CN109060757A - 一种便携式纸基增强快速检测微生物的拉曼散射方法 - Google Patents

Abstract

一种便携式纸基增强快速检测微生物的拉曼散射方法。本发明公开了一种纸质增强基底快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，包括：提供溶胶溶液；制备纸质增强基底；以及利用纸质增强基底进行拉曼光谱测试；其中所述纸质增强基底的制备包括：将纸质基材利用1％左右的盐酸浸泡过夜，清洗完成后，再用超纯水清洗多次；利用惰性气体吹干清洗后的纸质基材；利用所提供的溶胶溶液来浸泡吹干后的纸质基材；以及将浸泡之后的纸质基材于低温冻存后冷冻干燥，即由此制得纸质增强基底。本发明的纸质增强基底快速检测微生物的表面增强拉曼散射方法集样本富集分离与增强检测信号于一体。

Description

一种便携式纸基增强快速检测微生物的拉曼散射方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，更具体涉及一种快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法。

背景技术

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering,SERS)光谱作为一种常用的分析方法，具有灵敏度高、检测速度快等优点，可以表征分子的指纹振动光谱，实现对样品的无损测量，广泛应用于生物医学、食品安全、环境监测等领域。SERS的灵敏度、稳定性及可重复性与所用的增强基底性能密切相关。目前常用的SERS刚性基底(如玻璃片、硅片等)存在制备过程复杂、成本高、柔性差、不便携带，不利于大规模推广利用的缺点。另外，用于表面增强拉曼散射的溶胶溶液也存在不稳定性以及不方便携带等缺点。

因此，存在对当前的表面增强拉曼散射检测方法进行改进的需求。

发明内容

研究发现，与目前常用的SERS刚性基底相比，纸质基底生产成本低，制作过程环保，前处理简单，便于大规模生产及商业化；同时，纸基具有薄、轻、灵活方便等优点，便于采集和收集样品，可根据实际需要进行裁剪，实现现场检测；另外，与刚性基底相比，纸质基底表面更为粗糙，可形成三维结构，分布在表面的纳米粒子更多，增强效果更佳。因此，利用纸张作为支撑的SERS纸质基底制备的纸增强“抹布”能有效解决刚性基底存在的问题，极大满足未来分析检测领域快速、便携式以及个性化特点。

因此，本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述问题，由此提供一种快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，该方法包括：

提供溶胶溶液；

制备纸质增强抹布；以及

利用纸质增强抹布进行拉曼光谱测试；

其中所述纸质增强抹布的制备包括：

将纸质基材利用1％左右的盐酸浸泡，清洗完成后，再用超纯水清洗多次；

利用惰性气体吹干清洗后的纸质基材；

利用所提供的溶胶溶液来浸泡吹干后的纸质基材；

将浸泡之后的纸质基材于低温下冻存后冷冻干燥，由此制得纸质增强基底。

根据本发明的一个实施方案，其中所述溶胶溶液为金溶胶溶液。

根据本发明的一个实施方案，其中所述纸质基材为滤纸及宜吸附液体的类纸质载体。

根据本发明的一个实施方案，其中所述惰性气体为氮气。

根据本发明的一个实施方案，其中所述溶胶溶液浸泡纸质基材的时间为5h-7h,冻存30min左右，冷冻干燥40min左右。

根据本发明的一个实施方案，其中所述低温下冻存的温度为小于-80℃。

根据本发明的一个实施方案，其中所述金溶胶溶液通过如下方法制备：采用柠檬酸钠还原法将0.05％-0.15％的氯金酸溶液置于温度为105℃-130℃的条件下煮沸，加入浓度为20nM-80nM的柠檬酸钠溶液，煮沸10-40min，制得金溶胶溶液。

根据本发明的一个实施方案，其中所述金溶胶的紫外可见最大吸收峰在530nm左右，平均粒径为50nm左右。

根据本发明的一个实施方案，其中所述微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌以及嗜肺军团菌等。

根据本发明的一个实施方案，其中所述快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法还包括利用罗丹明对所述金溶胶进行增强效果测试。

本发明的纸质增强基底可为纳米粒子提供三维附着支架，起到三维立体增强拉曼信号的作用，其柔韧性可用作“抹布”来采集固态样本表面污染的微生物，纸的过滤功能又可以分离富集液态样本中污染的微生物。纸质增强基底快速检测微生物的表面增强拉曼散射方法集样本富集分离与增强检测信号于一体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的技术方案。

