μl,575μmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(110mg,103μl,172μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(350μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(40mg,53.6％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1297.74
b)(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(36mg,27.7μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(650μl,2.6mmol,Eq:93.7)于乙酸乙酯(800μL)中在室温搅拌过夜。将析出的固体滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐(24.5mg,73.2％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1097.63
实施例7
N1-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-N3-(3-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-基)丙基)丙二酰胺三盐酸盐
a)3-(2-氰基乙基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-甲酸叔丁酯
将(dppf)PdCl2.CH2Cl2(22.4mg,27.4μmol,Eq:0.01)和0.5M(4-氟苄基)氯化锌(II)于HF中的溶液(11ml,5.48mmol,Eq:2)添加至6-溴-3-(2-氰基乙基)-3-甲基吲哚啉-1-甲酸叔丁酯(1000mg,2.74mmol,Eq:1)(述于WO2009158011A1)于THF(10ml)中的浅黄色溶液中。将密封管封闭且将深棕色混悬液加热至90℃且搅拌2小时。在添加几滴水后将粗化合物施加于硅胶上且通过使用庚烷/乙酸乙酯(0-30％乙酸乙酯)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到3-(2-氰基乙基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-甲酸叔丁酯(1.003g,92.9％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M-BOC+H)+＝295.2
b)3-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-基]丙腈
在室温将4M HCl/二噁烷(10.6ml,42.6mmol,Eq:16)添加至3-(2-氰基乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-甲酸叔丁酯(1.050g,2.66mmol,Eq:1)于甲醇(10ml)中的浅黄色混悬液中。将该黄色溶液在室温搅拌2小时。蒸发溶剂，将黄色油状物用乙酸乙酯稀释且用饱和NaHCO3水溶液萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发，得到3-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-基]丙腈(763mg,97.4％)，其为橙色油状物。MS:m/z(M+H)+＝295.2
c)(2R,5S)-4-[2-[3-(2-氰基乙基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将3-(6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-基)丙腈(763mg,2.59mmol,Eq:1)溶于乙酸乙酯(10ml)中且添加2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酸(963mg,2.59mmol,Eq:1)、T3P/EtOAc50％(4.95g,4.58ml,7.78mmol,Eq:3)和N-甲基吗啉(2.62g,2.85ml,25.9mmol,Eq:10)且将反应混合物在室温搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释且用饱和NaHCO3洗涤，经Mg2SO4干燥且真空浓缩。将粗残余物施加于硅胶上且通过使用乙酸乙酯/庚烷(50-100％乙酸乙酯)的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-(2-氰基乙基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(983mg,58.5％)，其为白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝648.4
d)(2R,5S)-4-[2-[3-(3-氨基丙基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(2R,5S)-4-(2-(3-(2-氰基乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(850mg,1.31mmol,Eq:1)溶于7N氨/MeOH(15.7g,20ml,140mmol,Eq:107)中且用药匙添加催化量的Raney镍(1.31mmol,Eq:1)。将反应容器脱气且用氢气吹扫(3x)，将反应混合物加热至50℃且在氢气气氛下剧烈搅拌8小时。将反应混合物冷却下来至室温过夜。反应混合物经硅藻土(decalite)过滤，用甲醇洗涤且浓缩。将粗残余物施加于硅胶上且通过使用二氯甲烷/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱(碱性柱)纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-(3-氨基丙基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(436mg,51％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝652.4
e)(2R,5S)-4-[2-[3-[3-[(3-苄基氧基-3-氧代-丙酰基)氨基]丙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(2R,5S)-4-(2-(3-(3-氨基丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(50mg,76.7μmol,Eq:1)、3-(苄基氧基)-3-氧代丙酸(17.2mg,84.4μmol,Eq:1.1)、HATU(32.1mg,84.4μmol,Eq:1.1)和DIPEA(19.8mg,26.8μl,153μmol,Eq:2)溶于DMF(1ml)中且将该浅黄色溶液在室温搅拌过夜。添加乙酸乙酯且用水和盐水萃取混合物。将粗残余物施加于硅胶上且通过使用乙酸乙酯/庚烷(0-100％乙酸乙酯)的柱色谱(碱性硅胶)纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[3-[(3-苄基氧基-3-氧代-丙酰基)氨基]丙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(48mg,75.6％)，其为无色油状物。MS:m/z(M+H)+＝828.5
f)3-[3-[1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-基]丙基氨基]-3-氧代-丙酸
将Pd-C(14.5mg,13.6μmol,Eq:0.25)添加至(2R,5S)-4-(2-(3-(3-(3-(苄基氧基)-3-氧代丙酰胺基)丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(45mg,54.3μmol,Eq:1)于甲醇(0.5ml)中的澄清溶液中且将反应混合物在室温在氢气气氛下搅拌6小时。反应混合物经硅藻土过滤且用甲醇洗涤。蒸发滤液，得到3-[3-[1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-基]丙基氨基]-3-氧代-丙酸(33mg,82.3％)，其为浅黄色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝738.4
g)(2R,5S)-4-[2-[3-[3-[[3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-3-氧代-丙酰基]氨基]丙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将3-((3-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-基)丙基)氨基)-3-氧代丙酸(30mg,40.7μmol,Eq:1)、((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(25mg,40.7μmol,Eq:1；中间体2)、50％T3P/EtOAc(77.6mg,72.6μl,122μmol,Eq:3)和N-甲基吗啉(41.1mg,44.7μl,407μmol,Eq:10)合并且溶于乙酸乙酯(0.3ml)且将该黄色溶液在室温搅拌过夜。蒸发溶剂，将粗残余物施加于硅胶上且通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[3-[[3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-3-氧代-丙酰基]氨基]丙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(13mg,23.9％)，其为黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝1335.7
h)N'-[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]-N-[3-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-基]丙基]丙二酰胺三盐酸盐
将4N HCl/二噁烷(24.6mg,20.5μl,674μmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-(3-(3-(3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙酰胺基)丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(9mg,6.74μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的黄色溶液中且将反应混合物在室温搅拌过夜。将析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到N1-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-N3-(3-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-基)丙基)丙二酰胺三盐酸盐(5.6mg,66.8％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝1135.6
实施例8
(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(140mg,201μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(124mg,201μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(204mg,221μl,2.01mmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(384mg,359μl,604μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(1.1ml)在室温搅拌3小时。添加饱和NaHCO3且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(195mg,74.9％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝1293.7
b)(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(188mg,145μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(3ml)中与4M HCl/二噁烷(3ml,12mmol,Eq:82.6)在室温搅拌过夜。将析出物滤出，用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(161mg,92.1％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1093.5
实施例9
(3R)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(R)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯
手性分离外消旋的6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1,3-二甲酸叔丁酯·甲酯(1.21g,3.03mmol,Eq:1)，得到(R)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯(571mg,47.2％)，其为无色油状物。MS:m/z M+＝399.20
b)(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯
使用(R)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯，以与实施例1c)中相同的方式制备该产物，得到(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯(373mg,95.4％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝300.14
