CN109069607A

CN109069607A - 用于疟疾疫苗中的新型抗原

Info

Publication number: CN109069607A
Application number: CN201780012190.0A
Authority: CN
Inventors: 若昂·卡洛斯·阿吉亚尔
Original assignee: Camrius International
Current assignee: Camrius International
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2018-12-21
Also published as: BR112018016912A2; AU2017219613B2; ZA201805547B; JP7261013B2; US20190117752A1; EP3416681A4; WO2017142843A8; US20170232091A1; JP2022037078A; KR20180108754A; JP2019505560A; EP3416681A1; CA3014196A1; AU2017219613A1; US11793868B2; US10195260B2; WO2017142843A1

Abstract

本发明提供了可用作在疟疾寄生虫的红细胞前期阶段表达的抗原的多肽。所述抗原可通过在疫苗制剂中施用抗原或在DNA或作为疫苗制剂递送的其它重组蛋白表达体系中表达抗原而用于诱导哺乳动物中针对疟疾的免疫应答和无菌保护。

Description

用于疟疾疫苗中的新型抗原

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年2月17日提交的美国临时专利申请序列号62/296,464的优先权，所述专利申请全文以引用方式并入本文。

背景技术

尽管经过多年的努力，但仍然没有获得许可的疟疾疫苗。开发疟疾疫苗面临的障碍之一是许多疟疾疫苗抗原的广泛异质性。在人体中评估的潜在疫苗抗原迄今为止尚未引发保护性免疫应答。

疟疾每年造成约863,000人死亡。尽管存在各种抗疟疾药物，但在疟疾流行的世界相对贫困的地区，这些药物的成本可能过高。最常用药物的广泛使用也导致耐药寄生虫的扩张，从而使得这些药物中的许多无效。在缺乏廉价、高效药物的情况下，疫苗接种代表了补充传统疟疾干预措施的最成本有效的方式。

成功的疟疾疫苗将需要保护人们免受大量抗原性多样的疟疾寄生虫的侵害。基于单一抗原的单一分离物的疫苗可能不能引发足够广的免疫应答以保护个体免受这种异质群体的侵害。潜在地增强基于抗原的疫苗或任何其它亚单位疟疾疫苗的功效的一种方式是将附加的疟疾抗原结合到疫苗中，从而扩展疫苗引发的免疫应答。

疟疾疫苗开发工作几乎专注于少数充分表征的恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)抗原。尽管跨越半个多世纪，不同大陆上的许多研究人员努力工作，但成功的疟疾疫苗仍然难寻。恶性疟原虫基因组的测序已经揭示出多于五千个基因，但尚未指示这五千个基因中的哪一个将是有用的，或者如何鉴定潜在的疫苗目标。

疟疾由属于疟原虫属的蚊传播血蜱寄生虫引起。四种原生疟原虫物种(恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫)是造成人疾病的原因。其它造成动物的疾病，例如约氏疟原虫和伯氏疟原虫。恶性疟原虫占人类感染和死亡的大多数。疟疾寄生虫具有由四个独立阶段组成的生命周期，这些阶段中的每一个都能够诱导针对寄生虫的特异性免疫应答和相应发生的阶段特异性抗原，然而天然诱导的疟疾不能防止再感染。

疟疾寄生虫通过多个雌性按蚊物种传播给哺乳动物。受感染的蚊子在吸血期间将子孢子形式的疟疾寄生虫沉积到哺乳动物皮肤中，这随后侵入血流中。在侵入肝细胞之前，子孢子在循环中保留数分钟。在该阶段，寄生虫位于细胞外环境中并暴露于抗体攻击，所述抗体主要针对环子孢子(CS)蛋白、子孢子表面的主要成分。一旦子孢子侵入肝细胞，寄生虫就分化、复制并发育成裂殖体。在该阶段，入侵的寄生虫将进行无性繁殖，每个受感染的肝细胞产生多达20,000个子代裂殖子。在寄生虫的这种细胞内阶段期间，宿主免疫应答包括T淋巴细胞，尤其是CD8⁺T淋巴细胞。在肝脏感染10-14天后，数千个新形成的裂殖子被释放到血流中并侵入红细胞(RBC)，其成为抗体介导的免疫应答和T细胞分泌细胞因子的靶。在侵入红细胞后，裂殖子经历多个复制阶段，转化成滋养体和裂殖体，其破裂以产生新一代裂殖子，其随后感染新的RBC。寄生虫的这个阶段(红细胞)刺激强烈的体液反应，所述体液反应可阻止裂殖子侵入RBC并且通常赋予针对与该阶段相关的病理学的防护。红细胞阶段与明显的临床疾病相关。较少数量的滋养体可能发育成雄性或雌性配子体，这是寄生虫的性阶段。当易感的蚊子摄取配子体时，这些配子受精导致合子形成和随后转变成动合子，然后进入卵囊，并且最后成为孢子，所述孢子迁移到唾液腺以完成周期。

寄生虫进入体内时发生的病原体特异性免疫应答的两个主要部分是细胞和体液。一个部分，细胞反应，涉及参与免疫反应的CD8⁺和CD4⁺T细胞。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能够特异性杀死在其表面上表达病原性抗原的感染细胞。CD4⁺T细胞或T辅助细胞支持CTL的发育，产生各种细胞因子，并且还有助于诱导B细胞分裂并产生特异于抗原的抗体。在体液应答期间，特异于特定抗原的B细胞被激活、复制、分化并产生抗原特异性抗体。

免疫应答的两个部分均与防止疟疾感染有关。当传染性子孢子运行到肝脏并进入肝细胞时，子孢子成为细胞内病原体，在感染细胞外几乎不花费时间。在该阶段，CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞是尤其重要的，因为这些T细胞及其细胞因子产物，诸如干扰素-γ(IFN-γ)，有助于杀死受感染的宿主肝细胞。发现消除鼠疟疾模型中的细胞内肝寄生虫取决于针对由肝阶段寄生虫表达的肽的CD8⁺T细胞应答。CD8⁺T细胞的消耗消除了针对子孢子攻击的保护，并且CD8⁺T细胞到幼稚动物的过继转移赋予保护。

当疟疾感染达到其中裂殖子在RBC中复制的红细胞阶段时，还发现裂殖子在血流中自由循环一段短暂时间直至其侵入新的红细胞。因为红细胞不表达与T细胞的同源相互作用所需的I类或II类MHC分子，所以认为针对寄生虫的抗体应答在寄生虫生命周期的血液阶段最相关。总之，如果其可诱导强烈的细胞免疫应答以及强烈的体液免疫应答以处理寄生虫在人体中出现的不同阶段，则可能的疟疾疫苗方法将是最有利的。

如上所述，可以根据寄生虫的不同发育阶段对疟疾疫苗开发的当前方法进行分类。可区分三种类型的可能的疫苗。第一种是红细胞前期疫苗，其针对子孢子和/或裂殖体感染的肝细胞。从历史上看，这种方法由基于(CSP)的策略主导。因为感染的红细胞前期阶段是无症状的，所以红细胞前期疫苗的目标将是赋予由体液和细胞免疫应答介导的无菌免疫，从而防止潜在的疟疾感染。该目标尚未由任何已知的治疗实现。

疫苗方法的第二种类型是无性血液阶段疫苗，其针对受感染的RBC或裂殖子本身，被设计成最小化临床严重度或在抗体预防裂殖子侵入红细胞时预防感染。到目前为止，创建此类疫苗的尝试还不能充分降低发病率和死亡率或防止寄生虫进入和/或在红细胞中发育。阻断传播的疫苗被设计成阻碍蚊子寄主中的寄生虫发育。到目前为止，创建此类疫苗的尝试还不能降低全民疟疾感染率。

疫苗方法的最终类型是组合疟疾疫苗，其靶向寄生虫生命周期的多个阶段。该方法试图开发多组分和/或多阶段疫苗。到目前为止，创建此类疫苗的尝试还不能获得足够的防护。由于这些失败，目前没有可商购获得的抗疟疾疫苗。

已经发现用辐照致弱子孢子(RAS)的啮齿动物、非人灵长类动物和人类的免疫可赋予针对随后被活子孢子攻击的防护。然而，用于生产辐射子孢子的费用和缺乏可行的大规模培养系统、相对短期功效、缺乏交叉菌株保护以及需要静脉内递送已成为开发此类疫苗的障碍。

CS蛋白是被证明在用作针对蚊媒感染的人体内主动免疫的基础时，预防疟疾感染的唯一恶性疟原虫抗原。然而，该抗原的预防水平不足够高以支持可行性治疗。在理论上，疫苗保护水平应当高于85％以便成为可行性治疗。在保护水平低于该值时，更具毒性的突变体会在流行区域逃出。已证实基于CS抗原的疫苗的效率仅为约50％，并且保护作用持续不超过一年。然而，这仍然是本公开之前最为人们所熟知的抗原应答。

已经对恶性疟原虫的整个基因组序列进行了测序。参见Bowman等人，Nature，400:532-538(1999)；Gardner等人，Nature，419:498-511(2002)。还已经对另一种人疟疾寄生虫(间日疟原虫)进行了测序。参见Carlton等人，Nature，455:757-763(2008)。还已经对啮齿动物疟疾寄生虫(伯氏疟原虫)进行了测序。参见Carlton等人，Nature，419:512-519(2002)。然而，尽管如此，有效的抗疟疾疫苗的开发受到不能鉴定有前景的抗原的严重阻碍。对恶性疟原虫、间日疟原虫和约氏疟原虫基因组的测序分别导致鉴定5369、5433和5675个基因。然而，仅了解这些序列将不可能产生新的疫苗构建体。因此，仅0.2％的恶性疟原虫蛋白质组正在进行临床试验，这些试验还不能在志愿者中诱导高预防等级。

发明内容

本发明提供了可用作抗原的多肽，其在疟疾寄生虫的红细胞前期阶段和红细胞阶段均表达。抗原可通过在疫苗制剂中施用抗原或在DNA或作为疫苗制剂递送的其它核酸表达体系中表达抗原而用于诱导哺乳动物中针对疟疾的细胞和体液免疫应答。在优选的实施方案中，哺乳动物是人。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于防止哺乳动物免受疟疾感染的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体中的SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.6或它们的衍生物的一种或多种重组多肽，。一般来讲，衍生物具有参考序列的至少10个连续氨基酸和/或与参考序列具有至少85％同一性。所述免疫原性组合物可以由分离的或重组的多肽或表达重组抗原的载体病毒形成，并且可与可接受的佐剂配对。

作为本公开的主题的抗原在不同的环境中由不同的命名法标记，如本领域中的标准那样。为方便起见，下表通过其序列，以及现有技术和本文公开内容中使用的各种名称和缩写来标记每种抗原：

本发明可包含在药学上可接受的载体中的两种或更多种重组多肽的组合，其中一种多肽是SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、或它们的衍生物，并且其它多肽是PyCSP、Pyfalstatin、Py UIS3、PY03396、PY05693、PY03424和PY03011的恶性疟原虫或间日疟原虫直系同源物中任一种。

