CN109061167A - 一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸 - Google Patents

一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸 Download PDF

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Abstract

一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫、结合垫、层析膜及吸收垫，所述的结合垫上吸附有纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体；所述的层析膜上设有用PBA人工抗原溶液印制的隐形检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述的纳米材料为氮掺杂碳纳米材料、碳纳米材料、碳量子点荧光纳米颗粒。本发明的试纸条具有特异性强、灵敏度高、稳定性高、安全性好、简便、快速、结果显示形象、直观、适用范围广、携带方便及可定量的特点。在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义，将具有明显的经济效益和社会效益。

Description

一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸
技术领域
本发明涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种检测拟除虫菊酯(PBA)的免疫层析试纸。
背景技术
拟除虫菊酯(Pyrethroids)是在天然除虫菊酯化学结构研究的基础上发展起来的，因其杀虫谱广、高效、低毒、残留少而被广泛应用于农业领域中的害虫、卫生害虫防治及粮食贮藏中。目前与有机磷、氨基甲酸酯类农药并称为使用最广的三大农药，使用范围仅次于有机磷杀虫剂。但其残留期较长，对某些非靶标生物毒性很高；通过食物链的富集进入到机体后，可引起头晕、头痛、恶心和皮肤刺激性不良反应，并且对哺乳动物的生殖、免疫和心血管有毒副作用，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)已对它们在蔬菜和水果等上的残留做了严格限量，我国食品安全国家标准GB 2763-2016也对不同拟除虫菊酯类农药做了相应的最大残留限量。
目前国内外针对PBA的检测方法主要有生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法4大类。生物鉴定法的优点是待检样品不需很纯，缺点是灵敏度低、实验周期较长。化学分析法的优点是经济实用，但不能准确定量，且分析结果的可重复性和再现性差。仪器分析法具有高分离、高检测效能及快速分析能力等优势，但对样品的前处理和操作人员的技术要求高，且仪器设备价格昂贵，不适于现场快速检测。免疫分析法操作简单，成本低，结合氮掺杂碳纳米材料标记物具有激发发射波长灵活可调、荧光稳定性高且无闪烁现象等优势，最终可实现高敏感、高稳定的现场快速定量检测，社会及经济意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，该试纸具有特异、灵敏、快速、简便等特点。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫、结合垫、层析膜及吸收垫，所述的结合垫上吸附有纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体；所述的层析膜上设有用PBA人工抗原溶液印制的隐形检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述的纳米材料为氮掺杂碳纳米材料、碳纳米材料、碳量子点荧光纳米颗粒。
支撑体包括设置在吸附层底面的底层和设置在吸附层顶面的面层。
氮掺杂碳纳米材料N-CDs是以壳聚糖为碳源，乙二胺为氮掺杂剂，采用水热法制备而成，具体方法为：将壳聚糖2.5g溶于5mL超纯水中，加入5mL乙二胺，混匀后置于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中，180℃反应2h，反应结束后将产物抽滤，双蒸水洗涤2次，60℃烘箱干燥得到N-CDs。
氮掺杂碳纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)表面羧基化SiO2纳米颗粒的制备
采用反相微乳法合成SiO2纳米颗粒：按体积比10:30:10:1比例取Ttiton X-100、环己烷、正己醇、超纯水搅拌形成5.1mL微乳液，加入200μL氨水搅匀后，再加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应24h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后用1mL乙醇复溶，形成溶液A；将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)N-CDs-SiO2荧光探针的制备
将2mg表面羧基化的SiO2纳米颗粒和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h；将其加入到1mL浓度为l mg/mL N-CDs溶液中，15min加完，室温避光搅拌反应4h后；再次加入20μL正硅酸乙酯，0.12g氯乙酸，0.25mg N-CDs颗粒，室温避光搅拌反应2h进行包壳，反复包壳3次，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
取步骤(2)制备的荧光探针15mg溶于1.5mL二氧六环、1.5mL DMF、60μL三乙胺的混合溶液中，冰浴30min，搅拌加入20μL氯甲酸异丁酯，冰浴2h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，室温搅拌反应过夜；4℃条件下，反应物用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析3d，得到N-CDs标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