c)(3R)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯
使用(R)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(314mg,1.05mmol,Eq:1)和2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酸(390mg,1.05mmol,Eq:1)作为起始物质，以与实施例1d)中相同的方式制备该产物，得到(3R)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯(505mg,73.7％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝653.37
(R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸
使用(R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(500mg,766μmol,Eq:1)作为起始物质，以与实施例1e)中相同的方式制备该产物，得到(R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(441mg,690μmol,90.1％)，其为类白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝639.36
d)(2R,5S)-4-(2-((R)-6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
使用(R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(430mg,673μmol,Eq:1)作为起始物质，以与实施例2a)中相同的方式制备该产物，得到(2R,5S)-4-(2-((R)-6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(455mg,641μmol,95.2％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝710.4
e)2-[[(3R)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酸
使用(2R,5S)-4-(2-((R)-6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(435mg,613μmol,Eq:1)作为起始物质，以与实施例2b)中相同的方式制备该产物，得到2-[[(3R)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酸(283mg,66.4％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝696.3793
f)(2R,5S)-4-[2-[(3R)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-((R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(140mg,201μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(124mg,201μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(204mg,221μl,2.01mmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(384mg,359μl,604μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(1.1ml)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-(2-((R)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(177mg,68％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝1293.66
g)(3R)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-((R)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(178mg,138μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(3ml)中与4M HCl/二噁烷(3ml,12mmol,Eq:87.2)在室温搅拌过夜。将析出物滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到(3R)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(143mg,86.4％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1093.55
实施例10
(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(S)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯
手性分离外消旋的6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1,3-二甲酸叔丁酯·甲酯(1.21g,3.03mmol,Eq:1)，得到(S)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸1-叔丁酯·3-甲酯(555mg,45.9％)，其为无色油状物。MS:m/z M+＝399.2
b)(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯
使用(S)-1-叔丁酯·3-甲酯6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1,3-二甲酸酯，以与实施例1c)中相同的方式制备该产物，得到(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯(365mg,95.5％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝300.1
c)(3S)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯
使用(S)-甲基6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸叔丁酯(303mg,1.01mmol,Eq:1)，以与实施例1d)中相同的方式制备该产物，得到(3S)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸甲酯(445mg,67.3％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝653.4
d)(3S)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-甲酸
使用(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(440mg,674μmol,Eq:1)，以与实施例1e)中相同的方式制备该产物，得到(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(420mg,97.6％)，其为白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝639.4
e)(2R,5S)-4-(2-((S)-6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
使用(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(410mg,642μmol,Eq:1)，以与实施例2a)中相同的方式制备该产物，得到(2R,5S)-4-(2-((S)-6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(508mg,111％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝710.4
f)2-[[(3S)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酸
使用(2R,5S)-4-(2-((S)-6-(4-氟苄基)-3-((2-甲氧基-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(500mg,704μmol,Eq:1)，以与实施例2b)中相同的方式制备该产物，得到2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(389mg,79.4％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝696.4
g)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将50％T3P/EtOAc(137mg,128μl,216μmol,Eq:3)和N-甲基吗啉(72.7mg,79μl,719μmol,Eq:10)添加至2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(50mg,71.9μmol,Eq:1)和((S)-1-(((S)-1-((S)-7-氨基-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(44.5mg,71.9μmol,Eq:1)(述于WO2013/192286A1)于乙酸乙酯(1ml)中的白色混悬液中。在室温搅拌15分钟后，所有物质均已溶解且将该浅黄色溶液搅拌过夜。添加饱和NaHCO3水溶液且将混合物用乙酸乙酯萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的快速色谱纯化粗残余物，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(64mg,68.6％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1297.7
h)(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(1.2g,1ml,4mmol,Eq:88)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(59mg,45.5μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的浅黄色溶液中且将该溶液在室温搅拌2小时。将白色析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐(48mg,87.5％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1097.6
实施例11
(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3R)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将50％T3P/EtOAc(137mg,128μl,216μmol,Eq:3)和N-甲基吗啉(72.7mg,79μl,719μmol,Eq:10)添加至2-((R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(50mg,71.9μmol,Eq:1)和((S)-1-(((S)-1-((S)-7-氨基-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(44.5mg,71.9μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(1ml)中的白色混悬液中。在室温搅拌15分钟后，所有物质均已溶解且将该浅黄色溶液搅拌过夜。添加饱和NaHCO3水溶液且将混合物用乙酸乙酯萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的快速色谱纯化粗残余物，得到(2R,5S)-4-[2-[(3R)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[[(1R)-四氢萘-1-基]氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(54mg,57.9％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1297.7
b)(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(963μl,3.85mmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((R)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-3-(((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(50mg,38.5μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的浅黄色溶液中且将反应混合物在室温搅拌2小时。将白色析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐(40mg,86％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1097.6
实施例12