本发明还包括通过施用免疫有效量的组合物在哺乳动物中诱导针对疟疾的免疫应答的方法，所述组合物包含由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6或其衍生物编码的一种或多种多肽。替代地，所述方法可包括施用一种或多种针对疟疾的引发或加强免疫，其中所述引发和加强免疫包含免疫有效量的如本发明所述的重组多肽。施用多肽的方法可包括使用合适的表达载体，诸如质粒、复制病毒载体或非复制病毒载体。合适的表达载体可以为DNA质粒、杆状病毒、rVSV、SpyVLPs、甲病毒复制子、腺病毒、痘病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、黄热病病毒、逆转录病毒、RNA复制子、DNA复制子、甲病毒复制子颗粒、委内瑞拉马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒或辛德毕斯病毒。

可用作本文所公开的抗原的多肽是第一疟原虫红细胞前期抗原，其可以无菌保护100％的受试者免受感染性约氏疟原虫子孢子攻击。这些反应作为其人类直系同源物的代表在小鼠中方便地测量。已经在小鼠和人类中广泛研究了疟疾感染、治疗和免疫，并且认为小鼠模型是人类和其它哺乳动物受试者中疟疾疫苗功效的标准指标。本文所公开的单独的PY06306抗原保护71％至100％的CD1小鼠免受疟疾感染，并且此外诱导能够延缓剩余未受保护小鼠的血液中寄生虫发作的免疫应答。总之，83％(384/461)的PY06306免疫小鼠免受疟疾感染。这种保护被报告用于分别使用严格的300和100-子孢子攻击的远交(CD1)和近交(BABB/c)小鼠品系，以及作为无菌保护的功效评估。考虑本文所公开的鼠、灵长类动物和人疟疾免疫应答之间的关系以及疫苗功效的标准指标，本文所公开的抗原功效提出用于在哺乳动物中诱导针对疟疾的免疫应答的多肽。

附图说明

图1显示了矩阵实验的保护结果，其中每组14只CD1远交小鼠在引发-加强方案中用DNA和表达PY03396、PY05693、PY06306、PY00232和PyCelTOS的人腺病毒5型(Ad5)载体的组合免疫。阳性对照小鼠用DNA和表达PyCSP的Ad5载体免疫。阴性对照小鼠用4倍相对量的DNA和不表达约氏疟原虫抗原的Ad5载体免疫以及为幼稚小鼠。灰色和黑色条分别表示具有和不具有PyCSP的抗原组合组。阴影和方格条分别表示PyCSP和幼稚组。用300个约氏疟原虫子孢子攻击小鼠，并通过在攻击后14天检查经Giemsa染色血涂片来评估寄生虫血症。底部的数字表示每组中每总攻击小鼠的无菌保护小鼠数。

图2示出了评估PY06306和图1中所示的其它抗原的实验的矩阵去卷积。每组14只CD1远交小鼠在包含表达PY03396、PY05693、PY06306、PY03424和PY03011的腺病毒5型(Ad5)载体和DNA的引发-加强方案中免疫。阳性对照小鼠用表达PyCSP的Ad5载体和DNA免疫。阴性对照小鼠用4倍相对量的不表达约氏疟原虫抗原的Ad5载体和DNA免疫。灰色和黑色条分别指示具有和不具有PyCSP的抗原组合组。阴影和方格条分别表示PyCSP和零免疫小鼠。用300个约氏疟原虫子孢子攻击小鼠并通过在攻击后17天检查经Giemsa染色血涂片来评估寄生虫血症。底部的数字表示每组中每总攻击小鼠的无菌保护小鼠数。

图3示出Kaplan-Meier曲线，其描绘了对于攻击后寄生虫血症的时间，受保护小鼠的百分比。从矩阵去卷积实验2中提取并分析数据。实心圆指示仅用PY06306抗原进行免疫的CD1小鼠，符号X、正方形和三角形分别指示PyCSP、4倍零免疫小鼠和幼稚小鼠。用300个约氏疟原虫子孢子攻击小鼠，并通过在攻击后至多14天(PyCSP，4倍零和幼稚)或17天(PY06306)检查经Giemsa染色血涂片来评估寄生虫血症。

图4示出了矩阵去卷积实验的抗体反应。对于约氏疟原虫子孢子和血液阶段寄生虫测量终点免疫荧光测定(IFA)滴度。在合并每组抗原组合的腺病毒5加强之后一周收集血清，并测定对空气干燥的寄生虫的反应性。黑色和灰色条分别指示子孢子和血液阶段的反应性。阳性对照抗体分别为NYS1和NYLS3单克隆抗体。来自4倍零免疫和幼稚动物的血清是阴性的。

图5示出了对于如图4所示矩阵去卷积实验，受保护和未受保护小鼠的抗体滴度。对于小鼠的六个含PY06306(E140)组的独立小鼠，测量针对约氏疟原虫子孢子的终点免疫荧光(IFA)滴度。一个组来自矩阵实验2(Mx2)；E140、E137、E057组合(实心圆)，并且五个组来自矩阵反卷积实验2(MDx2)；E140、E137、E057组合(实心方块)，仅E140(实心菱形)，E140、E137组合(实心星形)，E140、E057组合(实心三角形)，以及E140、E137、E057、PY3424组合(实心星号)。所有受保护小鼠均由实心符号显示，并且所有不受保护小鼠均由X符号显示。Mann-Whitney非参数检验指示统计学显著性；**，p<0.005和***，p＝0.001。

图6示出了对于图2中所示的去卷积研究，在11周时持续保护。无菌保护的小鼠休息11周，然后用200个约氏疟原虫子孢子攻击。通过在攻击后17天检查经Giemsa染色血涂片来测量保护作用。

图7示出了疟原虫属中的PY06306(Py E140)抗原同源性，所述疟原虫属包括Pf(人恶性疟原虫)、Pv(人间日疟原虫)、Pc(啮齿动物夏氏疟原虫)、Py(啮齿动物约氏疟原虫)、Pb(啮齿动物伯氏疟原虫)、Pk(灵长类动物诺氏疟原虫)、Pr(灵长类动物诺蒂尼疟原虫(P.rhodiani))、Pg(灵长类动物加蓬疟原虫(P.gaboni))。

图8示出了各种Pf寄生虫菌株中的PY06306(Pf E140)(PFA0205w或MAL1P1.31或PF3D7_0104100)氨基酸保守性。这些寄生虫从不同大陆的各个国家收集。突出显示了最高(99％)和最低(92％)同源性。

图9示出了小鼠中体内T细胞耗竭实验的结果。用PY06306DNA使CD1远交小鼠免疫，并用腺病毒5疫苗进行加强，在用300个约氏疟原虫子孢子攻击之前和之后，CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺T细胞耗竭(黑色条)。将大鼠Ig和无耗竭组用作阳性对照。使零免疫小鼠的组(灰色条)也以相同方式耗竭并用作阴性对照。PyCSP(斜纹条)和幼稚小鼠(条纹条)是实验阳性和阴性对照。箭头指示耗竭的类型和免疫数中无菌保护的小鼠数量。通过在攻击后至多19天检查经Giemsa染色血涂片来评估受攻击小鼠的寄生虫血症。

图10A和10B示出了CD1和BALB/c小鼠中的血清转移研究。在图10A中，用编码PY06306(黑色实线)和PyCSP(灰色实线)的DNA/腺病毒5对14只BALB/c小鼠的组进行免疫。收集来自经免疫且未受攻击小鼠的血清，并在攻击前24小时和6小时转移至幼稚受体小鼠；PY06306(黑色虚线)和PyCSP(灰色虚线)。用300个约氏疟原虫子孢子攻击后，监测小鼠的寄生虫血症并持续17天。在图10B中，用编码PY06306(黑色实线)和PyCSP(灰色实线)的DNA/腺病毒5对14只CD1小鼠的组进行免疫。收集来自经免疫和未受攻击小鼠的血清，并在攻击前24小时和6小时转移至幼稚受体小鼠；PY06306(黑色虚线)和PyCSP(灰色虚线)。用100个约氏疟原虫子孢子攻击后，监测小鼠的寄生虫血症并持续17天。每个组的无菌保护小鼠的百分比示于备注框中。

图11示出了针对血液阶段攻击的PY06306保护。每组14只CD1小鼠用一定剂量的DNA进行免疫，并用表达PY06306(黑色条)、PY06306+PyFalstatin(灰色条)和仅PyFalstatin的腺病毒5来加强免疫。零免疫和幼稚小鼠用作小鼠的阴性对照组。PyFalstating也被称为PY03424。用10,000个感染的约氏疟原虫感染的红细胞攻击所有小鼠，并通过经Giemsa染色的薄涂片监测在攻击后17天的寄生虫血症。

图12以图表形式示出了用哺乳动物密码子优化的腺病毒5的保护作用，其比较了天然(na)和经密码子优化的(co)PY06306，并示出了免疫途径。用co E140DNA引发CD1小鼠(每组14只)，并用天然PY06306腺病毒5(黑色条)或哺乳动物co PY06306腺病毒5(灰色条)加强免疫。两种腺病毒5构建体以10^10、10^9、10^8和10^7PU的递减剂量肌肉内(IM)给药。由皮下(SC)或静脉内(IV)给药的Ad5对小鼠的两个附加组加强免疫。小鼠的两个附加组未用DNA疫苗引发，而是在攻击前两周用单一IM剂量的na或coPY06306Ad5免疫。零免疫(条纹条)和幼稚(方格条)小鼠为阴性对照。所有小鼠用300个约氏疟原虫子孢子攻击，由经Giemsa染色的薄血涂片监测寄生虫血症18天。

图13示出了Pf E140(PFA0205w或MAL1P1.31或PF3D7_0104100)在小鼠中具有免疫原性。IFA滴度由PFA0205w疫苗诱导。用PFA0205w(PfE140)疫苗试剂对CD1和BALB/c小鼠进行免疫：VR1020-DV质粒中的DNA疫苗，腺病毒5和由小麦胚芽系统表达的全长重组蛋白如GST和6xHis融合体。将重组蛋白在Montanide ISA 720佐剂中乳化，并以5μg/剂量免疫SC。针对恶性疟原虫子孢子和几个血液阶段的混合物测量免疫荧光(IFA)滴度。

图14示出了恶性疟原虫E 140(PFA0205w)在人类中天然具有免疫原性。T细胞通过经恶性疟原虫辐照致弱子孢子(RAS)免疫的人类受试者响应于PFA0205w(PfE140或PF3D7_0104100)。PBMC用重叠的15聚体肽PFA0205w库A利用布雷菲德菌素A刺激并持续21小时并染色，以获得活力、表型(CD14、CD19、CD3、CD4和CD8)和细胞内功能标记(包括IFN-γ和CD154)。显示了产生IFN-γ和细胞内CD154的CD4⁺T细胞(A)和产生IFN-γ的CD8⁺T细胞(B)的背景扣除频率。两个实验中PFA0205w库A(实心符号)的阳性反应被鉴定为超过与阴性对照(经DMSO刺激的)样品平均值的两个标准偏差的那些。

图15示出了PVX_081555(PvE140)在间日疟原虫子孢子中相对丰富。使用多维蛋白质鉴定技术(MudPIT)进行测序的256个间日疟原虫子孢子蛋白质基于由其定量值定义的相对丰度来绘图。间日疟原虫环子孢子蛋白和间日疟原虫E140(PVX_081555)的位置在图中用黑色箭头表示。

具体实施方式

发明人已经确定，红细胞前期蛋白质在赋予针对疟疾的保护性免疫方面是至关重要的。尽管已经鉴定出相对大量的疟疾基因，但在疟疾寄生虫基因组的测序之后，疫苗候选物的鉴定在很大程度上受到疟疾寄生虫相对复杂的生命周期的阻碍。此外，疟疾寄生虫的许多基因在抗原性和功能上都很难定义。

