CN109045353B - 一种锌/镁复合mof涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，本发明首先通过碱热处理在钛材表面获得二氧化钛纳米片结构；然后，将碱热处理样本依次置于稀盐酸和硝酸镁溶液中获取钛酸镁纳米片涂层；最后将样本放入含不同比例2,5‑二羟基对苯二甲酸、硝酸锌和硝酸镁的高压反应釜中，125℃条件下反应24h；所获得系列锌/镁复合MOF涂层修饰样本均呈现出不同程度的抗菌、抗炎和促成骨特性，其中AT‑Mg/Zn3样本具备最优越的综合性能，其具有良好的临床应用前景。

Description

一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材 料的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体是一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法。
背景技术
作为骨科及牙科常见植入材料，钛材已被证明具备优越的机械性能及生物相容性等，但材料自身的生物学惰性也将显著性地阻碍植入体与周围骨组织间的有效整合。研究已表明，钛材与骨组织间多为“机械缩合”，极易发生植入体的松动或移位。上述不良现象在细菌感染发生时更为常见。
随着手术无菌技术的发展，术后早期细菌感染率已显著地降低，但植入体介导的细菌感染仍较为常见。研究表明，少量细菌黏附于植入体表面后可快速增殖，进而形成致密性菌膜后阻碍植入体表面新生骨组织形成。同时，该类菌膜可保护内部细菌免受外源性抗生素或抗菌物质伤害。所以细菌感染后的4到6小时已被认为是感染治疗的关键时期。另外，侵入性细菌将较大程度上激活宿主自身免疫系统，诱导局部炎症发生。过量分泌性炎症因子也已被证明可通过刺激破骨细胞形成、阻碍成骨分化及诱发成熟骨细胞凋亡等途径阻碍植入体周围早期骨整合。
近年来，金属有机骨架材料(MOFs)越来越受到研究者的关注。 MOFs材料具备规则的多孔结构，已被证明拥有良好的气体吸附及光催化特性等，其也可被作为药物载体用于抗菌或抗肿瘤药物的装载。
另外，研究结论也显示出，常见MOFs材料在水溶液稳定性较差，水分子可通过配位键干扰等诱发材料快速降解，且其降解速率在酸性条件下更为显著。材料降解所释放的金属离子及有机配体等可赋予材料特定的生物学性能。
众所周知，金属镁(Mg)活泼性强于过渡金属锌(Zn)，其更容易失去电子形成Mg2+，因此Zn2+被Mg2+具有更强的接受电子能力。由此可推测出，Zn2+更容易接受有机配体配位原子氧给出的孤对电子，形成更稳定的配位键(即Zn-MOF稳定性强于Mg-MOF)。
然而，通过金属离子细胞生物相容性比较可发现，成骨细胞及间充质干细胞等对Mg2+耐受浓度远大于Zn2+。
因此，现有技术中需要一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/ 促成骨型钛基植入材料的制备方法。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法。
为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种锌/镁复合 MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为1～10M；
所述温度范围为40～100℃；所述腐蚀时间为12～48h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.01～0.1M；
所述浸泡时间为10～60min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.01～0.1M；
所述浸泡时间为10～60min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行浸泡清洗处理，烘干后备用；
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF 涂层；
3.1)在搅拌状态下，将2,5-二羟基对苯二甲酸溶于电解液溶剂中后，再将硝酸镁和硝酸锌加入其中，得到电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为(54～74)︰ (0～10)︰(0～10)；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为(0～1.0) ︰(54～74)；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为(0～0.2) ︰(54～74)；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为(0.2～1.0)︰(54～74)；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到目标产物。
进一步，所述步骤1.1)中钛片的预处理过程为：
1.1.1)使用砂纸将钛片进行打磨抛光；
所述砂纸的目数为400～2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为5～20min，频率为30～50KHz。
进一步，所述步骤1.3)中超声清洗过程中：时间为0.5～2min，频率为30～50KHz；
所述烘干过程中：温度为40～100℃，时间为6～12h。
进一步，所述步骤2.3)中超声清洗过程中：时间为0.5～2min，频率为30～50KHz；
所述烘干过程中：温度为40～100℃，时间为6～12h。
进一步，所述步骤3.1)中磁力搅拌过程中：速率为100～200rpm，时间为2～10min。
一种通过权利要求1～5任一项所述的制备方法所获得的锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料。
本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明具有以下优点：
1)本发明在钛材表面构建锌/镁复合MOF涂层，提高涂层稳定性、同时降低材料的正常细胞毒性，该涂层将赋予钛植入体优越的抗菌、抗炎和促成骨性能；
2)本发明中的制备方法重复性好、操作简便、可控性强；
3)本发明所获得系列锌/镁复合MOF涂层修饰样本具备优越的综合性能，其具有良好的临床应用前景，在骨移植技术中有重要的研究价值和临床意义。
附图说明
图1为不同样本的表面扫描电镜(SEM)图；
图2为不同样本的X射线衍射(XRD)图谱；
图3为不同材料表面元素含量统计图；
图4为PBS溶液中不同材料表面涂层稳定性光学图片；
图5为不同材料表面金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的SEM图；