(R)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3R)-3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(80mg,125μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(77.1mg,125μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(127mg,138μl,1.25mmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(239mg,224μl,376μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(480μl)中在室温搅拌历经周末。添加饱和NaHCO3溶液且混合物用乙酸乙酯萃取三次。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3R)-3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(96mg,62％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1236.6
b)(3R)-N-[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(1.82ml,7.28mmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((R)-3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(90mg,72.8μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(1ml)中的澄清溶液中且将反应混合物在室温搅拌2小时。将析出物滤出，用乙醚洗涤且干燥，得到(R)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(78mg,93.5％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1036.5
实施例13
(3S)-N-(2,6-二氟苯基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-7-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
N-甲基吗啉(116mg,126μl,1.15mmol,Eq:10)和50％T3P/EtOAc(219mg,205μl,345μmol,Eq:3)添加至2-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(80mg,115μmol,Eq:1)和((S)-1-(((S)-2-((S)-7-氨基-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(72.4mg,115μmol,Eq:1；中间体3)于乙酸乙酯(1.5ml)中的白色混悬液中。在室温搅拌15分钟后，所有物质均已溶解且将该浅黄色溶液搅拌过夜。添加饱和NaHCO3水溶液且将混合物用乙酸乙酯萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的快速色谱纯化粗残余物，得到(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(29mg,19.3％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1307.7
b)(3S)-N-(2,6-二氟苯基)-7-[[2-[[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(25mg,19.1μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(400μl,1.6mmol,Eq:83.7)于乙酸乙酯(600μL)中在室温搅拌过夜。将析出的固体滤出，用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到(3S)-N-(2,6-二氟苯基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐(14mg,60.2％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1107.6
实施例14
N-(2-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐
a)3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]-4-氟-苯甲酸苄酯
将(S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸(500mg,1.02mmol,Eq:1；中间体1)、3-氨基-4-氟苯甲酸苄酯(276mg,1.12mmol,Eq:1.1)和50％T3P/EtOAc(1.3g,1.22ml,2.04mmol,Eq:2)溶于乙酸乙酯(3.5ml)。添加吡啶(1.75ml)且将该黄色溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物倾入乙酸乙酯中且用稀HCl和盐水萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。粗物质通过使用乙酸乙酯/庚烷(0-100％乙酸乙酯)作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酸苄酯(510mg,69.7％)，其为白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝717.33
b)3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]-4-氟-苯甲酸
将Pd-C 10％(65mg,61.1μmol,Eq:0.0973)添加至3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酸苄酯(450mg,628μmol,Eq:1)于甲醇(15ml)中的澄清溶液且将反应混合物在氢气气氛下搅拌过夜。反应混合物经硅藻土过滤且浓缩，得到3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酸(375mg,95.3％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝627.28
c)N-[(1S)-2-[[(1S)-2-[(1S)-1-[[5-[2-(苄基氧基羰基氨基)乙基氨甲酰基]-2-氟-苯基]氨甲酰基]异吲哚啉-2-基]-2-氧代-1-四氢吡喃-4-基-乙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
将3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酸(120mg,191μmol,Eq:1)与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯盐酸盐(44.2mg,191μmol,Eq:1)、DIPEA(99mg,134μl,766μmol,Eq:4)和HATU(94.7mg,249μmol,Eq:1.3)于DMF(1.7ml)中在室温搅拌过夜。添加0.5M HCl且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((2-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(153mg,99.5％)，其为无色油状物。MS:m/z(M+H)+＝803.38
d)N-[(1S)-2-[[(1S)-2-[(1S)-1-[[5-(2-氨基乙基氨甲酰基)-2-氟-苯基]氨甲酰基]异吲哚啉-2-基]-2-氧代-1-四氢吡喃-4-基-乙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((2-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(120mg,149μmol,Eq:1)与10％钯/碳(16mg,15μmol,Eq:0.101)于甲醇(5ml)中在氢气气氛下在室温搅拌过夜。滤出催化剂且蒸发溶剂，得到((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((2-氨基乙基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(90mg,90％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝669.34
e)(2R,5S)-4-[2-[3-[2-[[3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]-4-氟-苯甲酰基]氨基]乙基氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((2-氨基乙基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(85mg,127μmol,Eq:1)与1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(81.2mg,127μmol,Eq:1)在DIPEA(65.7mg,88.8μl,508μmol,Eq:4)和HATU(62.8mg,165μmol,Eq:1.3)存在下于DMF(1ml)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3水溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸钠干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酰胺基)乙基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(31mg,18.9％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1289.68
f)N-[2-[[4-氟-3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]苯甲酰基]氨基]乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酰胺基)乙基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30mg,23.3μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(500μL)中与4MHCl/二噁烷(500μl,2mmol,Eq:86)在室温搅拌历经周末，将析出的固体滤出且用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到N-[2-[[4-氟-3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]苯甲酰基]氨基]乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐(23.16mg,85.7％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1089.58
实施例15
(S)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(80mg,125μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(77.1mg,125μmol,Eq:1；中间体2)、N-甲基吗啉(127mg,138μl,1.25mmol,Eq:10)和T3P/EtOAc 50％(239mg,224μl,376μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(500μl)中在室温搅拌历经周末。添加饱和NaHCO3溶液且混合物用乙酸乙酯萃取三次。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(76mg,49.1％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1236.6
b)(3S)-N-[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺
将4M HCl/二噁烷(1.37ml,5.5mmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(68mg,55μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的浅黄色溶液中且将反应混合物在室温搅拌2小时。将析出物滤出，用乙醚洗涤且干燥。该物质通过制备型HPLC纯化，得到(S)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺(23mg,40.4％)，其为浅黄色无定形物。MS:m/z(M+H)+＝1036.5
实施例16
N-(4-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)N-[(1S)-2-[[(1S)-2-[(1S)-1-[[5-[[4-(苄基氧基羰基氨基)苯基]氨甲酰基]-2-氟-苯基]氨甲酰基]异吲哚啉-2-基]-2-氧代-1-四氢吡喃-4-基-乙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
将3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酸(120mg,191μmol,Eq:1)与(4-氨基苯基)氨基甲酸苄酯(53.4mg,220μmol,Eq:1.15)、N-甲基吗啉(194mg,211μl,1.91mmol,Eq:10)和50％T3P/EtOAc(366mg,342μl,574μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(2.5ml)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3水溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸钠干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((4-(((苄基氧基)羰基)氨基)苯基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(103mg,63.2％)，其为白色固体。MS:m/z(M-H)-＝849.36