针对该背景，发明人决定对由许多基因编码的抗原进行高通量筛选，以便确定潜在的保护性应答。发明人开发了一种用于鉴定和测试潜在疟疾抗原的新策略，所述策略克服了现有技术中遇到的困难。这种新方法包括鉴定发明人确定的某些特征将作为潜在的人疫苗候选物的指示。然后，发明人编制了据信具有这些特征的146个约氏疟原虫直系同源基因的列表。然后，发明人设计了克隆引物，并设想了克隆基因和通过转染ELISpot进行筛选的策略。转染ELISpot涉及用VR1020疫苗构建体转染A20细胞系，表达抗原，并使用这些经转染的细胞在ELISpot试验中呈递抗原。ELISpot的这种应用是筛选抗原的新策略。优先考虑的抗原从大量恶性疟原虫蛋白中鉴定。优先考虑的抗原基于被发明人判断与针对疟疾的保护相关的多种标准来评估。一种此类标准是选择在疟疾寄生虫的子孢子和肝脏阶段中表达的抗原；即红细胞前期抗原。基于该标准选择的那些抗原中的某些抗原在小鼠中示出出了保护性应答，这指示人类中那些基因的直系同源物将编码可用作潜在疫苗制剂的人抗原。作为本公开主题的一种基因(具体地为PY06306，下文被命名为PY17X 0210400)令人惊讶地示出显著且一致的保护性应答，从而指示该基因编码抗原，其直系同源物可用作主要的疫苗制剂。

然而，文献记载的PY06306基因的序列仅是部分的(479个氨基酸)并且源自早期基因组注释。为了用全长抗原(816aa)进行本文所公开的保护实验，发明人需要重新克隆该基因。类似的情况在恶性疟原虫(人同源物)的情况下也发生，其也需要由本领域已知的方法重新克隆。本文提供的列表中公开的、用于所有实施例中并反映在所有数据实施例中的序列，符合发明人的基因校正版本，而不是本领域先前认为是相关序列的序列。

本发明涉及编码重组恶性疟原虫和间日疟原虫蛋白的DNA和氨基酸序列。具体地讲，本发明涉及用于疟疾疫苗中的高度保护性红细胞前期约氏疟原虫及其恶性疟原虫和间日疟原虫直系同源物抗原。相关序列可用于表达编码的蛋白质以用作亚单位免疫原性抗原，或可结合到适于在宿主体内表达的载体中以诱导免疫原性应答。抗原可以组合地或单独地用于免疫原性制剂中。

在一个实施方案中，免疫原性组合物是基于DNA的疫苗。发现DNA是递送本公开的免疫原性组合物的可行的平台。基于DNA的疫苗可由重组病毒递送，例如修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)减毒痘病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或GC46(大猩猩腺病毒)病毒。还可以使用如同这些病毒的其它人腺病毒替代物，诸如杆状病毒。

在另一个实施方案中，组合物包含免疫原性蛋白质。在该实施方案中，可通过首先将编码蛋白质的DNA插入合适的表达系统中来产生蛋白质。这些包括，例如，基于腺病毒的系统、基于痘病毒的系统或DNA质粒系统。然后可将经表达且纯化的蛋白质以一个或多个剂量施用于哺乳动物，诸如人。在该实施方案中，经纯化的蛋白质可单独地表达，或者编码特定蛋白质的DNA可重组缔合以形成单一免疫原性组合物。这些免疫原性组合物然后可以以一个或多个剂量施用以诱导免疫原性应答。

本发明的一个实施方案涉及通过异源表达系统以全长或片段形式表达的重组多肽。此类系统的示例为：大肠杆菌、酵母(酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)、哺乳动物细胞(HEK293或CHO细胞)、杆状病毒感染的昆虫细胞和果蝇S2稳定细胞。可将重组蛋白掺入免疫原性制剂中以便诱导免疫应答。在该实施方案中，多肽可以单独地或组合掺入。本发明的免疫原性组合物还可包括佐剂以改善或增强由多肽引发的免疫应答。合适的佐剂包括ALFQ，其是包含单磷酰脂质A的脂质体组合物与皂苷的无毒制剂。

传统上，佐剂根据其组分来源，生理化学特性或作用机制大致分为两个主要类型，即：(i)免疫刺激剂，诸如TLR配体、细胞因子、皂苷和细菌外毒素，其直接作用于免疫系统以增加对抗原的应答，和(ii)载体，诸如矿物盐、乳液、脂质体、病毒体和可生物降解的聚合物微球，其以最佳方式向免疫系统呈递疫苗抗原并共同施用免疫刺激剂。近年来，变得明显的是这些载体中的许多也对免疫系统有直接作用，并且可被认为是免疫刺激剂。

疟疾疫苗包含的可接受的佐剂的示例包括陆军脂质体制剂(ALF)衍生物，诸如ALF、ALFA(加上铝)和ALFQ(加上QS21)。其它选择包括脂质体制剂中的脂质A衍生物和皂苷，诸如QS21和3D-单磷酰脂质A(脂多糖的无毒衍生物)、在结构上类似于LPS、MPL或3D-MPL的其它免疫刺激剂、酰化单糖、皂苷衍生物(Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01)、可溶性三萜糖苷、Toll样受体4(TLR4)激动剂、montanides(ISA51、ISA720)、免疫刺激性寡核苷酸和咪唑喹啉。佐剂可在含胆固醇的脂质体载体中制备。

如本文所用，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，并且不指特定长度的产品。蛋白质包括在多肽的定义内。与数字结合的术语“聚体”，诸如15-聚体，是指以氨基酸数量计的多肽的长度。

如本文所用，通过首先通过分子方法，由质粒或其它表达系统诸如病毒系统，表达合适的基因片段，然后分离，可制备蛋白质，用于将有效量的一种或多种本文所述的多肽包含在免疫原性组合物中。本发明的另一方面是蛋白质诱导体液和/或T细胞免疫应答的能力。

本发明的一个实施方案是在载体表达系统中掺入编码多肽的DNA，其中所述系统允许一种或多种多肽在哺乳动物宿主细胞(诸如人)中表达以诱导免疫应答。表达系统可以为DNA质粒或病毒系统。制备和施用表达疟原虫蛋白的DNA疫苗的方法是本领域公知的。

在另一个实施方案中，蛋白质的衍生物可用于免疫原性组合物中。在该实施方案的变体中，恶性疟原虫和间日疟原虫蛋白的免疫原性衍生物包括包含本文所公开的氨基酸序列的全长多肽的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。多肽的免疫原性衍生物可通过表达适当的基因片段或通过其他方法诸如通过肽合成来制备。另外，衍生物可以是融合多肽，其包含编码本文所公开的恶性疟原虫多肽的一个或多个表位的附加序列。在这些实施方案中，蛋白质可直接掺入免疫原性制剂中或由DNA质粒或病毒表达系统表达。

在一些实施方案中，恶性疟原虫和间日疟原虫多肽包括免疫原性衍生物，所述免疫原性衍生物与本文所公开的序列具有超过80％的氨基酸序列同一性。在该上下文中，术语“同一性”是指当比对以获得最大对应性时，相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。当序列在保守取代(即具有相同特性的残基取代)方面不同时，可向上调节序列百分比同一性以校正取代的保守性。

当制备组合物用于施用时，优选将其与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合以形成药物制剂或单位剂型。“药学上可接受的载体”是与制剂的其它成分相容并且对其受体无害的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。施用的活性成分可以干粉或颗粒形式；溶液、悬浮液或乳液形式存在。在液体载体中重组之前，所述组合物以干粉形式存在。

包含本发明免疫原性组合物的药物制剂可通过本领域已知的程序，使用公知且容易获得的成分来制备。本发明的治疗剂还可以溶液形式配制，以适用于胃肠外给药，例如通过肌肉内、皮下或静脉内途径给药。本发明治疗剂的药物制剂还可采用水溶液或无水溶液或分散体的形式，或者采用乳液或悬浮液的形式。

因此，可配制免疫原性组合物以用于肠胃外给药(例如，通过注射，例如，推注或连续输注给药)，并且可以单位剂量形式存在于安瓿、预填充注射器、小容量输注容器或具有添加的防腐剂的多剂量容器中。该组合物适于静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射。活性成分可采用如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液这样的形式，并且可包含配方试剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，活性成分可以呈粉末形式，其通过无菌固体的无菌分离或通过由溶液冷冻干燥获得，用于在使用前之前与合适的载体(例如无菌无热原的水)进行构建。

替代地，免疫原性组合物可包含不在表达肽的细胞环境中天然存在的配方试剂。此类配方试剂包括不在表达肽的细胞环境中天然存在，但用于在施用于哺乳动物之前、之后或期间人工增强免疫原性组合物中肽的生物利用度、有效性、递送、储存、给药、吸收、稳定性、安全性或功能的任何表面活性剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、缓冲剂、增稠剂、防腐剂、洗涤剂、佐剂、赋形剂和抗微生物剂。

替代地，免疫原性组合物可以干粉形式提供。干粉组合物可以通过将包含本文所述的多肽的溶液或悬浮液冷冻干燥、喷雾干燥和冷冻喷雾干燥来制备，并且还可任选地包括研磨或在研磨下冻干。干粉可以适合于直接施用于患者，例如通过吸入或胶囊摄取，或者可适合于在流体载体中悬浮或重构。干粉制剂可包括生理学上可接受的载体粉末，诸如赋形剂、分散剂、稳定剂、湿润剂、抗结块剂或其它添加剂。

本发明的免疫原性组合物，干粉和流体实施方案两者，均可包括作为任选成分的药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂，以及本领域中所述的类型的盐。可用于本发明组合物的制剂中的载体和/或稀释剂的具体非限制性示例包括水和生理学上可接受的缓冲盐水溶液，诸如pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲盐水溶液。本公开的组合物还可包含其它试剂的组合，诸如稀释剂，所述稀释剂可包括水、盐水、甘油或其它合适的醇，润湿剂或乳化剂；缓冲剂；增稠剂，例如纤维素或纤维素衍生物；防腐剂；洗涤剂；抗菌剂等。

在免疫原性组合物用作疫苗的情况下，所述组合物包含免疫有效量的本文所述的肽。抗原的“免疫有效量”是当以单剂量或一系列剂量施用于个体时，对治疗或预防疟疾感染有效的量。该量将根据待治疗个体的健康和身体状况以及抗原而有所不同。对施用于生物体的免疫原性或疫苗组合物的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

根据本发明的组合物可用于口服给药、全身给药、肠胃外给药、局部给药、粘膜给药、肌肉内给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮内给药、皮下给药、鼻内给药、阴道内给药、直肠内给药、透皮给药、舌下给药、吸入给药或气溶胶给药。所述组合物可被布置成以单一剂量形式或多剂量方案的一部分给药。在初次免疫时施用多剂量，然后进行一次或多次加强免疫。初次免疫可包括单一制剂，诸如病毒(GC46)或DNA疫苗，之后利用单一或多个制剂诸如另一种病毒(诸如MVA)或重组蛋白进行一次或多次加强免疫。引发和加强免疫之间的合适的时间安排可常规地确定。根据本发明的组合物可以独立使用，或者其可与一种或多种其它免疫原性或疫苗组合物组合，和/或与一个或多个其它治疗方案组合使用。