图6为巨噬细胞及成骨细胞于正常[Presoak(0d)]或预浸泡 3d[Presoak(3d)]处理后，各样本表面培养3天后的细胞活性图，置信区间为99.5％(*p<0.05)和99.9％(**p<0.01)；
图7为巨噬细胞直接于各样本表面培养3天后的抗炎因子 (IL-10和IL-1ra)及促炎因子(IL-1β和TNFα)基因表达，置信区间为99.5％(*p<0.05)和99.9％(**p<0.01)；
图8为成骨细胞于预浸泡3d处理后各样本表面培养3天后的碱性磷酸酶活性定量数据统计图，置信区间为99.9％(**p<0.01)；
图9为成骨细胞于预浸泡3d处理后各样本表面培养3天后的矿化染色的定量数据统计图，置信区间为99.9％(**p<0.01)；
图10为术后3d动物感染模型中，不同植入体表面或周围骨髓腔内金黄色葡萄球菌的压印平板或涂布平板图片；
图11为术后3d动物感染模型中，不同植入体表面或周围骨髓腔内金黄色葡萄球菌的抑菌率统计图，置信区间为99.9％ (**p<0.01)；
图12为术后3d动物感染模型中，不同植入体髓腔段和骨骺段周围骨组织苏木精-伊红(HE)染色示意图，白色箭头部分为单核细胞聚集部位(代表局部炎症发生)；
图13为术后28d动物正常及细菌感染模型中，不同植入体髓腔段和骨骺段周围(0.6mm)新生骨组织微计算机断层扫描(Micro-CT) 三维图片；
图14为术后28d动物正常及细菌感染模型中，不同植入体髓腔段和骨骺段周围(0.6mm)新生骨体积统计图，置信区间为99.5％(*p<0.05)和99.9％(**p<0.01)。
图中：图1A为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；图1B为腐蚀样本的表面扫描电镜(SEM)图；图1C为钛酸镁预化处理样本的表面扫描电镜(SEM)图；图1D为样本AT-Mg/Zn1的表面扫描电镜(SEM)图；图1E为样本AT-Mg/Zn2的表面扫描电镜(SEM) 图；图1F为样本AT-Mg/Zn3的表面扫描电镜(SEM)图；图1G为样本AT-Mg/Zn4的表面扫描电镜(SEM)图；图1H为样本AT-Mg/Zn5 的表面扫描电镜(SEM)图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1：
AT-Mg植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.1.1)使用砂纸将钛片(Ti)进行打磨抛光；如图1A所示，即为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；
所述砂纸的目数为400，1000和2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为10min，频率为40KHz。
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为5M；
所述温度范围为80℃；所述腐蚀时间为24h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM)图如图1B所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本(AT)浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM) 图如图1C所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建Mg-MOF涂层(AT-Mg)；
3.1)配置含有硝酸镁和2,5-二羟基对苯二甲酸的电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为65︰4.5︰4.5；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.356︰ 65；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为0.167︰65；
所述电解液配置如下：2,5-二羟基对苯二甲酸首先溶于电解液混合溶剂后，加入硝酸镁；
所述磁力搅拌条件如下：速率为150rpm，时间为5min；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到样本AT-Mg，样本AT-Mg的表面扫描电镜(SEM)图如图1C所示。
实施例2：
AT-Mg/Zn1植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.1.1)使用砂纸将钛片(Ti)进行打磨抛光；如图1A所示，即为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；
所述砂纸的目数为400，1000和2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为10min，频率为40KHz。
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为5M；
所述温度范围为80℃；所述腐蚀时间为24h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM)图如图1B所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本(AT)浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM) 图如图1C所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF 涂层(AT-Mg/Zn)；
3.1)配置含有硝酸镁、硝酸锌和2,5-二羟基对苯二甲酸的电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为(65︰4.5︰ 4.5；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.3525 ︰65；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.0035 ︰65；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为0.167︰65；
所述电解液配置如下：2,5-二羟基对苯二甲酸首先溶于电解液混合溶剂后，分别加入硝酸镁和硝酸锌；
所述磁力搅拌条件如下：速率为150rpm，时间为5min；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到样本AT-Mg/Zn1，样本AT-Mg/Zn1的表面扫描电镜(SEM)图如图1D所示。
实施例3：
AT-Mg/Zn2植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.1.1)使用砂纸将钛片(Ti)进行打磨抛光；如图1A所示，即为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；