碳纳米材料是以柠檬酸为碳源、半胱胺盐酸盐为钝化剂，通过水热合成法制备而成：将1.5g柠檬酸和1.62g半胱胺盐酸盐溶于7.5mL超纯水中，充分溶解后转移溶液至50mL聚四氟乙烯内胆之中，再将内胆置于高压反应釜中，200℃反应3h，反应结束后将产物抽滤，乙醇洗涤2次，65℃烘箱干燥，得到碳纳米材料TPCA。
碳纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)碳纳米材料TPCA的表面硅化
将碳纳米材料TPCA分散在体积浓度为10％的乙醇溶液中，配制成浓度为1mg/mL的TPCA溶液；搅拌状态下将2mL氨水逐滴加入2mL TPCA溶液中，150rpm室温反应25min，然后加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应3h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)碳纳米材料TPCA的表面羧基化
将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液A；取200mg表面硅化的TPCA，加入到体积为2.5mL的乙醇中，形成溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
将2mg表面羧基化的TPCA和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到1mL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，15min加完，4℃避光搅拌反应过夜；用PBS 4℃条件下透析3d，得到TPCA标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
碳纳米材料是以色氨酸为碳源，通过水与五氧化二磷反应放热，促进色氨酸碳化及分子聚合制备而成：称取0.3g色氨酸溶于500-1000μL超纯水中；待完全溶解后，迅速导入装有3.0g五氧化二磷的玻璃小瓶中；待反应物质放热恢复至室温后，加入双蒸水洗涤2次，离心取上清，65℃烘箱干燥，得到碳纳米材料。
碳纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)碳纳米材料的表面硅化
将碳纳米材料分散在体积浓度为10％的乙醇溶液中，配制成浓度为1mg/mL的碳纳米溶液；搅拌状态下将2mL氨水逐滴加入2mL碳纳米溶液中，150rpm室温反应25min，然后加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应3h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)碳纳米材料的表面羧基化
将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液A；取200mg表面硅化的碳纳米材料，加入到体积为2.5mL的乙醇中，形成溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
称取12.78mg表面羧基化的碳纳米材料溶于500μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.34mg DCC，充分溶解；再滴加200μL溶解有4.17mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液，室温搅拌反应8h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，搅拌反应过夜；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲透析3d，得到碳量子点荧光纳米颗粒标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
碳量子点荧光纳米颗粒是以柠檬酸及甲胺盐为原料，通过微波辅助法制备而成：称取0.5g柠檬酸和0.176g甲胺盐酸盐，溶于5mL水中，超声充分溶解混合均匀后，放置于功率为700W的微波炉中，微波5min后，反应结束，自然冷却，双蒸水洗涤2次，65℃烘箱干燥，得到黑色固体，即为碳量子点荧光纳米颗粒。
碳量子点荧光纳米颗粒标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)表面羧基化SiO2纳米颗粒的制备
采用反相微乳法合成SiO2纳米颗粒：按体积比10:30:10:1比例取Ttiton X-100、环己烷、正己醇、超纯水搅拌形成微乳液5.1mL，加入200μL氨水搅匀后，再加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应24h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后用1mL乙醇复溶，形成溶液A；将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)荧光探针的制备
将2mg表面羧基化的SiO2纳米颗粒和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h；将其加入到1mL浓度为l mg/mL碳量子点荧光纳米颗粒溶液中，15min加完，室温避光搅拌反应4h后；再次加入20μL正硅酸乙酯，0.12g氯乙酸，0.25mg碳量子点荧光纳米颗粒，室温避光搅拌反应2h进行包壳，反复包壳3次，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
称取12.78mg步骤(2)制备的荧光探针溶于500μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.34mg DCC，充分溶解；再滴加200μL溶解有4.17mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液，室温搅拌反应8h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，搅拌反应过夜；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲透析3d，得到碳量子点荧光纳米颗粒标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