因此，本公开提供了保护人或非人哺乳动物免受疟疾感染作用的方法，所述方法包括向人或非人哺乳动物施用本文所述的组合物。所述组合物可以为疫苗。本公开还提供了用于在人或非人哺乳动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括向人或非人哺乳动物施用本文所述的药物组合物。所述免疫应答优选是保护性的。所述方法可在患者中产生加强的已经引发的应答。所述免疫应答可以是预防性或治疗性的。

实施例

实施例1：鉴定E140

鉴定新型的高度保护性红细胞前期(PE)约氏疟原虫(Py)抗原的人类直系同源物以用于人疟疾疫苗。根据所用的命名法，将该抗原鉴定为PlasmoDB ID 10：PY06306，或PY17X_0210400、PYYM_0211900或ID：2121.m00052。在本文所公开的实验室测试中，所述抗原也简称为E140或Py E140。新型抗原在寄生虫的子孢子、肝脏和血液阶段中高度表达，并在用约氏疟原虫辐照致弱子孢子(RAS)免疫的小鼠中诱导CD8⁺T细胞应答。其在抗原特异性疫苗免疫后产生强抗体和细胞反应，并且单独地和与其它抗原组合地无菌保护71％-100％的小鼠免受感染性约氏疟原虫子孢子和血液阶段攻击。首先，约氏疟原虫红细胞前期抗原针对其对T细胞的反应性，从RAS免疫小鼠被筛选，作为鉴定用于疫苗开发的抗原的平台。该过程涉及鉴定、克隆、生成DNA质粒(VR1020)、筛选和评价Py抗原的保护小鼠的能力。公认小鼠模型是人类直系同源物成功的预测因子。编码PY06306抗原的基因被鉴定为用于疫苗开发的红细胞前期靶标，并克隆了部分基因。然后实验确定了所述蛋白质可从利用约氏疟原虫RAS免疫的小鼠中生成的脾细胞召集细胞因子(IFN-γ)应答。该数据提供了PY06306抗原参与RAS免疫应答和保护的强有力的证据，因此展示出红细胞前期疫苗在人类中的价值。

实施例2：确认E140保护

制备表达PY06306抗原的两种疫苗试剂用于小鼠中的保护研究。由全长基因生成这些试剂：VR1020质粒(PY06306-E140)中的DNA疫苗和腺病毒血清型5(AdE1(t.PY06306)E3(10X)E4(TIS1)。PY06306抗原的疫苗潜力的证据在两个独立的动物矩阵研究中示出，所述研究旨在评估抗原诱导能够无菌保护小鼠免受感染性Py子孢子攻击的免疫应答的能力。无菌保护通过在子孢子攻击后至多14或17天检查小鼠血液中不存在寄生虫来测量。利用一个方案对远交CD1小鼠进行免疫，所述方案由利用DNA疫苗(100μg，IM)引发和6周后利用腺病毒血清型5构建体(10¹⁰PU，IM)加强组成。采用3-抗原组合策略(命名为矩阵)来测试PY06306抗原加上其它具有和不具有约氏疟原虫环子孢子蛋白(PyCSP)的新Py红细胞前期抗原。

图1所示的第一矩阵动物研究揭示出两种包含PY06306的抗原组合(组)产生显著的保护作用。第一组合单独地和与PyCSP一起分别诱导64％和86％的无菌保护。该第一组合的抗原成分为E140(PY06306)、E137(PY05693)和E057(PY03396)。与PyCSP组合的3-抗原混合物的86％保护高达仅有PyCSP的组(43％)的两倍，从而指示该优质标准疫苗的功效显著增强。第二3-抗原组合单独地和与PyCSP一起分别产生14％和71％无菌保护。该第二组合由E140(PY06306)与具有疫苗潜力的两种附加抗原的组合组成：Py325(PY00232)和PyCelTOS(PY17X_1434600)。这五种抗原中的任一种或全部(PY06306、PY05693、PY03396、PY325和PyCelTOS)有助于相应图中所示的保护；然而，PY06306是所有三种抗原组合共有的唯一抗原，因此需要第二次实验来对这些抗原组合进行去卷积。

实施例3：子孢子攻击

设计第二研究(矩阵去卷积实验2)以评估具有PY06306作为公分母的几种抗原组合。实验形式和免疫按照与对于第一矩阵实验所述相同的方案。图1和2示出了包含PY06306(E140)抗原的所有抗原组合的显著高效性，其范围为71％至100％的受保护小鼠。总之，89％(137/154)的经PY06306免疫小鼠免受疟疾感染。仅PY06306疫苗产生71％的保护，显著高于为36％的仅具有PyCSP的组。此外，如图3所示，未受保护的小鼠的寄生虫血症发病率大幅延迟。对PY06306免疫组的血涂片数据的详细分析示出，四只未受保护的小鼠中有三只在子孢子攻击后第7天、第10天和第12天变为疟疾阳性。与PyCSP、4倍零免疫和幼稚小鼠组的寄生虫血症发病相比，这是显著的，其中所有未受保护的小鼠在子孢子攻击后第5天变为疟疾阳性。

实施例4：抗体滴度

PY06306抗原诱导对于约氏疟原虫子孢子阶段的高抗体滴度和对于血液阶段的低抗体水平，具体取决于个体小鼠。该证据示于图4中(PYQ6306组)，图4列出了在矩阵反卷积实验2中从小鼠的混合血清中测量的对子孢子和血液阶段寄生虫两者的免疫荧光(IFA)抗体滴度。总之，在所有利用PY06306免疫的组中检测到抗子孢子抗体，包括组合，其支持PY06306抗原的免疫原性。滴度范围从1:5120到1:20480。由约氏疟原虫PY06306免疫诱导的抗体与伯氏疟原虫子孢子交叉反应。在仅用PY06306免疫的小鼠中检测的高抗体滴度(1:5,120)展示出PY06306抗原诱导针对子孢子的抗体。

基于数据总结的两个重要观察结果是：(i)对于图2中不具有PY06306(PY03396和PY05693)的抗原的组不存在保护(0％)并且缺乏抗体应答。这证实了PY06306是主要的组分，如果其不是诱导保护的这些组合的唯一组分的话。另一个(ii)是抗子孢子抗体应答由PY06306抗原特异性诱导。保护小鼠相对于未保护小鼠的抗子孢子IFA滴度的比较结果强烈指示在这些小鼠中检测到的抗体与保护结果相关。所有保护研究均在动物协议D02-09和14-IDD-13下进行。保护研究的结果证实PY06306直系同源物作为疟疾疫苗的有价值组分的作用。

实施例5：脾和肝分析

进一步的研究证实，在脾脏中，在经PY06306免疫的小鼠中表达IFNγ的>10％CD8⁺T细胞和较少(<0.6％)的CD4⁺T细胞。观察到肝脏中的范围为5％至16.2％。在第二子孢子攻击后高效保护作用持续11周。T细胞耗竭指示小鼠中的保护作用不需要高水平的E140-特异性T细胞。另外，PY06306免疫诱导高水平的CD8⁺T细胞在脾脏肝脏中表达IFNγ。抗PY06306血清转移至CD1和BALB/c小鼠，显著延迟了寄生虫血症的发作。与用PY06306免疫的受保护小鼠相比，E140-血清受体小鼠也具有显著更低的IFA滴度。在子孢子攻击之前收集的PY06306血清仅与子孢子反应。然而，在攻击后，一些受保护的小鼠通过IFA形成了对血液阶段呈阳性的抗体。

PY06306无菌保护高达100％的CD1和BALB/c小鼠免受血液阶段攻击(图11)。利用PY06306免疫预防血液感染并延迟88％(30/34)未受保护的小鼠中可检测的寄生虫血症的发作。另外，将抗PY06306抗体转移至幼稚小鼠显著延迟感染。在经PY06306免疫的小鼠的脾脏和肝脏中发现高水平的表达IFNγ的CD8⁺T细胞。耗尽不减少无菌保护。PY06306特异性IFA抗体滴度与保护作用相关。

实施例6：体内T细胞耗竭

图9示出了对体内t细胞耗竭进行研究的结果。对几组远交CD1小鼠进行免疫。通过按照标准方案注射T细胞特异性单克隆抗体进行T细胞耗竭。然后用300个约氏疟原虫子孢子攻击小鼠，并且在攻击后直至19天通过薄血涂片中不存在寄生虫来评估保护作用。对所有T细胞耗竭的PY06306免疫小鼠进行保护，从而证实PY06306保护不需要CD4+和CD8+T细胞。来自CD4/CD8组的一只未受保护的小鼠在子孢子攻击后13天在血液中检测到疟疾，然而所有其它小鼠在第5天具有阳性涂片。70只中总计68只受免疫小鼠被免疫，总体功效为97％。该研究证实了由针对子孢子攻击的红细胞前期抗原诱导的保护作用不依赖于T细胞的令人惊讶的机制。

实施例7：血清转移研究

图10A和10B示出了CD1和BALB/c小鼠中的血清转移研究。该研究证实了抗体在PY06306(E140)诱导的保护中的作用。研究设计按照标准血清转移方案，其中采集来自经PY06306免疫的CD1和BALB/c小鼠的血清，将其转移到幼稚动物(1:1比例)，然后用约氏疟原虫子孢子攻击。血清转移在子孢子攻击前进行2天；24小时和6小时。对于CD1小鼠，保护结果如图10A所示，对于BALB/c小鼠，保护结果如图10B所示。图10A和10B示出无菌保护不被来自由PY06306疫苗进行免疫的小鼠的血清(7％(14只中1只)CD1和0％(14只中0只)BALB/c)转移。与同一研究中的任何其它组(Mantel-Cox***，p＝0.0001)相比，来自PY06306血清受体(虚线)的所有未受保护的小鼠的寄生虫血症的发作存在统计学上显著的延迟。这证实了抗PY06306抗体对血液中寄生虫发育的有效影响在保护中起作用。与供体CD1(1:7994)和BALB/c(1:18:549)小鼠相比，显著降低的受体CD1(1:2,560)和BALB/c(1:575)小鼠的抗体滴度，解释了为什么这些小鼠不免受攻击。

实施例8：检测脾脏和肝脏中的PY06306特异性CD8T细胞

在经PY06306免疫的小鼠和幼稚小鼠的脾脏和肝脏中发现PY06306特异性CD8T细胞。由于PY06306是大分子的事实，15聚体重叠肽被分成两个跨越整个蛋白质的库；库A包含自N末端的肽并且库B包含自PY06306的C末端的肽。T细胞通过对表达干扰素γ(IFNγ)的CD8+细胞进行门控的流式细胞术测量，并表达为总T细胞群的百分比。数据示出了仅来自库A的肽能够召集IFNγCD8细胞，从而证实PY06306T细胞表位可能限于抗原的N-末端。对于经PY06306免疫的小鼠的脾脏(平均18％)和肝脏(平均11％)两者均检测到非常高水平的表达IFNγ的CD8+T细胞。对于细胞内细胞因子染色，使用标准方案由经PY06306免疫和零免疫的小鼠制备脾细胞和肝停留T细胞，然后用终浓度为2μg/ml的PY06306(E140)肽库A和B刺激六小时。使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)获取数据，并使用FlowJo(Tree Star Inc.)进行分析。