b)N-[(1S)-2-[[(1S)-2-[(1S)-1-[[5-[(4-氨基苯基)氨甲酰基]-2-氟-苯基]氨甲酰基]异吲哚啉-2-基]-2-氧代-1-四氢吡喃-4-基-乙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((4-(((苄基氧基)羰基)氨基)苯基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(97mg,114μmol,Eq:1)于甲醇(2.8ml)中与Pd-C 10％(15mg,14.1μmol,Eq:0.124)在氢气气氛下在室温搅拌历经周末。滤出催化剂，蒸发溶剂且在高真空下干燥，得到((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((4-氨基苯基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(82mg,100％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝717.34
c)(2R,5S)-4-[2-[3-[[4-[[3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]-4-氟-苯甲酰基]氨基]苯基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((5-((4-氨基苯基)氨甲酰基)-2-氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(78mg,109μmol,Eq:1)与1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(76.5mg,120μmol,Eq:1.1)、N-甲基吗啉(110mg,120μl,1.09mmol,Eq:10)和50％T3P/EtOAc(104mg,97.2μl,326μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(1.5ml)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸钠干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-(2-(3-((4-(3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酰胺基)苯基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75mg,51.5％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1337.68
d)N-[4-[[4-氟-3-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-1-羰基]氨基]苯甲酰基]氨基]苯基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-((4-(3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)-4-氟苯甲酰胺基)苯基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(65mg,48.6μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(1ml,4mmol,Eq:82.3)于乙酸乙酯(1ml)中在室温搅拌过夜。将形成的固体滤出且用乙醚洗涤。固体在高真空下干燥，得到N-(4-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(56mg,92.4％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1137.58
实施例17
(S)-N-(3-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)N-[(1S)-2-[[(1S)-2-[(1S)-5-[3-(苄基氨基)丙酰基氨基]-1-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-2-基]-2-氧代-1-四氢吡喃-4-基-乙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(100mg,162μmol,Eq:1,中间体2)与3-(((苄基氧基)羰基)氨基)丙酸(36.3mg,162μmol,Eq:1)在50％T3P/EtOAc(258mg,242μl,406μmol,Eq:2.5)和吡啶(300μl)存在下于乙酸乙酯(600μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到((S)-1-(((S)-2-((S)-6-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(118mg,88.5％)，其为浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝821.4
b)N-[(1S)-2-[[(1S)-2-[(1S)-6-(3-氨基丙酰基氨基)-1-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-2-基]-2-氧代-1-四氢吡喃-4-基-乙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-(3-(2-苯基乙酰胺基)丙酰胺基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(180mg,224μmol,Eq:1)与10％钯/碳(23.8mg,22.4μmol,Eq:0.1)于甲醇(8ml)在氢气气氛下在室温搅拌过夜。滤出催化剂且真空蒸发溶剂且在高真空下干燥，得到((S)-1-(((S)-2-((S)-6-(3-氨基丙酰胺基)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(93mg,60.6％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝687.3
c)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[3-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-3-氧代-丙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-6-(3-氨基丙酰胺基)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(87mg,127μmol,Eq:1)与(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(80.9mg,127μmol,Eq:1)、50％T3P/EtOAc(101mg,94.3μl,317μmol,Eq:2.5)于乙酸乙酯(700μl)和吡啶(350μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸钠干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(70mg,42.3％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1307.7
d)(3S)-N-[3-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-3-氧代-丙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((3-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(64mg,48.9μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(1ml)中与4M HCl/二噁烷(1ml,4mmol,Eq:81.7)中在室温搅拌过夜。将析出的固体滤出，用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到(S)-N-(3-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(55.5mg,45.6μmol,93.2％产率)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1107.57
实施例18
(S)-N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-4-氧代丁基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[(4-苄基氧基-4-氧代-丁基)氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-氨基丁酸苄酯(28.3mg,146μmol,Eq:1.1)添加至(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(85mg,133μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.85ml)中的浅黄色混悬液中。添加N-甲基吗啉(135mg,146μl,1.33mmol,Eq:10)和50％T3P/EtOAc(254mg,238μl,399μmol,Eq:3)且将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物倾入乙酸乙酯且用水萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗残余物施加于硅胶上且通过使用乙酸乙酯/庚烷(80-100％乙酸乙酯)作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[(4-苄基氧基-4-氧代-丁基)氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(67mg,61.9％)，其为无色油状物。MS:m/z(M+H)+＝814.46
b)4-[[(3S)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]丁酸
将Pd-C(8.5mg,7.99μmol,Eq:0.1)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((4-(苄基氧基)-4-氧代丁基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(65mg,79.9μmol,Eq:1)于甲醇(0.5ml)中的澄清溶液中且将反应混合物在室温在氢气气氛下搅拌6小时。滤出催化剂，蒸发滤液，得到4-[[(3S)-1-[2-[(2S,5R)-4-叔丁氧基羰基-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-3-羰基]氨基]丁酸(58mg,100％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝724.4
c)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[4-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-4-氧代-丁基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(46.8mg,76μmol,Eq:1；中间体2)、吡啶(300μl)和50％T3P/EtOAc(145mg,136μl,228μmol,Eq:3)添加至4-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)丁酸(55mg,76μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.6ml)中的白色混悬液中且将当时浅黄色溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物用几滴1N HCl水溶液淬灭且用乙酸乙酯和水萃取。有机层经硫酸钠干燥，过滤且蒸发。将粗残余物施加于硅胶上且通过使用二氯甲烷/甲醇(0-20％甲醇)作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[4-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-4-氧代-丁基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(13mg,12.9％)，其为白色无定形物。MS:m/z(M+H)+＝1321.7
d)(3S)-N-[4-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-4-氧代-丁基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(208μl,832μmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((4-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-4-氧代丁基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(11mg,8.32μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.2ml)中的浅黄色溶液中且将反应混合物在室温搅拌2小时。添加乙醚，将白色析出物滤出，用乙醚洗涤且干燥，得到(S)-N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-4-氧代丁基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(9.4mg,91.8％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1121.6
实施例19
