CN109055572A - 用于果实蝇属多目标快速鉴定的引物及方法 - Google Patents

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田志清
朱水芳
张永江
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明涉及实蝇检疫技术，具体涉及一种用于果实蝇属多目标快速鉴定的引物及方法。用于果实蝇属多目标快速鉴定的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述特异性引物能够将所述果实蝇属与按实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、绕实蝇属以及其它双翅目物种区分开。使用所述特异性引物对果实蝇属物种进行鉴定，具有特异性强、灵敏度高、通用性强的优点。

Description

用于果实蝇属多目标快速鉴定的引物及方法
技术领域
本发明涉及实蝇检疫技术，具体涉及一种用于果实蝇属多目标快速鉴定的引物及方法。
背景技术
果实蝇属Bactrocera，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae寡鬃实蝇亚科Dacinae寡鬃实 蝇族Dacini昆虫。在本属已描述的实蝇种类中，约有440种与果实有关。原产于亚洲热带、 澳洲和南太平洋地区；少数种类出现在非洲、欧洲和亚洲的暖温带地区；一些物种由于现代 水果贸易的原因，已经在夏威夷、法属圭亚那和苏里南等地定殖。以成虫在水果、蔬菜的果 实表皮产卵形成孔洞，幼虫在果实内部取食为害，造成果实腐烂或落果，其为害可造成高达 100％的经济损失，不仅对果蔬生产构成严重危害，而且给进出口贸易带来严重影响。
果实蝇属昆虫受到植物检疫和农业部门的高度关注，其入侵防控工作受到高度重视。果 实蝇属昆虫以属为单位全部被列在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，2013 年2月，农业部发布了《国家重点管理外来物种名录(第一批)》(第1897号公告)，该名录 中包括3种实蝇类害虫，其中两种为果实蝇属昆虫，分别为橘小实蝇B.dorsalis和瓜实蝇B. cucurbitae。同时，我国口岸近十年的截获信息显示，在旅客携带物及货物检疫中，截获果实 蝇属昆虫的批次、数量和种类最多。
口岸截获的实蝇多为非成虫态，需经1-2周饲养为成虫后才能被准确鉴定，极大降低了 检疫工作的时效性。随着国际贸易、旅游和交通的迅速发展，我国果实蝇入侵的危险性日益 增加，入侵后极易爆发成灾并导致巨大的经济损失，其全球入侵已引起高度重视，其检疫鉴 定特别是快速鉴定的需求愈发迫切。
近十年来，多种分子生物学技术已应用于实蝇的快速鉴定，例如：DNA条形码技术(DNA Barcoding)、PCR技术、限制性片段长度多态性技术(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性技术(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)以及基因芯片技术等，但从目前已有报道来看，所有研究只针对果实蝇属个别物种建立了快速检 测方法，仍未能完全满足我国进境植物检疫性有害生物名录中以果实蝇属为分类阶元的检测 需求。
建立果实蝇属昆虫多目标快速鉴定技术体系，有利于提高我国国境检疫技术水平，更加 全面有效地防范果实蝇属昆虫的入侵，抑制其定殖和扩散蔓延，保障我国农林生产和生态安 全。
发明内容
为了弥补现有方法只能针对果实蝇属个别物种进行快速检测的不足，本发明提供一种果 实蝇属多目标快速鉴定方法，使用本发明设计的特异性引物对待测样品的基因组DNA进行 PCR检测，从而将果实蝇属与其他重要经济实蝇属及双翅目等近缘物种区分开来。
本发明请求保护的技术方案如下：
用于果实蝇属多目标快速鉴定的特异性引物，其特征在于，上游引物和下游引物的核苷 酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述特异性引物能够将所述果实蝇属与按实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、 绕实蝇属以及其它双翅目物种区分开。
一种果实蝇属多目标快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板，采用所述特异性引物进行PCR，得到扩增产物；
(3)凝胶电泳检测所述扩增产物，若出现206bp的特异性条带，则该样品属于果实蝇 属；反之，则该样品不属于果实蝇属。
优选地，所述PCR的反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，DNA模板1μl，10μM 上游引物1μl，10μM下游引物1μl，ddH2O 9.5μl。