实施例9：PY06306诱导BALB/c小鼠中的保护

PY06306抗原有效地保护BAB/c小鼠品系免受子孢子攻击。用DNA剂量对每组14只BALB/c小鼠进行免疫，并用编码PY06306、PYQ6306+PyCSP和PyCSP的腺病毒5加强免疫。零免疫小鼠和幼稚小鼠用作小鼠的阴性对照组。所有小鼠均用100个感染性约氏疟原虫子孢子攻击，并在攻击后17天通过经Giemsa染色的薄涂片监测寄生虫血症。攻击时，所有(100％)经PY06306免疫的小鼠均被无菌保护(PY06306和PY06306+PyCSP)，然而57％的PyCSP被保护。因此，PY06306可保护近交小鼠品系，并且与PyCSP抗原混合不抑制PY06306保护。

实施例10：PY06306诱导针对血液阶段攻击的保护

图11示出了针对血液阶段攻击的PY06306保护。单独的和与PyFalstatin组合的PY06306抗原保护小鼠免受10,000个血液阶段寄生虫的严峻攻击。在该研究中，小鼠用PY06306单独免疫和用PY06306与PyFalstatin联合免疫，并用经约氏疟原虫感染的红细胞攻击。两组小鼠均100％无菌保护(黑色条和灰色条)。PyFalstatin抗原也称为PY03424。针对血液阶段攻击的保护提供了由PY06306疫苗诱导的第二级防御，这是疟疾疫苗的有价值的特征。

实施例11：用较低剂量和单剂量的经密码子优化的PY06306 Ad5进行保护

图12示出了用经密码子优化的腺病毒5进行保护。该研究评估了用经密码子优化的(co)PY06306基因制备的腺病毒5构建体，其被设计用于在哺乳动物细胞中表达。PY06306天然密码子序列的变化不改变由Ad5病毒表达的氨基酸序列。研究检查并比较了由天然(na)和经密码子优化的(co)腺病毒5构建体表达的PY06306蛋白的体外表达。在用小鼠多克隆血清探测后，与天然构建体相比，coPY06306 Ad5表达更高水平的PY06306蛋白质。在第一组小鼠中，对于天然(na)和经密码子优化的PY06306Ad5的加强剂量进行滴定，其范围为每剂量10^10、10^9、10^8和10^7PU。用相同的coPY06306 DNA疫苗剂量(100μg)引发这八组中的所有小鼠的免疫，并用不同剂量的naPY06306(黑色条)或coPY06306(灰色条)Ad5构建体肌内注射(IM)加强免疫。总体功效指示，对于相同的Ad5剂量，与具有较低保护(86％、93％、86％和71％)的na PY06306相比，co PY06306 Ad5疫苗在CD1小鼠中诱导更高的保护(100％、100％、86％和93％)。该研究还比较了Ad5给药的皮下(SC)和静脉内(IV)途径。SC途径对na和co PY06306疫苗两者均产生相似的保护水平(分别为50％和57％)。co PY06306Ad5的IV途径导致100％无菌保护，然而na提供79％无菌保护。na PY06306 Ad5的IV途径产生79％无菌保护，然而皮下途径产生50％保护。与诱导29％无菌保护的naPY06306疫苗相比，用单剂量的coPY06306 Ad5免疫的小鼠组诱导93％无菌保护。这些小鼠不接受DNA疫苗引发。所有保护研究均在动物协议D02-09和14-IDD-13下进行。

实施例12：人恶性疟原虫在小鼠中具有免疫原性

图13示出了恶性疟原虫PFA0205w(E140直系同源物)在小鼠中具有免疫原性。针对PFA0205w(又名PF3D7_0104100)产生四种疫苗试剂，这些试剂为：VR1020 DNA疫苗构建体、人腺病毒5构建体、蛋白质表达质粒pEU-E01-GST和pEU-E01-His。DNA疫苗和Ad5大规模生产以用于小鼠免疫的。重组蛋白质在NMRC下由无小麦胚芽细胞系统小规模生产。CD1和BALB/c小鼠两者均使用各种引发-加强方案进行免疫，如图13所示。Ad5引发和重组蛋白加强是最具免疫原性的方案，其诱导针对恶性疟原虫血液和子孢子阶段寄生虫两者的高达1:4000的IFA滴度。单剂量的PFA0205w腺病毒5诱导针对寄生虫的抗体。这证实PFA0205w作为单剂量的重组病毒(腺病毒5)或作为利用Ad5-蛋白质方案的引发-加强是可行的疫苗制剂。

实施例13：恶性疟原虫E140(PFA0205w)在人类中具有免疫原性

图14示出了恶性疟原虫E140(PFA0205w)在人类中具有免疫原性。来自用辐照致弱子孢子(RAS)免疫的个体受试者的T细胞能够响应于由PFA0205w肽库(A)的刺激。肽混合物包含15聚体重叠肽，其覆盖PFA0205w蛋白的大部分N-末端区域。因为蛋白质较大，所述肽被分成两个库；覆盖N端的库A和覆盖PFA0205w蛋白的C端的库B。两个图中的数据均指示利用减毒子孢子疫苗进行免疫诱导人类中的CD4和CD8T细胞两者。CD4+和CD8+T细胞在针对红细胞前期寄生虫的经PFA0205w诱导的保护中起作用。在经E140免疫的小鼠的脾脏和肝脏中具有高水平的约氏疟原虫E140应答。

实施例14：PFA0205w在裂殖体中表达并位于子孢子的表面和细胞溶质中

PFA0205w抗原在恶性疟原虫的子孢子和裂殖体阶段表达。IFA反应性使用由利用PFA0205w腺病毒5引发并利用重组PFA0205w蛋白加强而产生的CD1小鼠血清获得。所述血清对于36小时恶性疟原虫红细胞裂殖体呈阳性，对于早期环和滋养体呈阴性。通过免疫电子显微镜(EM)确定PFA0205w抗原在子孢子中的亚细胞定位。对显微照片的分析示出PFA0205w抗原位于恶性疟原虫子孢子的表面和细胞溶质中。免疫荧光和免疫电子显微镜示出了来自利用PFA0205w腺病毒5免疫并用重组PFA0205w蛋白加强免疫的CD1小鼠的血清的反应性。在红细胞侵入后约36小时，用NF54恶性疟原虫寄生虫制备空气干燥的IFA载玻片。用1:500血清稀释度进行IFA，并用FITC标记的山羊抗小鼠Ig进行显色。对于免疫EM，从感染的蚊子中分离出含恶性疟原虫子孢子的唾腺。将固定的腺体包埋、切片、安装在电子显微镜网格上，并使用相同的血清和胶态金标记的抗小鼠抗体进行染色。显微照片证实PFA0205w抗原位于恶性疟原虫子孢子的表面处和细胞溶质中。

实施例15：PVX_081555(PvE140)在间日疟原虫子孢子中表达

图15示出了PVX_081555(PvE140)在间日疟原虫子孢子中表达。大劣按蚊通过来自感染有间日疟原虫疟疾的患者的膜饲养器供给血液。在膜供给后十四天，从100只蚊子中提取蚊子唾液腺。将唾液腺在包含磷酸盐缓冲盐水的微量离心管中用研杵粉碎并释放间日疟原虫子孢子。然后将唾液腺碎片-子孢子混合物离心以除去蚊子唾液腺碎片，并将间日疟原虫子孢子从上清液转移到新的微量离心管中。对提取的间日疟原虫子孢子进行计数，并在37摄氏度下用1ug分子生物级胰蛋白酶将1×10⁶个子孢子消化18小时。在消化后，将胰蛋白酶子孢子肽在C8反相柱上脱盐并冻干。对冻干的胰蛋白酶肽进行多维蛋白质鉴定技术(MudPIT)以鉴定可能为候选疫苗的间日疟原虫子孢子蛋白质。使用Sequest算法针对组合的按蚊-间日疟原虫蛋白质序列数据库搜索由间日疟原虫子孢子产生的串联质谱。将来自Sequest搜索的输出文件加载到Scaffold蛋白质查看器中。使用Scaffold程序减去与按蚊蛋白质组匹配的序列以突出显示与间日疟原虫蛋白质组特异性匹配的蛋白质。使用Scaffold软件比较由MudPIT鉴定的每种间日疟原虫子孢子蛋白的丰度。蛋白质丰度由Scaffold“定量值”定义，其将与给定蛋白质匹配的质谱丰度归一化为该蛋白质的分子量。在该MudPIT实验中鉴定了256个高可信度的间日疟原虫蛋白质。间日疟原虫E14Q(PVX_081555)是第39最丰富的间日疟原虫子孢子蛋白并且是被测序的第5最丰富的膜结合蛋白。与之相比，与寄生虫膜结合的CSP疫苗抗原是总体上第5最丰富蛋白质，并且是样品中最丰富的膜结合蛋白。该结果示出间日疟原虫E140是寄生虫中最丰富的膜结合蛋白。因此，E140的膜结合和丰度使其成为体液应答的特殊靶标。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110> 卡姆里斯国际公司(CAMRIS INTERNATIONAL, INC.)

<120> 用于疟疾疫苗中的新型抗原(NOVEL ANTIGEN FOR USE IN MALARIA VACCINE)

<130> F8122-00008

<140>

<141>

<150> US 62/296,464

<151> 2016-02-17

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5(PatentIn version 3.5)

<210> 1

<211> 816

<212> PRT

<213> 约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)

<400> 1

Met Gly Asp Val Asp Asn Val Leu Ile Ser Ile Lys Lys Ile Glu Ser

1 5 10 15

Ile Lys Ser Gln Leu Asn Gln Leu Asn Lys Ile Ile Gln Asn Glu Phe

20 25 30

Gly Ser Tyr Cys Gly Arg Lys Asn Arg Ser Ile Asn Leu Glu Ile His

35 40 45

His Asn Glu Phe Asp Lys Ser Ile Phe Lys Arg Leu Tyr Ser Ser Trp

50 55 60

Arg Met Glu Asp Leu Asn Asn Phe Asn Gly Lys Ser Val Ile Lys Ile

65 70 75 80

Met Glu Arg Asn Pro Tyr Val Ile Phe Phe Phe Phe Phe Ile Met Ile

85 90 95

Phe Ile Ile Val Tyr Leu Ile Ser Phe Ile Leu Tyr Thr Lys Trp Phe

100 105 110

Lys Lys Leu Leu Lys Lys Phe Ser Asn Ser His Lys Asn Asn Lys Asp

115 120 125

Lys Glu Glu Asp Trp Val Lys Lys Asn Lys Ala Tyr Arg Asn Ser Asn

130 135 140

Ser Thr His Gly Thr Ile Asn Lys Asp Asn Tyr Asn Gln Glu Leu Asp

145 150 155 160

Glu Leu His Asn Ser Asp Glu Asn Glu Glu Asn Ser Asn Val Ile Asn

165 170 175

Ile Val Lys Lys Arg Ala Tyr Asn Leu Val Ile Asn Leu Ile Val Cys

180 185 190

Ser Phe Leu Ile Cys Leu Ile Phe Leu Gly Ile Trp Thr Ile Phe Ile

195 200 205

Phe Ala Asp Thr Gln Lys Gly Ile Asn Met Asn Ile Cys Gly Leu Ser

210 215 220

Lys Thr Val Glu Gln Phe Leu Ile Asp Lys Cys Pro Asp Thr Lys Asn

225 230 235 240

Val Asn Pro Gln Cys Tyr Ser Leu Glu His Val Ile Asn Asp Ala Val

245 250 255

Ser Val Met Asn Gln Tyr Gln Leu Thr Lys Glu Phe Val Lys Asn Lys

260 265 270

Thr Asn Leu Asn Lys Asn Lys Gly Leu Pro Ile Val Leu Lys Tyr Gln

275 280 285

Thr Gly Phe Asn Met Leu Ala Lys Leu Arg Asp Asn Ile Asp Lys Asn

290 295 300

Val Lys Lys Leu Glu Asn Gly Tyr Leu His Thr Tyr Pro Val Leu Thr

305 310 315 320

Lys Leu Arg Phe Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys Gly Glu Asn Leu