(S)-N-(2-(((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-1-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(50mg,71.9μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-2-((S)-5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(44.2mg,71.9μmol,Eq:1；中间体4)和T3P/EtOAc 50％(137mg,128μl,216μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(500μl)和吡啶(250μl)中在室温搅拌过夜。添加饱和NaHCO3溶液且用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-10％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化。分离的产物经受制备型HPLC以进一步纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(1S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]-1-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(7mg,7.5％)，其为无色无定形物。MS:m/z(M+H)+＝1293.8
b)(3S)-N-[2-[[(1S)-1-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-四氢吡喃-4-基-乙酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(135μl,541μmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(7mg,5.41μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(200μl)中的无色溶液中且将反应混合物在室温搅拌过夜。将析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到(S)-N-(2-(((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(3.7mg,56.9％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1093.54
实施例20
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3R)-3-甲氧基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3-甲氧基-丁酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(70mg,101μmol,Eq:1)与((S)-1-(((2S,3R)-1-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-3-甲氧基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(59.3mg,101μmol,Eq:1；中间体5)和T3P/EtOAc 50％(192mg,180μl,302μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(700μl)和吡啶(350μl)中在室温搅拌过夜。反应混合物用1N HCl水溶液、饱和NaHCO3和盐水萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-20％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3-甲氧基-丁酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(100mg,78.4％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1267.6
b)(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S,3R)-3-甲氧基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(1.87ml,7.5mmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((2-(((S)-2-((2S,3R)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3-甲氧基丁酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(95mg,75μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(1ml)中的无色溶液中。将反应混合物在室温搅拌45分钟。将白色析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3R)-3-甲氧基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(76mg,86.2％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1067.5
实施例21
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3S)-3-甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)戊酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(40mg,57.5μmol,Eq:1)与((S)-1-(((2S,3S)-1-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-3-甲基-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(33.8mg,57.5μmol,Eq:1；中间体6)和T3P/EtOAc 50％(110mg,103μl,172μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(0.5ml)和吡啶(250μl)中在室温搅拌过夜。反应混合物用饱和NaHCO3水溶液和盐水萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上且通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-20％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(41mg,56.4％)，其为黄色无定形物。MS:m/z(M+H)+＝1265.7
b)(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S,3S)-3-甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]戊酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(691μl,2.77mmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((2-(((S)-2-((2S,3S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3-甲基戊酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(35mg,27.7μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的浅黄色溶液中且将反应混合物在室温搅拌2小时。将类白色析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3S)-3-甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)戊酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(25mg,77％)，其为类白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1065.55
实施例22
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-((S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(71mg,102μmol,Eq:1)与((S)-1-(((S)-1-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(60mg,102μmol,Eq:1；中间体7)和T3P/EtOAc 50％(195mg,182μl,306μmol,Eq:3)于乙酸乙酯(800μl)和吡啶(400μl)中在室温搅拌过夜。反应混合物用1N HCl水溶液、饱和NaHCO3和盐水萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[(3S)-3-[[2-[[(3S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-[叔丁氧基羰基(甲基)氨基]丙酰基]氨基]-3,3-二甲基-丁酰基]-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(86mg,66.6％).MS:m/z(M+H)+＝1265.7
b)(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]异吲哚啉-5-基]氨基]-2-氧代-乙基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-((S)-3-((2-(((S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-3,3-二甲基丁酰基)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(80mg,63.2μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(1ml,4mmol,Eq:63.3)于乙酸乙酯(1ml)在室温搅拌2小时。将析出的固体滤出，用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐(45mg,60.6％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝1065.55
单体A
N-(2-氨基乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[3-[2-(苄基氧基羰基氨基)乙基氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(300mg,470μmol,Eq:1)与DIPEA(243mg,328μl,1.88mmol,Eq:4)和HATU(232mg,611μmol,Eq:1.3)在室温搅拌过夜。将反应混合物倾入0.5M HCl水溶液中且用乙酸乙酯萃取三次，用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗物质施加于硅胶上并通过使用乙酸乙酯/甲醇(0-5％甲醇)作为洗脱剂的柱色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[3-[2-(苄基氧基羰基氨基)乙基氨甲酰基]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(482mg,100％)，其为浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝815.45
b)(2R,5S)-4-[2-[3-(2-氨基乙基氨甲酰基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(2R,5S)-4-(2-(3-((2-(((苄基氧基)羰基)氨基)乙基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(375mg,460μmol,Eq:1)于甲醇(15ml)中与10％钯/碳(49mg,46μmol,Eq:0.1)在氢气气氛下在室温搅拌过夜。添加五滴乙酸且继续在室温在氢气气氛下搅拌3小时。滤出催化剂且蒸发溶剂。添加碳酸氢钠溶液且混合物用乙酸乙酯萃取三次，经硫酸镁干燥，过滤且蒸发，得到(2R,5S)-4-[2-[3-(2-氨基乙基氨甲酰基)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(281mg,89.7％)，其为浅黄色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝681.42
c)N-(2-氨基乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐
将(2R,5S)-4-(2-(3-((2-氨基乙基)氨甲酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(50mg,73.4μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(1ml,4mmol,Eq:54.5)于乙酸乙酯(1ml)中在室温搅拌过夜。将析出的固体滤出且用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到N-(2-氨基乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐(35.5mg,74％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝581.36
单体B
(S)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酸二盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(1.96ml,7.83mmol,Eq:100)添加至(S)-1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸(50mg,78.3μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的黄色混悬液中且将反应混合物在室温搅拌3小时。将白色析出物滤出，用乙醚洗涤且真空干燥，得到(S)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酸二盐酸盐(30mg,62.7％)，其为橙色固体。MS:m/z(M+H)+＝539.3