优选地，所述PCR的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃ 延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
一种果实蝇属多目标快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括液态的或粉末状的所述特异性 引物。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应所需的其它通用试剂。
为全面有效地防范果实蝇属昆虫的入侵，我们从GenBank数据库中检索了所有双翅目昆 虫物种的线粒体基因组序列并进行了多序列比对，寻找果实蝇属的保守位点。以保守位点的 核苷酸序列为模板设计了多对引物并对其进行评估，偶然筛选到能够区分果实蝇属和其他重 要经济实蝇属(按实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、绕实蝇属)物种的引物对 TBFdeg/TBR，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的果实蝇属多目标快速鉴定方法，步骤简便易行，能够快速检测非成虫态或 成虫态的样品，整个鉴定过程只需数小时，无需经1-2周饲养为成虫后再鉴定，提高了检疫 工作的效率，不用耗费人力物力对幼虫进行饲养，降低了检疫成本。该方法只能从果实蝇属 物种中扩增出206bp的特异性条带，具有果实蝇属的通用性以及相对于其他重要经济实蝇属 的特异性，且灵敏度高，可检测到浓度低至0.1ng/μl的基因组DNA。
综上，本发明提供的特异性引物及果实蝇属多目标快速鉴定方法，与现有技术相比，具 有以下优势：
(1)简便快速：通过DNA提取、PCR反应、凝胶电泳即可快速鉴定待测样品是否属于果实蝇属物种，不需要将幼虫培养为成虫后再进行检测。
(2)特异性强：所述引物能够区分果实蝇属和其他重要经济实蝇属(按实蝇属、咔实蝇 属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、绕实蝇属)，鉴定结果准确性高。
(3)灵敏度高：本发明方法能够检测到浓度低至0.1ng/μl的基因组DNA。
(4)通用性强：所述方法可检测整个果实蝇属的物种，克服了现有方法只能针对个别实 蝇物种进行检测的局限性，通过一对引物、单次PCR即可鉴定待测样品是否属于果实蝇属。
本发明建立了具有广泛适用性的果实蝇属昆虫多目标快速鉴定技术体系，革新了检疫手 段和措施，为有效防控果实蝇属昆虫的传入和扩散、跨越国外植物检疫技术壁垒、保护我国 农业生产和生态安全提供了强有力的技术支撑。
附图说明
图1.果实蝇属物种通用引物的特异性验证结果图；
其中，泳道1～41分别代表南美按实蝇A.fraterculus、瓜按实蝇A.grandis、墨西哥按实 蝇A.ludens、西印度按实蝇A.obliqua、蒲桃果实蝇B.albistrigata、深黑颜果实蝇B. atrifacies、葫瓜实蝇B.bezziana、杨桃果实蝇B.carambolae、普通果实蝇B.caudata、两带 果实蝇B.cilifera、番石榴果实蝇B.correcta、瓜实蝇B.cucurbitae、异颜果实蝇B.diversa、 橘小实蝇B.dorsalis、何氏华实蝇B.hochii、斯里兰卡果实蝇B.kandiensis、辣椒果实蝇B. latifrons、橘大实蝇B.minax、油橄榄果实蝇B.oleae、锈红果实蝇B.rubigina、印度果实蝇 B.scutellaris、宽带果实蝇B.scutellata、中达果实蝇B.synnephes、南亚果实蝇B.tau、泰国 果实蝇B.thailandica、昆士兰果实蝇B.tryoni、蜜柑大实蝇B.tsuneonis、面包果实蝇B. umbrosa、五指山果实蝇B.wuzhishana、姚氏果实蝇B.yoshimotoi、桃果实蝇B.zonata、枣 实蝇C.vesuviana、地中海实蝇C.capitata、芒果小条实蝇C.cosyra、纳塔耳小条实蝇C. rosa、葫芦寡鬃实蝇D.bivittatus、埃塞俄比亚寡鬃实蝇D.ciliatus、角丝瓜棍腹实蝇D. longicornis、樱桃绕实蝇R.cerasi、苹绕实蝇R.pomonella和ddH2O。
图2.果实蝇属物种通用引物的灵敏度检测结果图(以橘小实蝇为例)；
其中，泳道1～6分别表示浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl 的基因组DNA，泳道7为阴性对照ddH2O。
图3.实蝇科线粒体基因组已知序列的比对图，图中1950-1967bp为上游引物对应的位置；
图4.实蝇科线粒体基因组已知序列的比对图，图中2135-2155bp为下游引物对应的位置；
图5.实蝇科线粒体基因组已知序列的比对图，不包含引物对应的位置；
图3-5中，ETE_MITOCHON为小条实蝇属物种，KC355248.1为泽兰实蝇，其余为果实蝇属物种。