325 330 335

Leu Asn Gln Ala Glu Ser Ile Ile Asp Ser Ser Lys Glu Glu Ile Gly

340 345 350

Lys Ile Phe Asn Asn Val Asp Asn Ala Ile Ala Asn Thr Val His Asn

355 360 365

Asn Val Pro Ser Leu Ser Ser Lys Ile Ser Gly Leu Gly Ile Tyr Ile

370 375 380

Lys Lys Gln Asp Glu Asn Leu Lys Ile Arg Tyr Ile Leu Asn Lys Phe

385 390 395 400

Thr Val Thr Met Ile Ile Leu Ser Ile Val Ile Leu Leu Phe Ser Leu

405 410 415

Leu Val Leu Ile Gly Met Leu Ser Tyr Met Tyr Phe Leu Ile Arg Gly

420 425 430

His Ser Ile Asn Glu Lys Phe Phe Ser Lys Leu Leu Gly Phe Phe Ser

435 440 445

Gly Thr Phe Gly Phe Leu Ala Ile Ile Ile Leu Ile Ile Gly Thr Ala

450 455 460

Leu Leu Ser Leu Ser Val Leu Gly Gly Thr Ser Cys Ile Ile Ser Asp

465 470 475 480

Arg Ile Leu Lys Asn Glu Phe Thr Phe Asp Phe Leu Ser Glu Asn Lys

485 490 495

Ile Gly Tyr Cys Leu Gln Asn Pro Asp Glu Ser Ile Ile Asn Lys Asn

500 505 510

Ile Val Lys Lys Tyr Ala Asn Thr Leu Asp Ser Leu Asn Thr Asn Asp

515 520 525

Ile Tyr Asn Ser Val Glu Gly Tyr Ser Gly Tyr Phe Asp Lys Ile Lys

530 535 540

Asp Glu Tyr Lys Gln His Ser Lys Ile Ile Asn Glu Asn Met Trp Ile

545 550 555 560

Ile Ile Pro Thr Asp Asn Asn Lys Tyr Val Lys Asn Val Lys Ser Asp

565 570 575

Ile Ile Lys Lys Ser Leu Leu Gly Thr Cys Leu Thr Lys Glu Ser Ala

580 585 590

Gln Phe Glu Glu Tyr His Leu Met Gly Thr Asp Ala Tyr Met Lys Tyr

595 600 605

Ile Asn Lys Phe Gly Leu Leu Asn Asn Tyr Glu Met Cys Phe Glu Asp

610 615 620

Pro Ser Cys Glu Asn Asn Asp Arg Lys Tyr Asn Ile Asn Tyr Asn Ser

625 630 635 640

Lys Val Thr Asp Pro Lys Tyr Leu Asp Val Lys Arg Asn Arg Val Met

645 650 655

Leu Tyr Gln Asp Ser Asp Phe Asp Asn Val Leu Glu Val Phe Ile Leu

660 665 670

Lys Ser Lys Ile Asn Asn Asp Lys Ile Phe Asn Ile Ser Asp Leu Asp

675 680 685

Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ile Thr Trp Arg Glu Tyr Thr Pro Lys Asn

690 695 700

Gly Ala Gly Glu Asn Lys Lys Ser Ile Val Gln Thr Tyr Phe Glu Lys

705 710 715 720

Ala Ile Glu Tyr Met Lys Phe Glu Asn Val Leu Thr Leu Leu Lys Glu

725 730 735

Val Asn Asn His Ile Asn Ser Phe Lys Asn Val Ile Ile Glu Lys Ala

740 745 750

Asn Ser Leu Val Asp Asn Thr Asn Cys Ser Arg Phe Ile Asn Val Leu

755 760 765

Thr Asn Ile Arg His Asn Tyr Cys Asp Asn Gly Ile Leu Lys Leu Thr

770 775 780

Arg Leu Ser Val Ile Leu Ile Ser Cys Gly Phe Val Ser Phe Cys Leu

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Trp Tyr Leu Phe Leu Phe Phe Trp Ile Tyr His Gln Met Lys Ile Ile

805 810 815

<210> 2

<211> 2451

<212> DNA

<213> 约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)

<400> 2

atgggagacg ttgacaatgt gttaataagt atcaaaaaaa tagaatcaat aaaaagccaa 60

ttaaaccagt taaacaaaat tatacaaaat gaatttgggt cttattgtgg gcgaaaaaat 120

agaagtataa atcttgaaat acatcataat gaatttgata aaagtatatt caaacgttta 180

tattcatcat ggagaatgga agatcttaat aattttaacg ggaaaagtgt tataaaaata 240

atggaaagaa atccatatgt tatatttttt ttttttttta taatgatttt tattattgtt 300

tatttaattt catttatttt gtatactaaa tggtttaaaa aattattaaa aaaattttcg 360

aattcacaca aaaataataa agataaagaa gaagattggg taaaaaaaaa taaagcttat 420

agaaattcta atagcacaca tggtactatt aataaggata attataatca ggaacttgat 480

gagcttcata atagtgatga aaatgaagaa aatagtaatg ttataaatat tgtaaaaaag 540

agagcttata atttagtaat taatttgata gtttgttctt ttcttatttg tcttattttt 600

ttgggaattt ggacaatatt tatttttgca gatacacaaa aaggaattaa tatgaatatc 660

tgtggattat caaaaacagt tgaacagttt cttattgata aatgccccga cacaaaaaat 720

gtaaatccac aatgttattc tttagagcat gttattaatg atgctgtttc agtaatgaat 780

cagtatcaac tcaccaaaga atttgttaaa aataaaacga atttgaacaa gaataagggc 840

ttgcctattg ttttaaagta ccaaaccgga ttcaacatgc tagcaaaact tagagacaac 900

atagataaaa atgttaaaaa attagagaac ggatatcttc acacatatcc agttttaaca 960

aaacttagat ttactttgga tgaaattgtt tcgaagggag agaatctatt aaatcaggct 1020

gaatctatta ttgattcttc aaaagaagaa attggaaaaa tattcaataa tgtagataat 1080

gctatagcta atactgtaca taataatgtt ccgtctttat catcaaaaat aagtggatta 1140

ggaatatata taaaaaaaca agacgaaaat ttaaaaatac gatatatatt aaataaattt 1200

acagttacaa tgataatttt aagtatagtc atattattat tttcattact tgtgttaata 1260

ggaatgttat cttatatgta ttttttaata agaggccatt caataaatga aaaatttttt 1320

tcaaaattac ttggtttttt tagtggaaca tttggatttt tagcaattat aattttaata 1380

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ataaattcat ttaaaaatgt tattattgaa aaagctaatt cattagtaga taatacaaat 2280

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<211> 791

<212> PRT

<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

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Ser Tyr Phe Cys Gln Asn Glu Asn Lys Asn Val Ser Phe Asn Asn Asn

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Ile Ser Ser Tyr Tyr Asn Asp Asp Ile Phe Ser Lys Ser Thr Leu Asn

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Ser Ser Ile Leu Asp Ile Leu Lys Arg Asn Gln Tyr Val Met Cys Ser

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Leu Tyr Thr Lys Cys Ile Lys Thr Thr Leu Lys Lys Trp Phe Cys Arg

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Tyr Cys Ser Glu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Ser Asn His Asn Glu Gln

130 135 140

Arg Thr Val Leu Gln Asn Val Ile Asn Lys Ser Cys Tyr Phe Ile Thr

145 150 155 160

Tyr Ser Ser Ile Ile Cys Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ile

165 170 175

Thr Tyr Met His Tyr Phe Ile Lys Thr Lys Lys Gly Ile His Ser Asn

180 185 190

Ile Cys Asn Ile Tyr Thr Arg Leu Asp Lys Phe Leu Leu Asn Lys Cys

195 200 205

Leu Asp Pro Lys Lys Val Asp Thr Ser Cys Tyr Ser Ala Glu His Ile

210 215 220

Leu Asn Asp Leu Ser Ser Ile Leu Glu Glu Tyr Lys Lys Val Lys Gln

225 230 235 240

Gln Ala Lys Asp Asp Thr Leu Leu Asp Glu Asn Thr Pro Phe Pro Leu

245 250 255

Leu Glu Arg Tyr Ile Thr Thr Phe Asn Lys Leu Asn Val Leu Lys Asn

260 265 270

Asn Ile Asn Lys Asn Asn Thr Thr Leu Glu Asn Glu Tyr Phe His Thr

275 280 285

Tyr Pro Ala Leu Lys Gly Ile Ser Glu Thr Leu Thr Thr Ile Ile Ser

290 295 300

Glu Gly Asn Lys Asn Phe Gly Asn Ala Arg Asn Val Ile Lys Glu Val

305 310 315 320

Lys Ser Thr Ile Lys Tyr Ser Phe His Thr Val Asp Glu Thr Ile Arg

325 330 335

Asn Val Phe Lys Asp Ser Val Pro Lys Ile Thr Gly Leu Ile Thr Gln

340 345 350

Ala Gly Lys Ser Ile Lys Gly Ile Asn Asn Lys Tyr Lys Ile Lys Glu

355 360 365

Arg Ile Pro Lys Tyr Thr Asn Ile Ile Leu Leu Thr Asn Ile Ile Leu

370 375 380

Leu Leu Pro Pro Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Ile Ile Phe Met Ile

385 390 395 400

Phe Ile Leu Met Gly Tyr Ile Gln Lys Asn Asn Asn Phe Phe Ile Lys

405 410 415

Leu Phe Gly His Phe Ser Ala Tyr Phe Gly Leu Leu Thr Ile Ile Ile

420 425 430

Leu Ser Phe Gly Ile Leu Phe Leu Ser Thr Ser Val Ile Gly Gly Thr

435 440 445

Ser Cys Ile Leu Ser Glu Arg Ile Leu Lys Asn Glu Leu Arg Phe Asp

450 455 460

Ile Leu Asn Asn Thr Leu Ile Asp Tyr Cys Ile Lys Asn Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Leu Ile Asp Asp Asp Ile Thr Thr Ser Phe Val Ala Lys Ile Asn

485 490 495

Ser Phe Asp Thr Gly His Ile Asp His Asn Ile Asn Glu Tyr Glu Lys

500 505 510

His Phe Thr Ile Leu Lys Glu Ser Phe Phe His Lys Ser Leu Lys Phe

515 520 525

Met Asp Tyr Ile Trp Ile Val Ile Met Lys Arg Glu Asn Asn Thr Phe

530 535 540

Leu Asn Arg Ile Arg Thr Glu Gln Val Lys Lys Ser Leu Leu Ile Thr

545 550 555 560

Gly Ile Ile Asn Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Asn Met Glu Ala Ile Gly

565 570 575

Ile Arg Ser Tyr Leu Thr Thr Leu Asn Lys Ile Ile Phe Pro Glu Asn

580 585 590

Asn Gly Lys Ile Cys Phe Asn Asp Ile Ile Cys Glu Lys Glu Asn Asn

595 600 605

Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Ser Lys Thr Thr Asp Gln Lys Tyr Arg