本发明的试纸条具有特异性强、灵敏度高、稳定性高、安全性好、简便、快速、结果显示形象、直观、适用范围广、携带方便及可定量的特点。能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等。本发明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义，将具有明显的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为本发明的试纸的主视图，图中，1为样品垫、2为结合垫、3为层析膜、4为吸收垫、7为底层、8为面层。
图2为本发明的试纸的俯视图，图中，4为吸收垫、5为隐形检测印迹、6为隐形对照印迹、8为面层。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，参照图1-2，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫1、结合垫2、层析膜3及吸收垫4，其特征在于，所述的结合垫上吸附有纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体PBA-mAb；所述的层析膜上设有用偶联PBA的载体蛋白(PBA人工抗原)溶液印制的隐形检测印迹5和用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹6；所述的纳米材料为氮掺杂碳纳米材料、碳纳米材料、碳量子点荧光纳米颗粒。
所述的支撑体包括设置在吸附层底面的底层7和设置在吸附层顶面的面层8。
所述的支撑板材料为不吸水的韧性PVC材料。
所述的样品垫材料除玻璃纤维棉外，还可为尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜。
所述的结合垫材料为玻璃纤维棉。
所述的层析膜材料除硝酸纤维素膜外，还可为纯纤维素膜或羧化纤维素膜。
所述的吸水垫材料为强力吸水滤纸。
所述的偶联PBA的载体蛋白除牛血清白蛋白(BSA)外，还可为鸡卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)。
所述的隐形检测印迹和隐形对照印迹除“∣∣”直线式印迹外，还可以为“十十”字型排列印迹、“┬┬”字型排列印迹、“┴┴”字型排列印迹、“├├”字型排列印迹或“┤┤”字型排列印迹。
在样品垫与结合垫交界处对应的面层上印制有红色样品标记警告线，且印有max字样，该标记警告线距离样品垫顶端一侧1.1-1.2cm处。
所述的面层覆盖在样品垫和结合垫上面的为白色，覆盖在吸水垫上面的为蓝色，还可为其它颜色(如绿色)。
实施例2
本实施例检测拟除虫菊酯试纸，主要包括：PBA人工抗原的制备、PBA单克隆抗体(PBA-mAb)、氮掺杂碳纳米材料(N-CDs)标记PBA抗体的制备以及基于N-CDs标记的免疫层析试纸的制备等步骤，其中，各产品的制备方法如下：
1、PBA人工抗原(PBA-BSA)的制备
称取10mg的牛血清白蛋白(BSA)置于10mL螺口瓶中，用pH 9.0的碳酸盐缓冲液制成质量分数10％BSA活化溶液A。称取1mg甲氰菊酯(PBA)加入2mL 0.1mol/L的NaIO4溶解，制成溶液B。将溶液A加入溶液B置于室温反应30min后，加入0.1mL NaBH4缓冲液搅拌混匀，用1mol/L NaOH调节pH至9.0，置4℃反应过夜，用0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液透析，透析后得到纯化的PBA-BSA。
2、PBA-mAb的制备
动物免疫：用制备的人工抗原PBA-BSA以20-25μg/只的用量，采用背部四点免疫法，免疫6-8周龄Balb/C母鼠4次，首免用弗氏完全佐剂乳化，其余用弗氏不完全佐剂乳化，每次免疫间隔时间3周，最后一次免疫后4周挑选抗体效价高、抑制率好的小鼠，进行超强免疫。
细胞融合：超强免疫后3天，将免疫小鼠眶下窦取血，脱颈处死，取脾脏；用75％的酒精浸泡小鼠5-10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例在离心管中混合，将其置于40℃水浴中；将1mL PEG-1500在60s内顺管壁加到离心管内，水浴中继续轻晃反应90s后，按照1mL/30s，3mL/30s，11mL/30s的速度将15mL37℃的GNK溶液加入离心管中，然后在37℃水浴锅中反应5min，1000rpm离心10min，弃上清；打散细胞团后，加入40mLHAT培养基，混匀后加到饲养细胞培养板上，100μL/孔，置37℃，5％CO2培养箱中。
单克隆抗体的筛选：培养10-14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3-6次有限稀释克隆化(直到细胞克隆为单克隆，检测各个克隆孔效价、抑制价基本一致)，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与PBA反应，亲和力常数达到1010-1012L/mol，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。
3、基于N-CDs标记的免疫层析试纸的制备
(1)采用水热法制备氮掺杂碳纳米材料N-CDs
将壳聚糖2.5g溶于5mL超纯水中，加入5mL乙二胺，混匀后置于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中，180℃反应2h，反应结束后将产物抽滤，双蒸水洗涤2次，60℃烘箱干燥得到N-CDs。
(2)表面羧基化SiO2纳米颗粒的制备
采用反相微乳法合成SiO2纳米颗粒：按体积比10:30:10:1比例取Ttiton X-100、环己烷、正己醇、超纯水搅拌形成微乳液5.1mL，加入200μL氨水搅匀后，再加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应24h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后用1mL乙醇复溶，形成溶液A；将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存。