图6.部分重要经济实蝇属物种的线粒体基因的序列比对图，图中矩形框显示的是上游引 物对应的位置；
图7.部分重要经济实蝇属物种的线粒体基因的序列比对图，图中矩形框显示的是下游引 物对应的位置；
图6和7中，ALUDENS1为按实蝇属物种，BBDORSALIS1为果实蝇属物种， CERATITIS_CAPITATAAJ242872、CERATITIS_COSYRAJTB04512和CERATITIS_ROSA 为小条实蝇属物种，CARPOMYA_VESUVIANA1为咔实蝇属物种， DACUS_BIVITTATUSMVTBI092-08和D_ECLIPSIS.TXT为寡鬃实蝇属物种，RCERASI1和 RPOMONELLA1为绕实蝇属物种；以上物种的线粒体基因序列的一致性为86.75％。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步详细说明，需要声明的是，下述实施方式仅作为解 释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。
生物材料
表1列出的重要经济实蝇属物种为供试实蝇样品，均保存在中国检验检疫科学研究院。 所有样品置于无水乙醇中，-20℃保存备用。
表1供试实蝇样品种类
上述实蝇属物种记载于已知文献White,I.M.and Elson-Harris,M.M.FruitFlies of Economic Significance:Their Identification and Bionomics.(CABInternational,Wallingford, 1992).以及Drew,R.A.I.and Romig,M.Tropical FruitFlies of South-East Asia(Tephritidae: Dacinae).(CAB International,Wallingford,2013).中。
上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于必 要的验证试验。
主要试剂
2×Taq PCR MasterMix，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北 京)有限公司。
下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法 配制而得或商购获得，规格为实验室纯级；未特别说明的实验方法均为本领域常规方法，可 参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual， 2001)，或制造厂商说明书。
实施例1.果实蝇属物种通用引物的设计
在GenBank数据库中检索所有双翅目昆虫物种的线粒体基因组序列(检索使用的关键词 complete mitochondrial genome Diptera)，共计146条序列，其中包括16种实蝇科昆虫线粒体 基因组序列。双翅目昆虫线粒体基因组序列长度约为20,000bp。用DNAMAN软件对获得的 所有双翅目昆虫物种的线粒体基因组序列进行多序列比对，结果表明，实蝇科物种的线粒体 基因组序列的一致性高达87.08％(如图3-5)。此外，按实蝇属、咔实蝇属、寡鬃实蝇属和绕 实蝇属的线粒体基因组序列在本发明开展时还未公开，因此，要获得区分果实蝇属物种与其 他重要经济实蝇属(按实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、绕实蝇属)物种的特 异性引物相当困难。部分重要经济实蝇属物种的线粒体基因的序列比对图如图6和图7所示。
在果实蝇属物种的线粒体基因组序列中，发明人偶然寻找到可特异性地区分果实蝇属与 其他重要经济实蝇属(按实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、绕实蝇属)物种、 其他双翅目物种的保守位点(例如橘小实蝇B.dorsalis，其线粒体基因组序列的GenBank编 号为DQ845759，保守位点的位置为：1894bp-2099bp)。在该位点人工设计引物，利用Oligo 软件对引物进行评估。然后按照如下条件进行引物筛选：(1)在所有果实蝇属物种中能够扩 增出目的片段；(2)在其它重要经济实蝇属、其他双翅目物种中不能扩增出目的片段。
筛选到的引物及其扩增片段的长度如表2所示。为了使引物在果实蝇属物种中具有通用 性，将上游引物TBFdeg设计为简并引物，引物序列中D表示A/G/T，H表示A/C/T，W表示A/T。将上下游引物序列送生物公司进行引物合成，合成的上游引物TBFdeg为引物混合物， 包含了各种可能的上游引物序列，下游引物的序列唯一。
表2特异性鉴定果实蝇属物种的通用引物
实施例2.果实蝇属物种多目标快速鉴定体系的建立
1.DNA提取
利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)分别提 取表1所列的40个单头实蝇样品(非成虫态或者成虫态均可)的基因组DNA，具体操作流程参照厂商说明书，用于后续的引物验证。