图1为根据本发明一个实施方案的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法的流程示意图。

图2为根据本发明一个实施方案的利用罗丹明作为探针分子对本发明制备的金溶胶的增强效果的灵敏性测试的结果图；

图3为根据本发明一个实施方案的利用罗丹明作为探针分子对本发明制备的金溶胶的增强效果的重现性测试(RSD计算)的结果图；

图4为根据本发明一个实施方案的利用罗丹明作为探针分子对本发明制备的金溶胶的增强效果的稳定性测试的结果图；

图5为根据本发明一个实施方案的利用快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法检测金黄色葡萄球菌的结果图。

图6为根据本发明一个实施方案的利用快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法检测饮用水中微生物的结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

图1为根据本发明一个实施方案的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法的流程示意图。

如图1所示，本发明快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法包括提供用于表面增强拉曼散射的溶胶溶液。溶胶溶液一般可以为例如金溶胶溶液、银溶胶溶液等等。在本实施例中，采用的是金溶胶溶液。

根据本发明的一个实施方案，其中所述金溶胶溶液可以通过如下方法来制备：采用柠檬酸钠还原法，将0.05％-0.15％的氯金酸溶液置于温度为105℃-130℃的条件下煮沸，加入浓度为20nM-80nM的柠檬酸钠溶液，煮沸10-40min，制得酒红色的金溶胶溶液。

可以利用粒度分布测定仪、紫外可见光度计以及透射电镜等可以测定该金溶胶溶液的粒径以及紫外可见最大吸收峰等特征。在一个实施方案中，测得的金溶胶的紫外可见最大吸收峰在530nm左右，平均粒径为50nm左右。

之后进行纸质增强基底(纸质增强抹布)的制备。如图1所示，在本发明中可以选择适当的纸质材料，例如可以是包括滤纸及宜吸附液体的类纸质载体。选用滤纸及宜吸附液体的类纸质载体为SERS基底制备纸基增强基底，纸的主要成分是纤维素，纤维素和水之间有很强的亲和力，并且具有微米级的粗糙度及相互交错的三维多孔结构，为纳米金粒子的附着提供了三维支架；另外，纸具有很好的柔韧性，同时可以起到增强抹布的作用，纸的生物兼容性好，可以生物降解；此外，纸具有很强的亲水特性，水分被快速吸收，可以起到过滤浓缩菌液的作用，也即，本发明的方法可以起到样品的浓缩以及微生物的采样作用，无需单独的微生物培养过程。因此，通过纸增强基底测试细菌可以简单、快捷，并且可以获得更强的效果。

纸质增强基底的制备步骤在附图中包括滤纸及宜吸附液体的类纸质载体的前处理以及纸基增强抹布制备。

更具体地，滤纸及宜吸附液体的类纸质载体的前处理可以包括：裁剪适当的滤纸及宜吸附液体的类纸质载体，方便现场取样。清洗滤纸及宜吸附液体的类纸质载体：使用1％左右的盐酸过夜浸泡清洗，清洗完成后，再用超纯水清洗多次，例如3、4、5次。然后用惰性气体例如氮气吹干滤纸及宜吸附液体的类纸质载体，低温保存以备用。

纸基增强基底制备的可以包括：将适量滤纸及宜吸附液体的类纸质载体平铺于灭菌的培养皿中，倒至10ml-20ml金溶胶浸泡。浸泡的时间可以根据具体情况来确定，例如可以为4-8h，例如5h、6h、7h左右。将浸泡好的滤纸及宜吸附液体的类纸质载体于低温下例如-80℃冰箱中冻存20-30min，再用冻干机冷冻干燥抽真空至其完全干燥，时间例如可以为20min-60min，例如40min左右；装密封袋低温、避光保存，以备用。根据需要，还可以结合环境扫描电镜对纸基上金颗粒分布情况予以表征，例如粒径分布等。

为了验证本发明纸质增强基质(纸质增强抹布)的增强效果，例如可以选用标志物(例如罗丹明)对纸增强抹布进行增强效果测试。

根据本发明的方法，然后利用制备的纸质增强抹布对进行拉曼光谱测试，来测试各种微生物，例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌以及嗜肺军团菌等等。

如图1所示，本发明的测试步骤可以包括例如微生物样品的处理以及微生物液的拉曼增强测试。

下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1：纸质增强基底增强效应测试

采用罗丹明作为探针分子对纸增强抹布进行灵敏性、重现性、稳定性测试。

实验条件：785nm激光器

激光功率为25mW、积分时间为10s、积分次数3次

实验过程：滴加10μL罗丹明(10ppm)于纸增强抹布，设置好实验条件进行测试

实验结果的解释：

实验结果参见图2-4。

如图2所示，结果表明，本发明的纸增强基底对罗丹明有很好的增强效果，证明纸增强抹布具有较高的灵敏性；

如图3所示，通过重复10次实验，计算罗丹明的特征峰610cm^-1、772cm^-1、1359cm^-1、1506cm^-1的相对标准偏差RSD<10％,因此，结果表明本发明的纸增强抹布具有良好的重现性。