(3)N-CDs-SiO2荧光探针的制备
将2mg表面羧基化的SiO2纳米颗粒和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下磁力搅拌反应3h；将其加入到1mL浓度为l mg/mL N-CDs溶液(0.1mol/L NaOH溶液溶解)中，15min加完，室温避光搅拌反应4h后；再次加入20μL正硅酸乙酯，0.12g氯乙酸，0.25mg N-CDs颗粒，室温避光搅拌反应2h进行包壳，反复包壳3次，氮吹干燥，4℃密封保存。
(4)PBA-mAb的标记
取步骤(2)制备的荧光探针15mg溶于1.5mL二氧六环、1.5mL DMF、60μL三乙胺的混合溶液中，冰浴30min，搅拌加入20μL氯甲酸异丁酯，冰浴2h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，室温搅拌反应过夜；4℃条件下，反应物用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析3d，得到N-CDs标记的PBA-mAb(N-CDs-PBA-mAb)溶液，4℃保存。
(5)基于N-CDs标记的免疫层析试纸的制备
将N-CDs-PBA-mAb溶液喷涂于玻璃纤维膜上，37℃恒温干燥4h，形成结合垫；将PBA人工抗原与羊抗或兔抗IgG溶液一同分别划在层析膜上，形成两条印记：一条为隐形检测印迹(T线)、一条为隐形对照印迹(C线)，37℃恒温干燥过夜，制得层析膜；将样品垫、结合垫、层析膜、吸收垫按顺序粘贴在底层上后，再粘贴面层，裁切成合适尺寸获得试纸产品。
检测反应原理
当试纸测试端插入待测样品溶液后，在虹吸作用带动下，待测溶液会从试纸的测试端扩散到手柄端。
在扩散过程中，待测溶液中的拟除虫菊酯可与结合垫上的N-CDs-PBA-mAb相结合，进而封闭N-CDs-PBA-mAb上拟除虫菊酯的抗原结合点，阻止N-CDs-PBA-mAb与层析膜上的检测印迹结合，而对照印迹上羊抗或兔抗小鼠IgG抗体则可与N-CDs-PBA-mAb结合，通过荧光读条仪，在紫外线激发下，T线处就不会出现吸收峰，C线处会出现吸收峰。反之若样品溶液中无拟除虫菊酯时，则不能阻止N-CDs-PBA-mAb与层析膜上的检测印迹结合，而羊抗或兔抗小鼠IgG抗体也能与N-CDs-PBA-mAb结合，通过荧光读条仪，在紫外线激发下，T线和C线处均会出现吸收峰。如果层析膜上没有C线吸收峰，则表明试纸条已失效。
本实施例对基于N-CDs标记的定量检测PBA的试纸的灵敏性、特异性检测。
灵敏性的检测：用20％甲醇磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)分别配制甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯菊酯、溴氰菊酯4种标准品，浓度为1、2、4、8、16μg/mL，在本发明的免疫层析试纸上上样80-100μL，反应5min后，通过读条仪读取T线扫描面积光密度的相对光密度值(relative optical density，ROD)。以不同浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率为纵坐标，以不同标准品浓度的常用对数值为横坐标，绘制标准曲线，进行相关回归分析，计算该试纸对甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯菊酯、溴氰菊酯的IC50和最低检测限。经测定，该试纸对甲氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.0707x+1.536，相关系数为R2＝0.9973，对氯氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.0158x+1.366，相关系数为R2＝0.9977，对三氟氯菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1726x+1.6928，相关系数为R2＝0.9895，对溴氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1245x+1.5538，相关系数为R2＝0.9818，根据回归方程计算出该试纸对甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯菊酯、溴氰菊酯的IC50分别为2.58μg/mL、2.04μg/mL、1.97μg/mL和2.01μg/mL，最低检测限分别为0.69μg/mL，0.58μg/mL、0.48μg/mL和0.55μg/mL。表明免疫层析试纸对拟除虫菊酯具有较高的灵敏度。
特异性的检测：以其他有机磷农药作为竞争物，配制上述标准品不同浓度，用免疫层析试纸检测其抑制率，以该试纸对PBA的与IC50各竞争物IC50的百分比作为其交叉反应率。测定结果见表1。由表1可看出，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他有机磷农药均无交叉反应。
表1基于N-CDs标记的定量检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸的交叉反应性
化合物 半数抑制浓度(μg/mL) 交叉反应率(％)
甲氰菊酯 2.58 100
氯氰菊酯 2.04 100
三氟氯菊酯 1.97 100
溴氰菊酯 2.01 100
氟苯虫酰胺 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
伏杀硫磷 ＞1.0×105 &lt;0.028
环酰菌胺 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
甲胺磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