单体C
1-(6-(4-氟苄基)-3-(羟基甲基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酮二盐酸盐
a)(2R,5S)-4-[2-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-(羟基甲基)-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0℃将硼氢化钠(85.8mg,2.27mmol,Eq:2)添加至1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酸甲酯(740mg,1.13mmol,Eq:1)于THF(5.86ml)和甲醇(5.86ml)中的澄清溶液中。将反应混合物在0℃搅拌5小时，然后温热至室温且搅拌过夜。添加饱和碳酸钠溶液且混合物用乙酸乙酯萃取。有机层经硫酸镁干燥，过滤且蒸发。将粗残余物施加于硅胶且通过使用乙酸乙酯/庚烷(50-100％乙酸乙酯)作为洗脱剂的快速色谱纯化，得到(2R,5S)-4-[2-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-(羟基甲基)-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-氧代-乙基]-2-甲基-5-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(616mg,87％)，其为白色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝625.4
b)1-[6-[(4-氟苯基)甲基]-3-(羟基甲基)-3-甲基-吲哚啉-1-基]-2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酮二盐酸盐
将4M HCl/二噁烷(2ml,8mmol,Eq:100)添加至(2R,5S)-4-(2-(6-(4-氟苄基)-3-(羟基甲基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-氧代乙基-)-2-甲基-5-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(50mg,80μmol,Eq:1)于乙酸乙酯(0.5ml)中的澄清溶液中且将反应混合物在室温搅拌3小时。将析出物滤出，用乙醚充分洗涤(极易吸湿的)且真空干燥，得到1-(6-(4-氟苄基)-3-(羟基甲基)-3-甲基吲哚啉-1-基)-2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酮二盐酸盐(43mg,89.9％)，其为橙色固体。MS:m/z(M+H)+＝525.3
单体D
4-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)苯甲酸二盐酸盐
将4-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)苯甲酸(28mg,36.9μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(0.75ml,3mmol,Eq:81.2)于乙酸乙酯(0.75ml)中在室温搅拌过夜。将析出的固体滤出，用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到4-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)苯甲酸二盐酸盐(20mg,74.1％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝658.3
单体E
2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸二盐酸盐
将2-(1-(2-((2S,5R)-4-(叔丁氧基羰基)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸(50mg,71.9μmol,Eq:1)与4M HCl/二噁烷(1ml,4mmol,Eq:55.7)于乙醚(1ml)中在室温搅拌过夜。将析出的固体滤出，用乙醚洗涤且在高真空下干燥，得到2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酸二盐酸盐(39mg,81.2％)，其为白色固体。MS:m/z(M+H)+＝596.3
中间体1
(S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸
a)(S)-异吲哚啉-1,2-二甲酸1-苄酯·2-叔丁酯
在25mL圆底烧瓶中，将(1S)-2-叔丁氧基羰基异吲哚啉-1-甲酸(CAS1093651-93-4；220mg,836μmol,Eq:1)和碳酸氢钾(167mg,1.67mmol,Eq:2)与DMF(3ml)合并。添加苄基溴(214mg,149μl,1.25mmol,Eq:1.5)。将反应混合物在室温搅拌2小时，以形成浅棕色混悬液。将反应混合物倾入乙酸乙酯中且用稀盐酸水溶液和盐水萃取。有机层经Na2SO4干燥且真空浓缩.粗物质通过快速色谱(硅胶,12g,0％至40％EtOAc/庚烷)纯化：194mg无色油状物,MS:m/z(M-C6H5CH2OCO)+＝218.1
b)(S)-异吲哚啉-1-甲酸苄酯2,2,2-三氟乙酸盐
在50mL圆底烧瓶中，将(S)-异吲哚啉-1,2-二甲酸1-苄酯·2-叔丁酯(190mg,538μmol,Eq:1)与二氯甲烷(6ml)合并。添加三氟乙酸(3ml)。将混合物在室温搅拌2小时，经此形成浅黄色溶液。真空浓缩反应混合物，得到235mg黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝254.2
c)(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸苄酯
在25mL圆底烧瓶中，将(S)-异吲哚啉-1-甲酸苄酯2,2,2-三氟乙酸盐(230mg,526μmol,Eq:1)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸(150mg,579μmol,Eq:1.1)和DIPEA(340mg,459μl,2.63mmol,Eq:5)与DMF(5ml)合并，然后添加HATU(260mg,684μmol,Eq:1.3)。将混合物在室温搅拌3小时。将反应混合物倾入乙酸乙酯中且用稀HCl和盐水萃取。有机层经Na2SO4干燥且真空浓缩.粗物质通过快速色谱(硅胶,12g,0％至50％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到188mg白色固体。MS:m/z(M-C4H8)+＝439.3
d)(S)-2-((S)-2-氨基-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸苄酯2,2,2-三氟乙酸盐
在50mL圆底烧瓶中，将(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸苄酯(185mg,374μmol,Eq:1)与二氯甲烷(6ml)合并，得到无色溶液。添加三氟乙酸(3ml)。将混合物至少搅拌1小时，然后真空浓缩:283mg无色油状物。MS:m/z(M+H)+＝395.3
e)(S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸苄酯
在25mL圆底烧瓶中，将(S)-2-((S)-2-氨基-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸苄酯2,2,2-三氟乙酸盐(280mg,369μmol,Eq:1.00)和Boc-N-甲基-L-丙氨酸(82.5mg,406μmol,Eq:1.1)与DMF(4ml)合并，得到黄色溶液。添加DIPEA(286mg,387μl,2.21mmol,Eq:6)和HATU(168mg,443μmol,Eq:1.2)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物倾入乙酸乙酯中且用稀HCl、盐水萃取。有机层经Na2SO4干燥且真空浓缩。粗物质通过快速色谱(硅胶,12g,0％至100％乙酸乙酯/庚烷)纯化:166mg白色固体。MS:m/z(M+H)+＝580.4
f)(S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸
在50mL圆底烧瓶中，将(S)-2-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酸苄酯(160mg,276μmol,Eq:1)溶于甲醇(10ml)。氩气鼓泡入反应混合物中5分钟。添加钯/炭(Pd-C 10％,29.4mg,27.6μmol,Eq:0.1)。氢气鼓泡5分钟。将反应混合物在氢气气氛下搅拌2小时。反应混合物经硅藻土(celite)过滤且真空浓缩，得到164mg黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝490.255
中间体2
((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
a)(S)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酸
将(S)-异吲哚啉-1-甲酸盐酸盐(2g,10mmol,Eq:1)添加至浓H2SO4(9.83g,5.34ml,100mmol,Eq:10)中且搅拌混合物得到棕色溶液。将反应混合物冷却至-15℃(冰/NaCl浴)，然后添加65％硝酸水溶液(1.94g,1.39ml,20mmol,Eq:2)。将反应混合物搅拌2小时，同时将其从-15℃慢慢温热至室温，得到浅黄色溶液。LC-MS显示反应完全。将反应混合物倾倒在冰上且在0℃逐滴添加17ml 25％氨水，得到棕色溶液(pH 8)。真空浓缩反应混合物，得到15.5g深灰色固体。MS:m/z(M+H)+＝209.1
b)(S)-2-(叔丁氧基羰基)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酸
向(S)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酸(15.5g,9.9mmol,Eq:1)和碳酸氢钠(3.33g,39.6mmol,Eq:4)于THF(80ml)和水(80ml)中的溶液中添加Boc-酐(4.32g,4.6ml,19.8mmol,Eq:2)。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后添加饱和Na2CO3水溶液且将混合物用EtOAc萃取两次。将2N HCl水溶液逐滴添加至水层(pH 1)且用EtOAc萃取水层。有机层经Na2SO4干燥且真空浓缩，得到2.15g棕色泡沫状物，其未经进一步纯化即用于下一步骤。
c)(S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-硝基异吲哚啉-2-甲酸叔丁酯
向(S)-2-(叔丁氧基羰基)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酸(2.15g,6.97mmol,Eq:1)于EtOAc(10ml)中的经搅拌溶液中依次添加2,6-二氟苯胺(1.08g,846μl,8.37mmol,Eq:1.2)、吡啶(5ml)和50％T3P于EtOAc中的溶液(8.88g,8.3ml,13.9mmol,Eq:2)。将反应混合物在室温搅拌1小时，得到黄色溶液。LC-MS显示反应完全。将反应混合物倾入EtOAc中且依次用1NHCl水溶液和饱和盐水萃取。分离有机层，经Na2SO4干燥且真空浓缩。粗物质通过快速色谱(硅胶,80g,0％至100％EtOAc/庚烷)纯化，得到2.16g浅棕色固体。MS:m/z(M+H-C4H8)+＝364.1
d)(S)-N-(2,6-二氟苯基)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酰胺
向(S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-硝基异吲哚啉-2-甲酸叔丁酯(2.1g,5.01mmol,Eq:1)于CH2Cl2(20ml)中的溶液中添加TFA(14.8g,10ml,130mmol,Eq:26)。将反应混合物在室温搅拌2小时。然后将反应混合物真空浓缩，且将残余物溶于EtOAc且依次用饱和NaHCO3水溶液和饱和盐水萃取。有机层经Na2SO4干燥且真空浓缩，得到1.41g棕色固体，其未经进一步纯化用于下一步骤。MS:m/z(M+H)+＝320.1
e)((S)-2-((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-硝基异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
向(S)-N-(2,6-二氟苯基)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酰胺(1.4g,4.39mmol,Eq:1)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸(1.19g,4.6mmol,Eq:1.05)和DIPEA(1.13g,1.53ml,8.77mmol,Eq:2)于DMF(10ml)中的溶液中添加HATU(2.17g,5.7mmol,Eq:1.3)。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物倾入EtOAc中且依次用0.5NHCl水溶液和饱和盐水萃取。分离有机层，经Na2SO4干燥且真空浓缩。粗物质通过快速色谱(硅胶,80g,庚烷/CH2Cl2/MeOH)纯化，得到2.27g黄色泡沫状物。MS:m/z(M+H)+＝561.2
f)(S)-2-((S)-2-氨基-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-N-(2,6-二氟苯基)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酰胺
