CN109053518A - 一种南瓜中叶黄素的提取方法及提取的叶黄素的应用 - Google Patents

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CN109053518A CN201810998208.5A CN201810998208A CN109053518A CN 109053518 A CN109053518 A CN 109053518A CN 201810998208 A CN201810998208 A CN 201810998208A CN 109053518 A CN109053518 A CN 109053518A
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Abstract

本发明公开了一种南瓜中叶黄素提取方法及其应用，采用超声辅助溶剂提取法，利用超声波产生巨大的压力，使南瓜细胞壁瞬间破碎，超声波机械效应和热效应加速细胞内容物的释放、溶解，缩短提取时间，并且加速皂化反应，缩短叶黄素的制备时间，避免长时间制备导致叶黄素分解，从而提高提取率；采用乙酸乙酯和无水乙醇为提取剂替换传统提取剂四氢呋喃、丙酮、石油醚，提高了叶黄素制备的安全性；而且南瓜种植面积广，价格经济，叶黄素含量丰富，相比于叶黄素的常用提取材料万寿菊，南瓜来源方便易得，便于存储，生产成本低；运用本发明提取的南瓜叶黄素的提取率可达83.22％，远远高于现有技术中的植物叶黄素提取率，极具开发价值。

Description

一种南瓜中叶黄素的提取方法及提取的叶黄素的应用
技术领域
本发明属于功能食品制备技术领域，更具体的说是涉及一种南瓜中叶黄素的提取方法及提取的叶黄素的应用。
背景技术
叶黄素又名“植物黄体素”，是一种天然类胡萝卜素类色素，广泛存在于蔬菜、水果、花卉等植物及某些藻类生物中。大量临床研究表明，叶黄素是组成人眼视网膜黄斑区的主要成分，它能吸收对视网膜有损害作用的蓝紫光，对视觉有保护作用；同时叶黄素能抑制活性氧自由基的活性，阻止自由基对细胞的破坏，具有特定的抗氧化性，有预防白内障、动脉硬化等功效，在预防癌变发生、延缓癌症发展等方面也起着重要作用。天然叶黄素具有色泽鲜艳、着色力强、营养丰富无副作用等优点，越来越得到大众的青睐。现在市场上流行将一定量叶黄素添加到食品中制成“叶黄素食品”，可预防眼类及因器官衰老引起的一系列疾病。因此，叶黄素作为一种新型保健食品添加剂，在保健食品加工上将有广阔的开发前景。
现有技术中大多是从万寿菊花或柑橘皮中提取叶黄素，如公开号为CN106893351A的中国发明专利公开了一种柑橘皮叶黄素的提取方法，以四氢呋喃为提取溶剂；如公开号为CN106928112A的中国发明专利公开了一种柚子皮叶黄素的提取方法，以四氢呋喃为提取溶剂；四氢呋喃提取剂具有一定的毒性，不利于操作者的健康，且会在成品叶黄素中残留，影响食用健康；公开号为CN104478774A的中国发明专利公开了一种以万寿菊鲜花为原料提取叶黄素的方法，皂化温度为55～85℃，时间2.5～5h；公开号为CN101402597A的中国发明专利公开了一种叶黄素的提取工艺，皂化温度为50～70℃，叶黄素对光、热极不稳定，高温和持续光照会导致叶黄素分解，提取率降低。上述专利中所采用的技术方案或不能保证安全性，或不能保证叶黄素的提取率，具有很大的弊端。
南瓜作为一种天然的保健食品，其适应环境的能力强，栽培技术简单且成熟产量高，重要的是南瓜中叶黄素及叶黄素酯类化合物含量很高，极具开发价值，并且中国为南瓜种植大国，南瓜来源广成本低，具有良好的经济价值。
结合上述现有技术问题分析，如何提供一种提取率高且工艺简单无毒害的南瓜中叶黄素的提取工艺，是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种采用乙酸乙酯和无水乙醇作为提取剂以及超声辅助皂化的南瓜中叶黄素的提取工艺，超声提取法大大缩短了叶黄素提取及皂化时间，减少叶黄素光照及氧化分解，采用乙酸乙酯和无水乙醇为提取剂一定程度上提高了叶黄素制备的安全性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种南瓜叶黄素的提取方法，包括以下步骤：
(1)将南瓜洗净去皮去籽后低温烘干，然后粉碎过筛得南瓜粉；
(2)将所述步骤(1)中的南瓜粉置于提取剂中，然后超声提取，得提取液；