甲基嘧啶磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
实施例3
本实施例检测拟除虫菊酯试纸，主要包括：PBA人工抗原的制备、PBA单克隆抗体(PBA-mAb)、碳纳米材料标记PBA抗体的制备以及基于碳纳米材料标记的免疫层析试纸的制备等步骤，其中，各产品的制备方法如下：
1、PBA人工抗原(PBA-BSA)的制备
同实施例2。
2、PBA-mAb的制备
同实施例2。
3、基于碳纳米材料标记的免疫层析试纸的制备
(1)碳纳米材料TPCA的制备
将1.5g柠檬酸和1.62g半胱胺盐酸盐溶于7.5mL超纯水中，充分溶解后转移溶液至50mL聚四氟乙烯内胆之中，再将内胆置于高压反应釜中，200℃反应3h，反应结束后将产物抽滤，乙醇洗涤2次，65℃烘箱干燥，得到碳纳米材料TPCA。
(2)碳纳米材料TPCA的表面硅化
将碳纳米材料TPCA分散在体积浓度为10％的乙醇溶液中，配制成浓度为1mg/mL的TPCA溶液；搅拌状态下将2mL氨水逐滴加入2mL TPCA溶液中，150rpm室温反应25min，然后加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应3h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存.
(3)碳纳米材料TPCA的表面羧基化
将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液A；取200mg表面硅化的TPCA，加入到体积为2.5mL的乙醇中，形成溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存。
(4)PBA-mAb的标记
将2mg表面羧基化的TPCA和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到1mL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，15min加完，4℃避光搅拌反应过夜；用PBS 4℃条件下透析3d，得到TPCA标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
检测反应原理同实施例2。
本实施例对基于TPCA标记的定量检测PBA的免疫层析试纸的灵敏性、特异性检测。
灵敏性的检测：方法同实施例2。经测定，该试纸对甲氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.0808x+1.6733，相关系数为R2＝0.9953，对氯氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-0.9573x+1.3688，相关系数为R2＝0.9965，对三氟氯菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.0897x+1.5556，相关系数为R2＝0.9902，对溴氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1586x+1.4321，相关系数为R2＝0.9912，根据回归方程计算出该试纸对甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯菊酯、溴氰菊酯的IC50分别为2.10μg/mL、1.98μg/mL、2.15μg/mL和1.83μg/mL，最低检测限分别为0.65μg/mL，0.55μg/mL、0.67μg/mL和0.48μg/mL。表明免疫层析试纸对拟除虫菊酯具有较高的灵敏度。
特异性的检测：方法同实施例2。测定结果见表2。由表2可看出，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他有机磷农药均无交叉反应。
表2基于TPCA标记的定量检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸的交叉反应性
化合物 半数抑制浓度(μg/mL) 交叉反应率(％)
甲氰菊酯 2.10 100
氯氰菊酯 1.98 100
三氟氯菊酯 2.15 100
溴氰菊酯 1.83 100
氟苯虫酰胺 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
伏杀硫磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
环酰菌胺 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
甲胺磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
甲基嘧啶磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
实施例4
本实施例检测拟除虫菊酯试纸，主要包括：PBA人工抗原的制备、PBA单克隆抗体(PBA-mAb)、碳纳米材料标记PBA抗体的制备以及基于碳纳米材料标记的免疫层析试纸的制备等步骤，其中，各产品的制备方法如下：
1、PBA人工抗原(PBA-BSA)的制备
同实施例2。
2、PBA-mAb的制备
同实施例2。
3、基于碳纳米材料标记的免疫层析试纸的制备
(1)碳纳米材料的制备
称取0.3g色氨酸溶于500-1000μL超纯水中；待完全溶解后，迅速导入装有3.0g五氧化二磷的玻璃小瓶中；待反应物质放热恢复至室温后，加入适量双蒸水洗涤2次，离心取上清，65℃烘箱干燥，得到碳纳米材料。
(2)碳纳米材料的表面硅化
将碳纳米材料分散在体积浓度为10％的乙醇溶液中，配制成浓度为1mg/mL的碳纳米溶液；搅拌状态下将2mL氨水逐滴加入2mL碳纳米溶液中，150rpm室温反应25min，然后加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应3h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)碳纳米材料的表面羧基化
将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液A；取200mg表面硅化的碳纳米材料，加入到体积为2.5mL的乙醇中，形成溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(4)PBA-mAb的标记