610 615 620

Asn Ile Arg Asp Gly Met Asp Glu His Leu Arg Asn Asp Leu Asp Ala

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Ile Val Gln Leu Phe Val Tyr Lys Ala Arg Ile Leu Lys Glu Asn Ile

645 650 655

Phe Asp Ile Asn Asp Leu Asp Ser Asn Glu Lys Asn Lys Ile Gly Trp

660 665 670

Ser Glu Tyr Thr Pro Arg Asn Ile Asn Gly Thr Gln Lys Lys Ser Ile

675 680 685

Ile Asn Thr Phe Leu Val Asn Val Ile Glu Ser Ile Asn Phe Ser Glu

690 695 700

Ile Ile Asn Phe Phe Asp Lys Met Arg Asp Gln Phe Asn Val Leu Lys

705 710 715 720

Asp Leu Ile Leu Leu Lys Ile Asp Thr Leu Thr Glu Asn Thr Lys Cys

725 730 735

Asn Lys Leu Val Lys Glu Leu Ile Asn Val Arg Lys Asp Tyr Cys Asn

740 745 750

Asn Val Val Leu Asn Leu Ser Thr Leu Ser Val Tyr Leu Ile Ile Phe

755 760 765

Ser Ile Thr Ser Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Phe Leu Phe Leu Trp Phe

770 775 780

Tyr Tyr Asn Ile Lys Pro Ser

785 790

<210> 4

<211> 2375

<212> DNA

<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400> 4

atggtagact tcaacgattt aagcgttgaa ctaaaaaaaa cagaattaat aaaagaggac 60

ctgagaaatc taagccatat aataaataat gaatttagtt acttttgtca aaatgaaaac 120

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agtacattaa ataatttata tacatcttgg aaattagaag atttttctca ttttgatttc 240

agtagtattt tagatatatt aaaaagaaat caatatgtta tgtgtagtat atatttcctc 300

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cataatgaac aaagaacagt attacaaaat gttataaata aatcatgtta ttttattact 480

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gataaattct tattaaataa atgtctagat ccaaaaaaag ttgatacctc gtgttattca 660

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attacaacgt tcaataagct aaatgtacta aaaaacaata taaataaaaa taacacaaca 840

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gatagtgtac ctaaaattac aggattaata acacaagctg ggaaatctat caaaggaata 1080

aataacaaat ataaaattaa agagcgtatt cctaaatata caaatattat tttattaact 1140

aatattattt tattgttacc accattctta atattattag gtatcataat ttttatgata 1200

tttattctta tgggatatat acaaaaaaat aataatttct tcataaaatt atttggtcat 1260

ttcagtgctt actttggttt actcactata attattttat cctttggaat actattctta 1320

agtacttcag tcataggagg cacatcttgt attttatcag aaagaatttt aaaaaatgaa 1380

ttacgttttg atatattaaa taatactctt atagattatt gtattaaaaa tgaaagcgca 1440

ccattaattg acgatgatat aacaacaagc tttgtcgcta aaattaattc tttcgataca 1500

ggacatatag atcataatat aaacgaatat gaaaaacatt ttacaatttt aaaagaatct 1560

ttttttcata agtcattaaa atttatggat tatatatgga ttgttataat gaaacgagaa 1620

aataatacat ttttaaatag aataagaact gaacaagtca aaaaatcgtt attaataaca 1680

ggtattataa acgaaaatat taaatatgaa aatatggaag ctataggtat cagatcctat 1740

ttaactacgt tgaacaaaat tatttttcct gaaaataatg gtaaaatatg ttttaatgat 1800

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acctaattct attaaaaatt gatacattaa cagaaaatac aaaatgtaat aaattagtaa 2220

aagaacttat taatgtcaga aaagattatt gtaataacgt cgttttgaat ttatctactt 2280

tatctgtata tttaattata ttttccatca cttcattttt attatggtat ctatttctat 2340

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<210> 5

<211> 2370

<212> DNA

<213> 间日疟原虫(Plasmodium vivax)

<400> 5

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aagaggaacc cctacgtgat ggggtgtgtg tacttcctca tcatcttcac gtgtgtatat 300

ctgttaacgt tattcctgta taccaagtgc tttcggaggt tgattaaagc cattcgttgc 360

aaaacgtgta ggaggaagaa acagaagcga gaacaacagg agagtgaaaa taaagattta 420

attgaaaatg tgaagaagcg attctttaac atcatgacgt acgtgttttt gagttcgctt 480

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gacgcggtgt ccatcgtgga gcagtaccaa gacatcaagc tgcagataaa ggcggacctg 720

ctggtggacg aggacagggc ggttccgctc ctcacaggct tcctcaccgt gttcgagaac 780

ctgaagaagc tgcagcagaa cgtggcgcgg aacaaccaca tcctggagga gcagtacttc 840

cacacgtacc ccgtgctgac gaggctgggc agagcgctcg acgcagtcat ccaggaggga 900

gaggcgaacc tccagcaggc gacaggcacc ctcgatgaag ccaagcaagc agtcaaagga 960

gccttcgaag aaatcgacca agttctggga gcaaccttta aagaaaatat ggaaaaggta 1020

aatgacaaaa ttacgctctt caataagtct ataaatagaa taatacacca gtataagata 1080

aagcaaaatt tgaagaagta cacgatttca attttgattg tgaagttggt tttgctcatt 1140

cctccccttc tcattctaat tgggttagtg cttttcatat tctttttggt gaaaggggac 1200

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atcaccaagg ggcttgtaga caacatgaag tctttggaca ccaccgaaat ggagaggagg 1500

gtgaatgaat acgattccta tttcaacgat atgaagagaa ccttccgcga aaatacaaga 1560

aattttgtca actacatgtg ggtggtcatt accaagccga acaacaacct gtatgtggat 1620

cgaattcggc taaacactct gaaaaagtcc ctcctagcga ccagcatcac tcgggacaat 1680

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cactatttta ggggcaccca gtttgccctc tgctttgaaa atgaagaatg cgacagggag 1800

gaggacaagt ttaacatcaa ctttaggtcc tccataaatg accccaagta ccagaggatg 1860

aggaaccacc tcaggaataa tgatcttaga gaggacctag acaacgtggt ggagctattc 1920

atttacaagt ctagagttag gaccgaaaag atattctctg tggacgactt ggatagcagc 1980

atgacggaca aaatagggtg gagtgagtac acgccgagga ttaacaaaag ggaggggggg 2040

aaagaacaaa ccttcatttt gaggaagtac ctcgtggagg acattgaaaa tttgaacttc 2100

aaagacgtgg ttagcttctt cgagaaaatt aaacagaaat tcaacaccct cagagacacg 2160

atcattacga aggtgcagat gctcgtgaag aacaccaact gcagcagact cgttggcgag 2220

atgcacaatt tgaaacacat ctactgcgac cgagtcgtgc tgaacatgac catcctctcc 2280

gtcgcgctcg tctccttctc catcatttcg ttcttcctct ggtactgctt tttgttcttt 2340

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<210> 6

<211> 789

<212> PRT

<213> 间日疟原虫(Plasmodium vivax)

<400> 6

Met Ser Asp Glu Tyr Asn Leu Ser Ile Asp Leu Lys Lys Thr Glu Leu

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Leu Lys Ala Ile Ala Lys Val Met His Asn Glu Phe

20 25 30

Gly Tyr Phe Cys Pro Ser Gly Gly Val Lys Val Pro Gln Asp His Pro

35 40 45

Asn Glu Phe Ser Lys Thr Ile Trp Ser Ile Leu Tyr Thr Ser Trp Arg

50 55 60

Met Glu Asp Phe Thr Arg Leu Asn Leu Lys Ser Val Leu Asn Ile Leu

65 70 75 80

Lys Arg Asn Pro Tyr Val Met Gly Cys Val Tyr Phe Leu Ile Ile Phe

85 90 95

Thr Cys Val Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Leu Tyr Thr Lys Cys Phe Arg

100 105 110

Arg Leu Ile Lys Ala Ile Arg Cys Lys Thr Cys Arg Arg Lys Lys Gln

115 120 125

Lys Arg Glu Gln Gln Glu Ser Glu Asn Lys Asp Leu Ile Glu Asn Val

130 135 140

Lys Lys Arg Phe Phe Asn Ile Met Thr Tyr Val Phe Leu Ser Ser Leu

145 150 155 160

Leu Cys Val Leu Ile Gly Leu Gly Ile Trp Tyr Met Ile Ser Phe Phe

165 170 175

Lys Thr Arg Asn Gly Ile Tyr Met Asn Val Cys Ser Ala Ser Thr Ser

180 185 190

Ile Glu Asn Phe Leu Thr Asp Arg Cys Ser Val Gln Gly Gly Glu Val

195 200 205

Asp Ser Ser Cys Tyr Ser Leu Glu His Ile Val Ser Asp Ala Val Ser

210 215 220

Ile Val Glu Gln Tyr Gln Asp Ile Lys Leu Gln Ile Lys Ala Asp Leu

225 230 235 240

Leu Val Asp Glu Asp Arg Ala Val Pro Leu Leu Thr Gly Phe Leu Thr

245 250 255

Val Phe Glu Asn Leu Lys Lys Leu Gln Gln Asn Val Ala Arg Asn Asn

260 265 270

His Ile Leu Glu Glu Gln Tyr Phe His Thr Tyr Pro Val Leu Thr Arg

275 280 285

Leu Gly Arg Ala Leu Asp Ala Val Ile Gln Glu Gly Glu Ala Asn Leu

290 295 300

Gln Gln Ala Thr Gly Thr Leu Asp Glu Ala Lys Gln Ala Val Lys Gly

305 310 315 320

Ala Phe Glu Glu Ile Asp Gln Val Leu Gly Ala Thr Phe Lys Glu Asn

325 330 335

Met Glu Lys Val Asn Asp Lys Ile Thr Leu Phe Asn Lys Ser Ile Asn

340 345 350

Arg Ile Ile His Gln Tyr Lys Ile Lys Gln Asn Leu Lys Lys Tyr Thr

355 360 365

Ile Ser Ile Leu Ile Val Lys Leu Val Leu Leu Ile Pro Pro Leu Leu

370 375 380

Ile Leu Ile Gly Leu Val Leu Phe Ile Phe Phe Leu Val Lys Gly Asp

385 390 395 400

Ile Gly Asn Ser Ser His Phe Phe Leu Asp Leu Phe Gly Val Phe Ser

405 410 415

Ala Tyr Phe Gly Phe Leu Thr Ile Val Ile Leu Leu Ile Gly Ile Ala

420 425 430

Met Leu Ser Ala Ser Ile Leu Gly Gly Thr Thr Cys Ile Ile Ala Asp

435 440 445

Arg Val Leu Lys Asn Glu Leu Asn Phe Asp Val Leu Asn Asp Thr Leu

450 455 460

Ile Asp Tyr Cys Leu Lys Asn Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ser Glu Asp