(3)将所述步骤(2)中的提取液抽滤后离心，取上清液；
(4)将所述步骤(3)中所得上清液低温蒸发浓缩干燥，得固留物叶黄素酯；
(5)将所述步骤(4)中所得叶黄素酯与氢氧化钾甲醇溶液置于超声波反应器中皂化反应，反应结束后加入双蒸水，然后用正己烷萃取，弃下层液后用无水硫酸钠去除上层液中水分，低温蒸发浓缩干燥即得叶黄素。
优选的，所述步骤(1)中的低温烘干为在温度为30～50℃条件下烘干24～48h。
上述优选技术方案的有益效果是：低温烘干温度选择30～50℃下烘干24～48h可以保证南瓜中叶黄素不被高温破坏同时保证南瓜的烘干效率，以防烘干时间过长导致南瓜变质，叶黄素遭到破坏。
优选的，所述步骤(1)中所得南瓜粉粒径为60～80目。
上述优选技术方案的有益效果是：南瓜粒径低于60目，会导致扩散面积小，叶黄素溶出率降低；南瓜粒径大于80目，比表面积减小，叶黄素提取率降低，所以将干燥后的南瓜粉碎至60～80目，保证叶黄素具有最佳提取效果。
优选的，所述步骤(2)中的提取剂为乙酸乙酯和无水乙醇的混合液，两者体积比乙酸乙酯：无水乙醇＝1:1～3:1。
上述优选技术方案的有益效果是：提取剂采用乙酸乙酯和无水乙醇，无毒害，增加反应过程的安全性且制品叶黄素中无毒害物质残留；混合溶剂在体积比在1:1～3:1的极性范围时，叶黄素具有最佳溶解效果，且脂溶性杂质最少。
优选的，所述步骤(2)中南瓜粉与提取液的料液比为1:40～1:80g/mL。
上述优选技术方案的有益效果是：随着提取剂用量的增大，物料与溶剂的接触面浓度差增加、渗透压增大，叶黄素更容易浸出，当溶剂用量达到一定时，提取剂中叶黄素的量达到饱和，故叶黄素的含量不再发生变化，此时再增加提取剂会造成原料的浪费，液比为1:40～1:80(g/mL)为最佳料液比。
优选的，所述步骤(2)中的超声提取温度为20～50℃，超声功率为125～225W，提取时间为20～60min。
上述优选技术方案的有益效果是：提取温度低于20℃时不利于叶黄素在溶剂中分散，提取温度高于50℃则会导致叶黄素的分解和叶黄素的一些活性成分被破坏，提取温度为20～50℃时叶黄素提取率最佳；
当超声功率低于125W时叶黄素提取不充分，而超声功率大于225W，会导致叶黄素异构化，破坏叶黄素结构，所以提取功率设定为125～225W，保证具有最佳的叶黄素提取率；
当提取时间低于20min时南瓜中的叶黄素不能充分溶出，提取不完全，当提取时间过长，不仅溶剂中叶黄素含量不再增加，而且使叶黄素的氧化量增加减少叶黄素得率，故提取时间为20～60min，保证叶黄素具有最高提取率。
优选的，所述步骤(3)中离心为在4000～5000r/min的转速下离心10～15min。
上述优选技术方案的有益效果是：离心可除去提取液中的残留南瓜粉以及不溶性杂质。
优选的，所述步骤(4)中低温蒸发干燥采用旋转蒸发器进行，蒸发浓缩干燥温度为30～50℃。
上述优选技术方案的有益效果是：选取合适的温度范围，保证上清液干燥的同时避免高温干燥或低温长时间干燥破坏叶黄素以及叶黄素中的营养物质。
优选的，所述步骤(5)中氢氧化钾甲醇溶液的浓度是10～40％，皂化反应温度为35～55℃，皂化反应超声功率为125～225W，皂化时间为2～8h。
上述优选技术方案的有益效果是：氢氧化钾甲醇溶液浓度过低，使反应过程中不能提供更多的OH-，不利于皂化反应的进行，而高浓度的氢氧化钾甲醇溶液会制造强碱环境，从而导致游离叶黄素分解，降低叶黄素得率，所以氢氧化钾甲醇溶液的浓度限定为10～40％，保证皂化反应顺利进行同时具有更高的叶黄素得率；
皂化温度过低不利于叶黄素酯在皂化体系中分散，而皂化温度过高则会导致叶黄素的分解和叶黄素的一些活性成分被破坏，所以皂化温度限定为35-55℃，保证叶黄素酯充分分散反应，具有更高的叶黄素得率；
当皂化功率低于125W时叶黄素酯皂化不充分，而皂化功率过大，会导致叶黄素异构化，破坏叶黄素结构，所以提取功率为125～225W最佳；
皂化反应是非均相反应，反应发生在两相液面间，短时间内无法反应完全，随着皂化时间的延长，产品中游离叶黄素的含量首先不断增加，8h后逐渐下降，因为皂化8h后，几乎所有的叶黄素均以游离状态存在，延长皂化时间使叶黄素的氧化量增加，从而减少了得率，将皂化反应时间限定在2～8h，保证完全反应的同时保证叶黄素得率。
优选的，该提取工艺整个过程均在遮光条件下进行。
上述优选技术方案的有益效果是：叶黄素在光照条件下结构会发生变化，遮光可保证叶黄素结构不被破坏。