称取12.78mg表面羧基化的碳纳米材料溶于500μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.34mg DCC，充分溶解；再滴加200μL溶解有4.17mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液，室温搅拌反应8h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，搅拌反应过夜；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲透析3d，得到碳量子点荧光纳米颗粒标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
检测反应原理同实施例2。
本实施例对基于碳纳米材料标记的定量检测PBA的免疫层析试纸的灵敏性、特异性检测。
灵敏性的检测：方法同实施例2。经测定，该试纸对甲氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1437x+1.6676，相关系数为R2＝0.9953，对氯氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.0268x+1.4816，相关系数为R2＝0.9947，对三氟氯菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1736x+1.2428，相关系数为R2＝0.9910，对溴氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.0465x+1.1542，相关系数为R2＝0.9928，根据回归方程计算出该试纸对甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯菊酯、溴氰菊酯的IC50分别为2.21μg/mL、2.15μg/mL、2.14μg/mL和1.96μg/mL，最低检测限分别为0.70μg/mL，0.68μg/mL、0.67μg/mL和0.64μg/mL。表明免疫层析试纸对拟除虫菊酯具有较高的灵敏度。
特异性的检测：方法同实施例2。测定结果见下表3，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他有机磷农药均无交叉反应。
表3基于碳纳米材料标记的定量检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸的交叉反应性
化合物 半数抑制浓度(μg/mL) 交叉反应率(％)
甲氰菊酯 2.21 100
氯氰菊酯 2.15 100
三氟氯菊酯 2.14 100
溴氰菊酯 1.96 100
氟苯虫酰胺 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
伏杀硫磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
环酰菌胺 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
甲胺磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
甲基嘧啶磷 ＞1.0×10<sup>5</sup> &lt;0.028
实施例5
本实施例检测拟除虫菊酯试纸，主要包括：PBA人工抗原的制备、PBA单克隆抗体(PBA-mAb)、碳量子点荧光纳米颗粒标记PBA抗体的制备以及基于碳量子点荧光纳米颗粒标记的免疫层析试纸的制备等步骤，其中，各产品的制备方法如下：
1、PBA人工抗原(PBA-BSA)的制备
同实施例2。
2、PBA-mAb的制备
同实施例2。
3、基于碳量子点荧光纳米颗粒标记的免疫层析试纸的制备
(1)碳量子点荧光纳米颗粒的制备
称取0.5g柠檬酸和0.176g甲胺盐酸盐，溶于5mL水中，超声充分溶解混合均匀后，放置于功率为700W的微波炉中，微波5min后，反应结束，自然冷却，双蒸水洗涤2次，65℃烘箱干燥，得到黑色固体，即为碳量子点荧光纳米颗粒。
(2)表面羧基化SiO2纳米颗粒的制备
采用反相微乳法合成SiO2纳米颗粒：按体积比10:30:10:1比例取Ttiton X-100、环己烷、正己醇、超纯水搅拌形成微乳液5.1mL，加入200μL氨水搅匀后，再加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应24h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后用1mL乙醇复溶，形成溶液A；将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)荧光探针的制备
将2mg表面羧基化的SiO2纳米颗粒和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h；将其加入到1mL浓度为l mg/mL碳量子点荧光纳米颗粒溶液(0.1mol/L NaOH溶液溶解)中，15min加完，室温避光搅拌反应4h后；再次加入20μL正硅酸乙酯，0.12g氯乙酸，0.25mg碳量子点荧光纳米颗粒，室温避光搅拌反应2h进行包壳，反复包壳3次，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
称取12.78mg步骤(2)制备的荧光探针溶于500μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.34mg DCC，充分溶解；再滴加200μL溶解有4.17mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液，室温搅拌反应8h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，搅拌反应过夜；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲透析3d，得到碳量子点荧光纳米颗粒标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