向((S)-2-((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-硝基异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.27g,4.05mmol,Eq:1)于CH2Cl2(12ml)中的溶液中添加TFA(9.24g,6.24ml,81mmol,Eq:20)且将反应混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物真空浓缩，且将残余物溶于EtOAc且依次用NaHCO3水溶液和饱和盐水萃取。分离有机层，经Na2SO4干燥且真空浓缩，得到1.68g深黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝461.2
g)((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-硝基异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
向(S)-2-((S)-2-氨基-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-N-(2,6-二氟苯基)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酰胺(1.68g,3.65mmol,Eq:1)、BOC-MEALA-OH(816mg,4.01mmol,Eq:1.1)和DIPEA(1.41g,1.91ml,10.9mmol,Eq:3)于DMF(8ml)中的溶液中添加HATU(1.8g,4.74mmol,Eq:1.3)。将反应混合物在室温搅拌4小时。LC-MS、TLC显示反应完全。将反应混合物倾入EtOAc中且依次用0.5N HCl水溶液和饱和盐水萃取。分离有机层，经Na2SO4干燥且真空浓缩。粗物质通过快速色谱(硅胶,80g,庚烷/CH2Cl2/MeOH)纯化，得到2.0g类白色泡沫状物。MS:m/z(M-H)-＝644.4
h)((S)-1-(((S)-2-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
将((S)-1-(((S)-2-((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-6-硝基异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(2g,3.1mmol,Eq:1)于甲醇(5ml)中的溶液用氩气吹扫10分钟。添加10％Pd-C(330mg,310μmol,Eq:0.1)。将反应混合物用H2吹扫10分钟，然后在H2气球下搅拌1小时。TLC显示反应完全。反应混合物经硅藻土过滤。向滤液中添加9g硅胶且真空浓缩混合物。粗物质通过快速色谱(硅胶,80g,0％至10％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到1.57g白色固体。MS:m/z(M+H)+＝616.3
中间体3
((S)-1-(((S)-2-((S)-7-氨基-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
自代替(S)-异吲哚啉-1-甲酸盐酸盐的(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸起始，以与中间体2类似的方式制备标题化合物。黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝630.3
中间体4
((S)-1-(((S)-2-((S)-5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
a)((2S)-1-(((1S)-2-(5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
自代替(S)-6-硝基异吲哚啉-1-甲酸的5-硝基异吲哚啉-1-甲酸盐酸盐起始，以与中间体2步骤(b)-(h)类似的方式制备标题化合物。棕色固体。MS:m/z(M+H)-＝614.5
b)((S)-1-(((S)-2-((S)-5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
((2S)-1-(((1S)-2-(5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯通过手性HPLC(柱:Reprosil Chiral-NR；洗脱剂:NH4OAc/EtOH/庚烷的梯度)进行分离，得到：
(+)-差向异构体,保留时间＝11min,((S)-1-(((S)-2-((R)-5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯。黄色固体。MS:m/z(M-H)-＝614.5
(-)-差向异构体,保留时间＝21min,((S)-1-(((S)-2-((S)-5-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-2-氧代-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯。类白色固体。MS:m/z(M-H)-＝614.5
中间体5
((S)-1-(((2S,3R)-1-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-3-甲氧基-1-氧代丁-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
使用N-Boc-O-甲基-L-苏氨酸代替(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸，以与中间体2类似的方式制备标题化合物。白色固体。MS:m/z(M+H)+＝590.27
中间体6
((S)-1-(((2S,3S)-1-((S)-6-氨基-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)异吲哚啉-2-基)-3-甲基-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
使用Boc-L-异亮氨酸代替(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸，以与中间体2类似的方式制备标题化合物。浅黄色固体。MS:m/z(M+H)+＝588.3
中间体7
N-[(1S)-2-[[(1S)-1-[(1S)-6-氨基-1-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]异吲哚啉-2-羰基]-2,2-二甲基-丙基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯
使用Boc-L-叔-亮氨酸代替(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酸，以与中间体2类似的方式制备标题化合物。浅黄色油状物。MS:m/z(M+H)+＝588.3。
序列表
&lt;110&gt; 豪夫迈·罗氏有限公司
&lt;120&gt; 二聚化合物
&lt;130&gt; PE04898A
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Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr
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&lt;213&gt; 人工序列
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Gln Gln Gly Thr Thr His Pro Ile Thr
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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&lt;213&gt; 人工序列
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr His Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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&lt;213&gt; 人工序列
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Ser His Ala Met Ser
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&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; FAP (28H1)_CDRH2
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Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
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&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
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&lt;223&gt; FAP (28H1)_CDRH3
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Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
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&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; FAP (28H1)_CDRL1
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
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Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
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&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
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Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
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&lt;213&gt; 人工序列
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&lt;223&gt; FAP (28H1)_VH
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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&lt;211&gt; 108
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; FAP (28H1)_VL
&lt;400&gt; 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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&lt;211&gt; 691
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; DR5(5E11)-FAP (28H1) VHCL
&lt;400&gt; 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
465 470 475 480
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
485 490 495
Phe Ser Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
500 505 510
Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala
515 520 525
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
530 535 540
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
545 550 555 560
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
565 570 575
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
580 585 590
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
595 600 605
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
610 615 620
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
625 630 635 640
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
645 650 655
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
660 665 670
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
675 680 685
Gly Glu Cys
690
&lt;210&gt; 18
&lt;211&gt; 689
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; DR5(5E11)-FAP (28H1) VHCL，除去Fc P329G/LALA突变体中赖氨酸的C-末端
&lt;400&gt; 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
465 470 475 480