本发明的另一个目的在于提供一种南瓜中提取的叶黄素的应用，将其应用于抗氧化添加剂。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有下述优点：
(1)南瓜种植面积广，价格经济，叶黄素含量丰富，相比于叶黄素的常用提取材料万寿菊，南瓜来源方便易得，便于存储，资源丰富，生产成本低；
(2)超声辅助溶剂提取法利用超声波产生巨大的压力，使南瓜细胞壁瞬间破碎，同时超声波产生的机械效应和热效应加速了细胞内容物的释放、溶解，缩短了提取时间，并且加速皂化反应速度，大大缩短叶黄素的制备时间，避免长时间制备导致叶黄素分解，从而提高提取率；
(3)采用乙酸乙酯和无水乙醇为提取剂替换传统提取剂四氢呋喃、丙酮、石油醚，一定程度上提高了叶黄素制备的安全性；
(4)每100g鲜南瓜中含叶黄素0～17mg，经计算相当于每克南瓜粉中原来含有叶黄素0～2.55mg/g，运用本发明提取的南瓜叶黄素的提取率可达83.22％，远远高于现有技术中的植物叶黄素提取率，极具开发价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明提取时间对南瓜叶黄素提取率影响图；
图2为本发明提取功率对南瓜叶黄素提取率影响图；
图3为本发明提取温度对南瓜叶黄素提取率影响图；
图4为本发明料液比对南瓜叶黄素提取率影响图；
图5为本发明功率和温度交互作用对叶黄素提取量影响的响应图；
图6为本发明功率和料液比交互作用对叶黄素提取量影响的响应图；
图7为本发明温度和料液比交互作用对叶黄素提取量影响的响应图；
图8为本发明提取的叶黄素样品高效液相色谱图；
图9为本发明提取的叶黄素标准曲线图；
图10为本发明提取的叶黄素对羟基自由基的清除曲线图；
图11为本发明提取的叶黄素对超氧阴离子的清除曲线图；
图12为本发明提取的叶黄素对DPPH的清除曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种南瓜叶黄素的提取方法，包括以下步骤：
(1)将南瓜洗净去皮去籽后在温度为30～50℃条件下烘干24～48h，然后粉碎过60-80目筛得南瓜粉；
(2)将步骤(1)中的南瓜粉置于乙酸乙酯和无水乙醇的混合液提取剂中，其中体积比乙酸乙酯：无水乙醇＝1:1～3:1，南瓜粉与提取液的料液比为1:40～1:80g/mL，然后在功率为125～225W、温度为20～50℃条件下超声提取20～60min，得提取液；
(3)将步骤(2)中的提取液抽滤后4000～5000r/min的转速下离心10～15min，取上清液；
(4)将步骤(3)中所得上清液在旋转蒸发器中30～50℃蒸发浓缩干燥，得固留物叶黄素酯；
(5)将步骤(4)中所得叶黄素酯与浓度为10～40％氢氧化钾甲醇溶液置于超声波反应器中皂化反应，反应温度为35～55℃，超声功率为125～225W，反应2～8h，结束后加入双蒸水，然后用正己烷萃取，弃下层液后用无水硫酸钠去除上层液中水分，在旋转蒸发器中30～50℃蒸发浓缩干燥，即得叶黄素。
为了进一步优化上述技术方案，该提取工艺整个过程均在遮光条件下进行，避免叶黄素结构被光照破坏。
实施例1
将南瓜洗净去皮去籽后在温度为30～50℃条件下烘干24～48h，然后粉碎过60-80目筛得南瓜粉；
1.准确称取南瓜粉1g(5份)，按1:60的料液比加入比例为2:1的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶剂，置于超声波清洗器中，提取温度为30℃，提取功率为150W，考察提取时间分别为20min、30min、40min、50min、60min对南瓜叶黄素提取效果的影响，结果如图1所示。
2.准确称取南瓜粉1g(5份)，按1:60的料液比加入比例为2：1的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶剂，置于超声波清洗器中，提取温度为30℃，提取时间为40min，考察提取功率分别为125W、150W、175W、200W、225W对南瓜叶黄素提取效果的影响，结果如图2所示。
3.准确称取南瓜粉1g(5份)，按1:60的料液比加入比例为2:1的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶剂，置于超声波清洗器中，提取时间为40min，提取功率为150W，考察提取温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃对南瓜叶黄素提取效果的影响，结果如图3所示。