检测反应原理同实施例2。
本实施例对基于碳量子点荧光纳米颗粒标记的定量检测PBA的免疫层析试纸的灵敏性、特异性检测。
灵敏性的检测：方法同实施例2。经测定，该试纸对甲氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-0.9887x+1.2456，相关系数为R2＝0.9973，对氯氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1118x+1.2963，相关系数为R2＝0.9966，对三氟氯菊酯的曲线回归方程为：y＝-0.9886x+1.3562，相关系数为R2＝0.9913，对溴氰菊酯的曲线回归方程为：y＝-1.1379x+1.4637，相关系数为R2＝0.9920，根据回归方程计算出该试纸对甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯菊酯、溴氰菊酯的IC50分别为2.01μg/mL、1.85μg/mL、2.18μg/mL和1.89μg/mL，最低检测限分别为0.59μg/mL，0.49μg/mL、0.62μg/mL和0.55μg/mL。表明免疫层析试纸对拟除虫菊酯具有较高的灵敏度。
特异性的检测：方法同实施例2。测定结果见下表4，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他有机磷农药均无交叉反应。
表4基于碳量子点荧光纳米颗粒标记的定量检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸的交叉反应性
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫(1)、结合垫(2)、层析膜(3)及吸收垫(4)，其特征在于，所述的结合垫上吸附有纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体；所述的层析膜上设有用PBA人工抗原溶液印制的隐形检测印迹(5)和用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹(6)；所述的纳米材料为氮掺杂碳纳米材料、碳纳米材料、碳量子点荧光纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的支撑体包括设置在吸附层底面的底层(7)和设置在吸附层顶面的面层(8)。
3.根据权利要求1所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的氮掺杂碳纳米材料N-CDs是以壳聚糖为碳源，乙二胺为氮掺杂剂，采用水热法制备而成，具体方法为：将壳聚糖2.5g溶于5mL超纯水中，加入5mL乙二胺，混匀后置于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中，180℃反应2h，反应结束后将产物抽滤，双蒸水洗涤2次，60℃烘箱干燥得到N-CDs。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的氮掺杂碳纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)表面羧基化SiO2纳米颗粒的制备
采用反相微乳法合成SiO2纳米颗粒：按体积比10:30:10:1比例取Ttiton X-100、环己烷、正己醇、超纯水搅拌形成5.1mL微乳液，加入200μL氨水搅匀后，再加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应24h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后用1mL乙醇复溶，形成溶液A；将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)N-CDs-SiO2荧光探针的制备
将2mg表面羧基化的SiO2纳米颗粒和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h；将其加入到1mL浓度为l mg/mL N-CDs溶液中，15min加完，室温避光搅拌反应4h后；再次加入20μL正硅酸乙酯，0.12g氯乙酸，0.25mg N-CDs颗粒，室温避光搅拌反应2h进行包壳，反复包壳3次，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
取步骤(2)制备的荧光探针15mg溶于1.5mL二氧六环、1.5mL DMF、60μL三乙胺的混合溶液中，冰浴30min，搅拌加入20μL氯甲酸异丁酯，冰浴2h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，室温搅拌反应过夜；4℃条件下，反应物用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析3d，得到N-CDs标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
5.根据权利要求1所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的碳纳米材料是以柠檬酸为碳源、半胱胺盐酸盐为钝化剂，通过水热合成法制备而成：将1.5g柠檬酸和1.62g半胱胺盐酸盐溶于7.5mL超纯水中，充分溶解后转移溶液至50mL聚四氟乙烯内胆之中，再将内胆置于高压反应釜中，200℃反应3h，反应结束后将产物抽滤，乙醇洗涤2次，65℃烘箱干燥，得到碳纳米材料TPCA。
6.根据权利要求1、2或5所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的碳纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)碳纳米材料TPCA的表面硅化