465 470 475 480

Ile Thr Lys Gly Leu Val Asp Asn Met Lys Ser Leu Asp Thr Thr Glu

485 490 495

Met Glu Arg Arg Val Asn Glu Tyr Asp Ser Tyr Phe Asn Asp Met Lys

500 505 510

Arg Thr Phe Arg Glu Asn Thr Arg Asn Phe Val Asn Tyr Met Trp Val

515 520 525

Val Ile Thr Lys Pro Asn Asn Asn Leu Tyr Val Asp Arg Ile Arg Leu

530 535 540

Asn Thr Leu Lys Lys Ser Leu Leu Ala Thr Ser Ile Thr Arg Asp Asn

545 550 555 560

Ile Lys Phe Gly Lys Phe Asn Leu Trp Gly Thr Asp Glu Tyr Phe Glu

565 570 575

Asn Leu Asn Arg His Tyr Phe Arg Gly Thr Gln Phe Ala Leu Cys Phe

580 585 590

Glu Asn Glu Glu Cys Asp Arg Glu Glu Asp Lys Phe Asn Ile Asn Phe

595 600 605

Arg Ser Ser Ile Asn Asp Pro Lys Tyr Gln Arg Met Arg Asn His Leu

610 615 620

Arg Asn Asn Asp Leu Arg Glu Asp Leu Asp Asn Val Val Glu Leu Phe

625 630 635 640

Ile Tyr Lys Ser Arg Val Arg Thr Glu Lys Ile Phe Ser Val Asp Asp

645 650 655

Leu Asp Ser Ser Met Thr Asp Lys Ile Gly Trp Ser Glu Tyr Thr Pro

660 665 670

Arg Ile Asn Lys Arg Glu Gly Gly Lys Glu Gln Thr Phe Ile Leu Arg

675 680 685

Lys Tyr Leu Val Glu Asp Ile Glu Asn Leu Asn Phe Lys Asp Val Val

690 695 700

Ser Phe Phe Glu Lys Ile Lys Gln Lys Phe Asn Thr Leu Arg Asp Thr

705 710 715 720

Ile Ile Thr Lys Val Gln Met Leu Val Lys Asn Thr Asn Cys Ser Arg

725 730 735

Leu Val Gly Glu Met His Asn Leu Lys His Ile Tyr Cys Asp Arg Val

740 745 750

Val Leu Asn Met Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Val Ser Phe Ser Ile

755 760 765

Ile Ser Phe Phe Leu Trp Tyr Cys Phe Leu Phe Phe Trp Leu Tyr Tyr

770 775 780

Gln Met Lys Met Met

785

<210> 7

<211> 413

<212> PRT

<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400> 7

Met Asn Leu Leu Val Phe Phe Cys Phe Phe Leu Leu Ser Cys Ile Val

1 5 10 15

His Leu Ser Arg Cys Ser Asp Asn Asn Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Val

20 25 30

Asn Arg Ser Thr Trp Leu Asn Ile Ala Glu Arg Ile Phe Lys Gly Asn

35 40 45

Ala Pro Phe Asn Phe Thr Ile Ile Pro Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Ser

50 55 60

Thr Glu Glu Asn Asn Asn Lys Asp Ser Val Leu Leu Ile Ser Lys Asn

65 70 75 80

Leu Lys Asn Ser Ser Asn Pro Val Asp Glu Asn Asn His Ile Ile Asp

85 90 95

Ser Thr Lys Lys Asn Thr Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Ile

100 105 110

Val Gly Ile Tyr Glu Ser Gln Val His Glu Glu Lys Ile Lys Glu Asp

115 120 125

Asn Thr Arg Gln Asp Asn Ile Asn Lys Lys Glu Asn Glu Ile Ile Asn

130 135 140

Asn Asn His Gln Ile Pro Val Ser Asn Ile Phe Ser Glu Asn Ile Asp

145 150 155 160

Asn Asn Lys Asn Tyr Ile Glu Ser Asn Tyr Lys Ser Thr Tyr Asn Asn

165 170 175

Asn Pro Glu Leu Ile His Ser Thr Asp Phe Ile Gly Ser Asn Asn Asn

180 185 190

His Thr Phe Asn Phe Leu Ser Arg Tyr Asn Asn Ser Val Leu Asn Asn

195 200 205

Met Gln Gly Asn Thr Lys Val Pro Gly Asn Val Pro Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Arg Ile Phe Ser Glu Glu Glu Asn Thr Glu Val Glu Ser Ala Glu Asn

225 230 235 240

Asn His Thr Asn Ser Leu Asn Pro Asn Glu Ser Cys Asp Gln Ile Ile

245 250 255

Lys Leu Gly Asp Ile Ile Asn Ser Val Asn Glu Lys Ile Ile Ser Ile

260 265 270

Asn Ser Thr Val Asn Asn Val Leu Cys Ile Asn Leu Asp Ser Val Asn

275 280 285

Gly Asn Gly Phe Val Trp Thr Leu Leu Gly Val His Lys Lys Lys Pro

290 295 300

Leu Ile Asp Pro Ser Asn Phe Pro Thr Lys Arg Val Thr Gln Ser Tyr

305 310 315 320

Val Ser Pro Asp Ile Ser Val Thr Asn Pro Val Pro Ile Pro Lys Asn

325 330 335

Ser Asn Thr Asn Lys Asp Asp Ser Ile Asn Asn Lys Gln Asp Gly Ser

340 345 350

Gln Asn Asn Thr Thr Thr Asn His Phe Pro Lys Pro Arg Glu Gln Leu

355 360 365

Val Gly Gly Ser Ser Met Leu Ile Ser Lys Ile Lys Pro His Lys Pro

370 375 380

Gly Lys Tyr Phe Ile Val Tyr Ser Tyr Tyr Arg Pro Phe Asp Pro Thr

385 390 395 400

Arg Asp Thr Asn Thr Arg Ile Val Glu Leu Asn Val Gln

405 410

<210> 8

<211> 397

<212> PRT

<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400> 8

Met Met Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ser Phe Leu Phe Val

1 5 10 15

Glu Ala Leu Phe Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Arg Val Leu Asn Glu Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu Tyr

35 40 45

Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr Ser

50 55 60

Leu Lys Lys Asn Ser Arg Ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn

65 70 75 80

Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His Lys Lys Leu Lys Gln

85 90 95

Pro Ala Asp Gly Asn Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro

100 105 110

Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro

115 120 125

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

130 135 140

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

145 150 155 160

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

165 170 175

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

180 185 190

Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

195 200 205

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

210 215 220

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

225 230 235 240

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

245 250 255

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

260 265 270

Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp

275 280 285

Pro Asn Arg Asn Val Asp Glu Asn Ala Asn Ala Asn Ser Ala Val Lys

290 295 300

Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu

305 310 315 320

Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val

325 330 335

Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn

340 345 350

Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile

355 360 365

Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser Ser

370 375 380

Ile Gly Leu Ile Met Val Leu Ser Phe Leu Phe Leu Asn

385 390 395

<210> 9

<211> 229

<212> PRT

<213> 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400> 9

Met Lys Val Ser Lys Leu Val Leu Phe Ala His Ile Phe Phe Ile Ile

1 5 10 15

Asn Ile Leu Cys Gln Tyr Ile Cys Leu Asn Ala Ser Lys Val Asn Lys

20 25 30

Lys Gly Lys Ile Ala Glu Glu Lys Lys Arg Lys Asn Ile Lys Asn Ile

35 40 45

Asp Lys Ala Ile Glu Glu His Asn Lys Arg Lys Lys Leu Ile Tyr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ile Ala Ser Gly Ala Ile Ala Ser Val Ala Ala Ile Leu Gly

65 70 75 80

Leu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Lys Lys Ser Arg Glu Asp Asp Leu Tyr Tyr

85 90 95

Asn Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Asn Gly Glu Tyr Asn Ile Lys Tyr Gln

100 105 110

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115 120 125

Ile Asn Lys Ile Asn Leu Asn Lys Pro Ile Ile Glu Asn Lys Asn Asn

130 135 140

Val Asp Val Ser Ile Lys Arg Tyr Asn Asn Phe Val Asp Ile Ala Arg

145 150 155 160

Leu Ser Ile Gln Lys His Phe Glu His Leu Ser Asn Asp Gln Lys Asp

165 170 175

Ser His Val Asn Asn Met Glu Tyr Met Gln Lys Phe Val Gln Gly Leu

180 185 190

Gln Glu Asn Arg Asn Ile Ser Leu Ser Lys Tyr Gln Glu Asn Lys Ala

195 200 205

Val Met Asp Leu Lys Tyr His Leu Gln Lys Val Tyr Ala Asn Tyr Leu

210 215 220

Ser Gln Glu Glu Asn

225

Claims

1.一种用于使哺乳动物免受疟疾的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：

重组多肽，

其中所述重组多肽包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6以及它们的衍生物的氨基酸序列中的一种，其中所述衍生物具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一个的至少10个连续氨基酸，和/或与所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一个具有85％同一性；

药学上可接受的载体；以及

佐剂。

2.一种用于保护哺乳动物免受疟疾的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：

两种或多种重组多肽在药学上可接受的载体中的组合，

其中所述两种或更多种重组多肽中的第一种包含SEQ ID NO.3以及它们的衍生物的氨基酸序列中的一种，其中所述衍生物具有SEQ ID NO.3的至少10个连续氨基酸和/或与SEQID NO.3具有85％同一性；

药学上可接受的载体；以及

佐剂。

3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述两种或更多种重组多肽中的第二种包含选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9以及它们的衍生物的氨基酸序列，其中所述衍生物具有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9中的一个的至少10个连续氨基酸和/或与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9中的一个具有85％同一性。

4.一种在哺乳动物中诱导针对疟疾的免疫应答的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物施用免疫有效量的组合物，所述组合物包含由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6以及它们的衍生物的氨基酸序列中的一个编码的多肽，其中所述衍生物具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一个的至少10个连续氨基酸和/或与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一个具有85％同一性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物为人。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括向所述哺乳动物施用针对疟疾的一种或多种引发或加强免疫，其中所述引发或加强免疫包含免疫有效量的重组多肽，其中所述重组多肽包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6以及它们的衍生物的氨基酸序列中的一种，其中所述衍生物具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一种的至少10个连续氨基酸和/或与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一种具有85％同一性。

7.一种向哺乳动物施用免疫有效量的根据权利要求1所述的组合物的方法，其通过向哺乳动物中引入用于表达多肽的合适表达载体来进行，其中所述合适的表达载体选自质粒、复制病毒载体和非复制病毒载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物为人。

9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述重组多肽由合适的表达载体表达，所述表达载体选自质粒、复制病毒载体和非复制病毒载体。

10.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述重组多肽由合适的表达载体表达，所述表达载体选自DNA质粒、杆状病毒、VSV、MVA、GC46、甲病毒复制子、腺病毒、痘病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、黄热病病毒、逆转录病毒、RNA复制子、DNA复制子、甲病毒复制子颗粒、委内瑞拉马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒和辛德毕斯病毒。

11.根据权利要求4所述的方法，所述组合物通过表达所述重组多肽的合适表达载体施用，其中所述合适的表达载体选自DNA质粒、杆状病毒、VSV、MVA、GC46、SpyVLPs、甲病毒复制子、腺病毒、痘病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、黄热病病毒、逆转录病毒、RNA复制子、DNA复制子、甲病毒复制子颗粒、委内瑞拉马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒和辛德毕斯病毒。

12.一种用于保护哺乳动物免受疟疾的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：

重组多肽；

其中所述重组多肽包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6以及它们的衍生物的氨基酸序列中的一种，其中所述衍生物具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一种的至少10个连续氨基酸，和/或与所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中的一种具有85％同一性；

其中所述免疫原性组合物为干粉。

13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述干粉适用于在药学上可接受的载体中悬浮或重组后施用于哺乳动物。