4.准确称取南瓜粉1.00g(5份)，加入比例为2:1的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶剂，置于超声波清洗器中，提取时间为40min，提取功率为150W，提取温度为40℃，考察料液比分别为1:40g/mL、1:50g/mL、1:60g/mL、1:70g/mL、1:80g/mL对南瓜叶黄素提取效果的影响，结果如图4所示。
由图1～4测得的数据可知，在其它条件不变的情况下，提取时间约为40min、提取超声功率约为150W、提取温度约为40℃、料液比约为1:60g/mL时，具有最高的提取率。
实施例2
为了优化提取条件，根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基础上，共设计17个试验点，12个分析点，5个零点以估计误差，每次精密称取1.00g南瓜粉进行试验，选取提取功率(A)、提取温度(B)、料液比(C)，3个因素进行响应曲面分析来确定影响叶黄素提取率的主要因素。采用响应面分析法分析试验结果，以总黄酮提取量为响应值，对实验数据进行二次多项式回归拟合，得回归方程为：
Y＝-35.95392+0.079193A+0.48855B+0.69226C-4.87100×10-4AB-6.55800×10- 4AC-1.14950×10-3BC-5.75800×10-5A2-4.05537×10-3B2-4.2816310-3C2
由Design-Expert8.0.4软件分析，可得南瓜叶黄素提取的最优条件。结果如图5～7所示。如图5～7显示，南瓜叶黄素的最佳提取条件为：提取功率为150W，提取温度为42.21℃，料液比为1：63.69mg/mL，叶黄素提取量为2.308mg/g。
实施例3
在实施例1和2确定的最佳提取条件下，取提取功率为150W，提取温度为42℃，料液比为1：63mg/mL，在此条件下进行3次平行提取试验，3次提取结果如下表所示：
上述结果显示，在最佳提取条件下，南瓜平均叶黄素提取量为2.117mg/g，与实施例2模型预测值的误差为8.28％，说明该方程与实验情况拟合较好。
对比例1
准确称取南瓜粉1g，以四氢呋喃-无水乙醇(3:1)为萃取溶剂，在萃取温度70℃、萃取时间30min、料液比1:30mg/mL的条件下，萃取南瓜叶黄素，平行3次实验，叶黄素提取量平均值为1.648mg/g。
实施例4
根据文献记载，以每克南瓜粉中叶黄素的最高含量为2.55mg为标准，计算实施例3的3次平行提取试验中南瓜的平均叶黄素提取率与对比例1中叶黄素的提取率，结果如下表所示：
上述结果显示，采用本发明的最优提取条件，南瓜中的叶黄素提取率可达83.22％，且3次试验的提取率均优于对比例1中提取方法的平均值，说明采用本发明提供的工艺方法可获得高叶黄素提取率。
实施例5
高效液相色谱法测定提取物中的叶黄素的纯度：
1)HPLC样品的制备：将皂化后的叶黄素用4mL甲醇复溶，0.45μm微孔滤膜过滤备用。
2)色谱条件：色谱柱ODS C18柱，流动相为甲醇(100％)，流速0.5ml/min，检测波长450nm，柱温30℃，进样量10μL。
3)叶黄素标准曲线绘制：取5mg叶黄素标准品用甲醇溶解，定溶于25mL棕色容量瓶，混匀，制成质量浓度为0.2mg/mL的标准液。分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL标准液于10mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，制成浓度0.02、0.04、0.06、0.08、1mg/m的系列标准溶液，按照HPLC色谱条件，每个系列浓度进样3次，以叶黄素系列标准液质量浓度为横坐标，相应吸收峰面积为纵坐标，绘制反式叶黄素标准曲线，得到回归方程y＝8479710.00x+116384.00，R2＝0.9936。
南瓜叶黄素的吸收光谱如图8所示，叶黄素标准曲线如图9所示，由图8和图9，经内标法鉴定保留时间为10.15的吸收峰为南瓜叶黄素吸收峰，经计算，南瓜粉提取物中叶黄素纯度为91.39％。
实施例5
叶黄素的抗氧化能力测试
1.清除羟基自由基的能力测定