2.引物通用性和特异性验证
表1中的果实蝇属物种用于验证引物TBFdeg/TBR在果实蝇属中的通用性，其它实蝇属 物种用于验证引物TBFdeg/TBR对果实蝇属的特异性。
以基因组DNA为模板(浓度为0.1-100ng/μl)，利用所设计的引物进行PCR扩增。上游 引物为简并引物，下游引物为特异性引物，需要不断调整PCR反应试剂用量(DNA模板、引物在体系中的终浓度)以及反应条件(退火温度、时间、循环数)，以获得最佳的通用性和特异性。
扩增反应结束后，取5μl PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，EB染色15 分钟，在紫外灯下观察结果。
如图1所示，泳道1-4为按实蝇属物种，泳道5-31为果实蝇属物种，泳道32为咔实蝇属物种，泳道33-35为小条实蝇属物种，泳道36-38为寡鬃实蝇属物种，泳道39-40为绕实蝇属物种，泳道41为阴性对照ddH2O。结果表明，引物对TBFdeg/TBR在标准的PCR反应体 系和反应条件下，对且仅对果实蝇属物种发生阳性反应，产生特异性目的条带，对其余经济 实蝇物种均为阴性反应，无特异性条带产生。
3.灵敏度检测
将提取的40个果实蝇属物种的基因组DNA分别用TE缓冲液进行系列稀释，得到6个梯度的稀释液，其基因组DNA浓度分别为：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、 0.001ng/μl。分别以每种稀释液为模板(水为阴性对照)，用上述引物对TBFdeg/TBR分别对 不同浓度的模板DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件同上。
扩增反应结束后，取5μl PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，EB染色15 分钟，在紫外灯下观察结果。
结果表明，对40个果实蝇属物种的基因组DNA，本发明的方法可检测的DNA模板浓度 均可达到0.1ng/μl，对部分物种的检测灵敏度可达到0.01ng/μl。以橘小实蝇为例，各稀释液 的PCR扩增产物的电泳结果如图2所示，泳道1～6分别表示浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、 0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl的基因组DNA，泳道7为阴性对照ddH2O。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 用于果实蝇属多目标快速鉴定的引物及方法
<130> P180475/JYJ
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于果实蝇属多目标快速鉴定的上游引物TBFdeg
<400> 1
ggdacagght gaacdgtw 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于果实蝇属多目标快速鉴定的下游引物TBR
<400> 2
gttaatacaa cagctcaaac g 21

Claims (6)

1.用于果实蝇属多目标快速鉴定的特异性引物，其特征在于，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述特异性引物能够将所述果实蝇属与按实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属、绕实蝇属以及其它双翅目物种区分开。
2.一种果实蝇属多目标快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物进行PCR，得到扩增产物；
(3)凝胶电泳检测所述扩增产物，若出现206bp的特异性条带，则该样品属于果实蝇属；反之，则该样品不属于果实蝇属。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，DNA模板1μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，ddH2O 9.5μl。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。
5.一种果实蝇属多目标快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括液态的或粉末状的权利要求1所述的特异性引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应所需的其它通用试剂。
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