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
485 490 495
Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser
515 520 525
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
530 535 540
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
565 570 575
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
580 585 590
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
595 600 605
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
610 615 620
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
625 630 635 640
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
645 650 655
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
660 665 670
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
675 680 685
Cys
&lt;210&gt; 19
&lt;211&gt; 215
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; DR5 (5E11) LC
&lt;400&gt; 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr His Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
&lt;210&gt; 20
&lt;211&gt; 214
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; FAP (28H1) _VLCH1
&lt;400&gt; 20
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210
&lt;210&gt; 21
&lt;211&gt; 10
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 修饰肽
&lt;400&gt; 21
Ala Val Pro Ile Ala Gln Lys Ser Glu Lys
1 5 10
&lt;210&gt; 22
&lt;211&gt; 125
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 用于TR-FRET测定的BIR2结构域
&lt;400&gt; 22
Met Arg His His His His His His Arg Asp His Phe Ala Leu Asp Arg
1 5 10 15
Pro Ser Glu Thr His Ala Asp Tyr Leu Leu Arg Thr Gly Gln Val Val
20 25 30
Asp Ile Ser Asp Thr Ile Tyr Pro Arg Asn Pro Ala Met Tyr Ser Glu
35 40 45
Glu Ala Arg Leu Lys Ser Phe Gln Asn Trp Pro Asp Tyr Ala His Leu
50 55 60
Thr Pro Arg Glu Leu Ala Ser Ala Gly Leu Tyr Tyr Thr Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Gln Val Gln Cys Phe Ala Cys Gly Gly Lys Leu Lys Asn Trp Glu
85 90 95
Pro Gly Asp Arg Ala Trp Ser Glu His Arg Arg His Phe Pro Asn Cys
100 105 110
Phe Phe Val Leu Gly Arg Asn Leu Asn Ile Arg Ser Glu
115 120 125
&lt;210&gt; 23
&lt;211&gt; 125
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 用于TR-FRET测定的BIR3结构域
&lt;400&gt; 23
Met Arg His His His His His His Arg Ser Asp Ala Val Ser Ser Asp
1 5 10 15
Arg Asn Phe Pro Asn Ser Thr Asn Leu Pro Arg Asn Pro Ser Met Ala
20 25 30
Asp Tyr Glu Ala Arg Ile Phe Thr Phe Gly Thr Trp Ile Tyr Ser Val
35 40 45
Asn Lys Glu Gln Leu Ala Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Leu Gly Glu Gly
50 55 60
Asp Lys Val Lys Cys Phe His Cys Gly Gly Gly Leu Thr Asp Trp Lys
65 70 75 80
Pro Ser Glu Asp Pro Trp Glu Gln His Ala Lys Trp Tyr Pro Gly Cys
85 90 95
Lys Tyr Leu Leu Glu Gln Lys Gly Gln Glu Tyr Ile Asn Asn Ile His
100 105 110
Leu Thr His Ser Leu Glu Glu Cys Leu Val Arg Thr Thr
115 120 125

Claims (16)

1.式I化合物
其中
A选自
n＝0或1，
R1选自H、卤素或C1-6-烷基，
R2选自H、卤素或C1-6-烷基，
R3选自H、卤素或C1-6-烷基，
R4选自C1-6-烷基、C1-6-烷氧基-C1-6-烷基或C3-6-杂环烷基，
R5选自H、卤素或C1-6-烷基，
R6选自H、卤素或C1-6-烷基，
L选自
m＝1、2或3，
k＝1、2或3，
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的式I化合物，其中R1为F。
3.权利要求1-2中任一项的式I化合物，其中A为A-1且R2和R3为F且R4选自
4.权利要求1-2中任一项的式I化合物，其中A为A-2且R5为F或其中A为A-4且R6为F。
5.权利要求1-4中任一项的式I化合物，其中L为L-1、L-2或L-3。
6.权利要求1-4中任一项的式I化合物，其中L为L-4或L-6。
7.权利要求1-4中任一项的式I化合物，其中L为L-5且k为3。
8.权利要求1-7中任一项的式I化合物，其选自
N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3R)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-(噁烷-4-基)乙酰基]-1,3-二氢异吲哚-5-基]氨基]-2-氧代乙基-]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-N-[2-[[(3S)-3-[(2,6-二氟苯基)氨甲酰基]-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]-2-(噁烷-4-基)乙酰基]-1,3-二氢异吲哚-5-基]氨基]-2-氧代乙基-]-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3S)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-[(2S)-3,3-二甲基-2-[[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氨基]丁酰基]-7-[[2-[[(3R)-6-[(4-氟苯基)甲基]-3-甲基-1-[2-[(2R,5R)-5-甲基-2-[[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基]哌嗪-1-基]乙酰基]-2H-吲哚-3-羰基]氨基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-N-((R)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(3S)-N-(2,6-二氟苯基)-7-(2-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺基)乙酰胺基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(R)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(R,R,R)-N,N'-(乙烷-1,2-二基)双(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺)三盐酸盐，
(S)-N-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺，
(S)-N-(2-(((S)-1-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3R)-3-甲氧基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((2S,3S)-3-甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)戊酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-3,3-二甲基-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)丁酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(3-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-3-氧代丙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
(S)-N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-4-氧代丁基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
N-(2-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨基)-2-氧代乙基-)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
N-(2-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)乙基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺二盐酸盐，
N-(4-(((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)氨甲酰基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，
N-(4-(4-氟-3-((S)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-1-甲酰胺基)苯甲酰胺基)苯基)-6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-甲酰胺三盐酸盐，和
N1-((S)-3-((2,6-二氟苯基)氨甲酰基)-2-((S)-2-((S)-2-(甲基氨基)丙酰胺基)-2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰基)异吲哚啉-5-基)-N3-(3-(6-(4-氟苄基)-3-甲基-1-(2-((2R,5R)-5-甲基-2-(((R)-3-甲基吗啉代)甲基)哌嗪-1-基)乙酰基)吲哚啉-3-基)丙基)丙二酰胺三盐酸盐。
9.权利要求1-8中任一项的化合物，其用作治疗活性物质。
10.权利要求1-8中任一项的化合物，其用于治疗性和/预防性治疗癌症。
11.式I的二聚化化合物的式I-a的单体
其中
R1选自H、卤素或C1-6-烷基，且
R选自
12.作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其在改善、治疗或控制癌症(特别是实体瘤)的方法中用作与双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)，并且包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点。
13.权利要求1-8中任一项的式I化合物，其与权利要求12的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用。
14.作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用的化合物，其用作与权利要求12的双特异性抗体的组合疗法，其中所述双特异性抗体包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ IDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
15.权利要求1-8中任一项的式I化合物与权利要求12的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合，所述式I化合物作为SMAC蛋白结合凋亡蛋白的抑制物(IAP)的抑制剂，和/或活化的半胱天冬酶蛋白结合IAP的抑制剂起作用，其中所述双特异性抗体包含至少一个对DR5具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP具有特异性的抗原结合位点，其包含含有SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
16.如上所述的发明。
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