在具塞试管中分别加入6mmol/LFeSO4溶液2mL、H2O2溶液2mL、不同浓度叶黄素溶液(0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL)2mL，加入试管中摇匀，静置10min后加入6mmol/L水杨酸2mL，摇匀，静置30min后于510nm处测定吸光度值，测试结果如图10所示。
2.清除超氧阴离子的能力测定
在具塞试管中加入0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)4.5mL，30℃水浴预热20min后依次加入不同浓度叶黄素溶液(0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL)2mL和0.46mmol/L邻苯三酚溶液2mL混匀，30℃水浴反应5min，反应完成后，加入8mol/L盐酸溶液2mL，以Tris-HCl缓冲溶液作为对照品，在325nm处测定吸光度值，测试结果如图11所示。
3.清除DPPH的能力
将1mL2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液和1mL不同浓度叶黄素溶液(0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL)混匀加入具塞试管中，暗处反应25min后于515nm处测定其吸光度值，测试结果如图12所示。
由图10～12可知，随着叶黄素浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强，也表明本发明制得的叶黄素具有良好的抗氧化能力，具有良好的应用前景。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将南瓜洗净去皮去籽后低温烘干，然后粉碎过筛得南瓜粉；
(2)将所述步骤(1)中的南瓜粉置于提取剂中，然后超声提取，得提取液；
(3)将所述步骤(2)中的提取液抽滤后离心，取上清液；
(4)将所述步骤(3)中所得上清液低温蒸发浓缩干燥，得固留物叶黄素酯；
(5)将所述步骤(4)中所得叶黄素酯与氢氧化钾甲醇溶液置于超声波反应器中皂化反应，反应结束后加入双蒸水，然后用正己烷萃取，弃下层液后用无水硫酸钠去除上层液中水分，低温蒸发浓缩干燥即得叶黄素。
2.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的低温烘干为在温度为30～50℃条件下烘干24～48h，所得南瓜粉粒径为60～80目。
3.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中的提取剂为乙酸乙酯和无水乙醇的混合液，两者体积比乙酸乙酯：无水乙醇＝1:1～3:1。
4.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中南瓜粉与提取液的料液比为1:40～1:80g/mL。
5.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中的超声提取温度为20～50℃，超声功率为125～225W，提取时间为20～60min。
6.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心为在4000～5000r/min的转速下离心10～15min。
7.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中低温蒸发干燥采用旋转蒸发器进行，蒸发浓缩干燥温度为30-50℃。
8.根据权利要求1所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中氢氧化钾甲醇溶液的浓度是10～40％，皂化反应温度为35～55℃，皂化反应超声功率为125～225W，皂化时间为2～8h。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种南瓜中叶黄素的提取方法，其特征在于，该提取工艺整个过程均在遮光条件下进行。
10.一种权利要求1～9所述的南瓜中叶黄素的应用，其特征在于，应用于抗氧化添加剂。
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