将碳纳米材料TPCA分散在体积浓度为10％的乙醇溶液中，配制成浓度为1mg/mL的TPCA溶液；搅拌状态下将2mL氨水逐滴加入2mL TPCA溶液中，150rpm室温反应25min，然后加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应3h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)碳纳米材料TPCA的表面羧基化
将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液A；取200mg表面硅化的TPCA，加入到体积为2.5mL的乙醇中，形成溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
将2mg表面羧基化的TPCA和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到1mL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，15min加完，4℃避光搅拌反应过夜；用PBS 4℃条件下透析3d，得到TPCA标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
7.根据权利要求1所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的碳纳米材料是以色氨酸为碳源，通过水与五氧化二磷反应放热，促进色氨酸碳化及分子聚合制备而成：称取0.3g色氨酸溶于500-1000μL超纯水中；待完全溶解后，迅速导入装有3.0g五氧化二磷的玻璃小瓶中；待反应物质放热恢复至室温后，加入双蒸水洗涤2次，离心取上清，65℃烘箱干燥，得到碳纳米材料。
8.根据权利要求1、2或7所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的碳纳米材料标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)碳纳米材料的表面硅化
将碳纳米材料分散在体积浓度为10％的乙醇溶液中，配制成浓度为1mg/mL的碳纳米溶液；搅拌状态下将2mL氨水逐滴加入2mL碳纳米溶液中，150rpm室温反应25min，然后加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应3h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)碳纳米材料的表面羧基化
将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液A；取200mg表面硅化的碳纳米材料，加入到体积为2.5mL的乙醇中，形成溶液B；将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
称取12.78mg表面羧基化的碳纳米材料溶于500μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.34mg DCC，充分溶解；再滴加200μL溶解有4.17mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液，室温搅拌反应8h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，搅拌反应过夜；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲透析3d，得到碳量子点荧光纳米颗粒标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
9.根据权利要求1所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的碳量子点荧光纳米颗粒是以柠檬酸及甲胺盐为原料，通过微波辅助法制备而成：称取0.5g柠檬酸和0.176g甲胺盐酸盐，溶于5mL水中，超声充分溶解混合均匀后，放置于功率为700W的微波炉中，微波5min后，反应结束，自然冷却，双蒸水洗涤2次，65℃烘箱干燥，得到黑色固体，即为碳量子点荧光纳米颗粒。
10.根据权利要求1、2或9所述的检测拟除虫菊酯的免疫层析试纸，其特征在于，所述的碳量子点荧光纳米颗粒标记的抗PBA单克隆抗体的制备方法为：
(1)表面羧基化SiO2纳米颗粒的制备
采用反相微乳法合成SiO2纳米颗粒：按体积比10:30:10:1比例取Ttiton X-100、环己烷、正己醇、超纯水搅拌形成微乳液5.1mL，加入200μL氨水搅匀后，再加入80μL正硅酸乙酯，室温避光反应24h；反应结束后6000rpm离心10min，乙醇洗涤4次后用1mL乙醇复溶，形成溶液A；将0.47g氯乙酸加入到2.5mL浓度为6mol/L的NaOH溶液中，形成溶液B；将溶液A加入到溶液B中，室温搅拌反应70min；反应结束后，6000rpm离心10min，将得到的沉淀用双蒸水洗涤4次后，氮吹干燥，4℃密封保存；
(2)荧光探针的制备
将2mg表面羧基化的SiO2纳米颗粒和2mg N,N'-羰基二咪唑加入到400μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌反应3h；将其加入到1mL浓度为l mg/mL碳量子点荧光纳米颗粒溶液中，15min加完，室温避光搅拌反应4h后；再次加入20μL正硅酸乙酯，0.12g氯乙酸，0.25mg碳量子点荧光纳米颗粒，室温避光搅拌反应2h进行包壳，反复包壳3次，氮吹干燥，4℃密封保存；
(3)PBA-mAb的标记
称取12.78mg步骤(2)制备的荧光探针溶于500μL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.34mgDCC，充分溶解；再滴加200μL溶解有4.17mg N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液，室温搅拌反应8h，得到标记溶液；将标记溶液滴加到500μL浓度为l mg/mL的单克隆抗体溶液中，搅拌反应过夜；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲透析3d，得到碳量子点荧光纳米颗粒标记的PBA-mAb溶液，4℃保存。
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