如图4所示，通过设置纸基增强基底保存时间条件实验(0d、5d、10d、30d、60d)，实验结果表明，本发明的纸增强基底具有良好的稳定性。

实施例2：金黄色葡萄球菌的检测

利用本发明的增强纸质抹布来检测金黄色葡萄球菌，同时利用没有增强的基底(玻璃片)来作为对比试验。具体实验过程如下：

1、称取MH(B)培养基2.4g，加入100mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121℃高压灭菌15分钟，经高压灭菌后的培养基冷却至50～55℃，打开瓶口棉塞，将培养基倒入已灭菌的平板培养皿内；

2、取金黄色葡萄球菌冻存菌株，划线接种在MH(B)平板上，37℃恒温培养24-48h；

3、取1支Eppendorf管加入0.5-1ml超纯水，挑取单菌落放入Eppendorf管中，制成菌悬液；

4、取10-20μL菌液滴加到纸基增强基底以及对比基底上进行拉曼光谱测试。

结果如图5所示：通过10次重复实验取平均，发现纸增强抹布对金黄色葡萄球菌具有良好的增强效果，金黄色葡萄球菌的拉曼特征峰包括729cm^-1、916cm^-1、1019cm^-1、1067cm^-1、1191cm^-1、1546cm^-1，可以用来做定性分析。

相比之下，没有增强的基底(玻璃片)则根本就不具备检测分析的功能。

实施例3：饮用水中微生物检测(实际样品)

利用本发明的增强纸质抹布来检测饮用水中微生物，具体实验过程如下：

1.取制备好的纸增强材料放置于漏斗上；

2.取饮用水样品10-20ml通过增强纸基底进行过滤浓缩；

3.待纸基增强基底稍微干燥后，在显微镜下找到细菌菌体后，进行标记，对纸基增强抹布进行拉曼光谱测试。

检测过程和结果如图6所示，参考图6，检测结果峰位置为729cm^-1、1067cm^-1、1546cm^-1，依据特征峰指纹图谱，鉴定出是金黄色葡萄球菌，其峰型与金黄色葡萄球菌峰型一致(参见附图5)，峰位置也一致。

本发明纸基增强基底与水之间有很强的亲和力，并且具有微米级的粗糙度及相互交错的三维多孔结构，为纳米粒子例如金粒子的附着提供了三维支架；同时纸质具有很好的柔韧性，同时可以起到增强抹布的作用，纸的生物兼容性好，可以生物降解；此外，纸质具有很强的亲水特性，水分被快速吸收，可以起到过滤浓缩菌液的作用，因此，通过纸增强基底测试细菌可以获得更强的效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，包括：

提供溶胶溶液；

制备纸质增强基底；以及

利用纸质增强基底进行微生物污染拉曼光谱测试；

其中所述纸质增强基底的制备包括：

纸基基材包括滤纸及宜吸附液体的类纸质载体；

将纸质基材利用1％左右的盐酸浸泡，清洗完成后，再用超纯水清洗多次；

利用惰性气体吹干清洗后的纸质基材；

利用所提供的溶胶溶液来浸泡吹干后的纸质基材；

将浸泡之后的纸质基材低温冻存再冷冻干燥，即由此制得纸质增强基底。

2.根据权利要求1所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述溶胶溶液为金溶胶溶液。

3.根据权利要求1所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述纸质基材为滤纸及宜吸附液体的类纸质载体。

4.根据权利要求1所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述惰性气体为氮气。

5.根据权利要求1所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述溶胶溶液浸泡纸质基材的时间为5h-7h。

6.根据权利要求1所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述低温下冻存的温度为小于-80℃。

7.根据权利要求2所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述金溶胶溶液通过如下方法制备：采用柠檬酸钠还原法将0.05％-0.15％的氯金酸溶液置于温度为105℃-130℃的条件下煮沸，加入浓度为20nM-80nM的柠檬酸钠溶液，煮沸10-40min，制得金溶胶溶液。

8.根据权利要求7所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述金溶胶的紫外可见最大吸收峰在530nm左右，平均粒径为50nm左右。

9.根据权利要求1所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，其中所述微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌以及嗜肺军团菌等。

10.根据权利要求2所述的快速检测微生物污染的表面增强拉曼散射方法，还包括利用罗丹明对所述金溶胶进行增强效果测试。