所述砂纸的目数为400，1000和2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为10min，频率为40KHz。
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为5M；
所述温度范围为80℃；所述腐蚀时间为24h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM)图如图1B所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本(AT)浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM) 图如图1C所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF 涂层(AT-Mg/Zn)；
3.1)配置含有硝酸镁、硝酸锌和2,5-二羟基对苯二甲酸的电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为65︰4.5︰4.5；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.3515 ︰65；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.0045 ︰65；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为0.167︰65；
所述电解液配置如下：2,5-二羟基对苯二甲酸首先溶于电解液混合溶剂后，分别加入硝酸镁和硝酸锌；
所述磁力搅拌条件如下：速率为150rpm，时间为5min；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到样本AT-Mg/Zn2，样本AT-Mg/Zn2的表面扫描电镜(SEM)图如图1E所示。
实施例4：
AT-Mg/Zn3植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.1.1)使用砂纸将钛片(Ti)进行打磨抛光；如图1A所示，即为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；
所述砂纸的目数为400，1000和2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为10min，频率为40KHz。
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为5M；
所述温度范围为80℃；所述腐蚀时间为24h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM)图如图1B所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本(AT)浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM) 图如图1C所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF 涂层(AT-Mg/Zn)；
3.1)配置含有硝酸镁、硝酸锌和2,5-二羟基对苯二甲酸的电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为65︰4.5︰4.5；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.349︰ 65；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.007︰ 65；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为0.167︰65；
所述电解液配置如下：2,5-二羟基对苯二甲酸首先溶于电解液混合溶剂后，分别加入硝酸镁和硝酸锌；
所述磁力搅拌条件如下：速率为150rpm，时间为5min；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到样本AT-Mg/Zn3，样本AT-Mg/Zn3的表面扫描电镜(SEM)图如图1F所示。
实施例5：
AT-Mg/Zn4植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.1.1)使用砂纸将钛片(Ti)进行打磨抛光；如图1A所示，即为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；
所述砂纸的目数为400，1000和2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为10min，频率为40KHz。
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为5M；
所述温度范围为80℃；所述腐蚀时间为24h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM)图如图1B所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本(AT)浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM) 图如图1C所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF 涂层(AT-Mg/Zn)；
3.1)配置含有硝酸镁、硝酸锌和2,5-二羟基对苯二甲酸的电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为65︰4.5︰4.5；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.339︰ 65；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.017︰ 65；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为0.167︰65；
所述电解液配置如下：2,5-二羟基对苯二甲酸首先溶于电解液混合溶剂后，分别加入硝酸镁和硝酸锌；
所述磁力搅拌条件如下：速率为150rpm，时间为5min；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到样本AT-Mg/Zn4，样本AT-Mg/Zn4的表面扫描电镜(SEM)图如图1G所示。
实施例6：
AT-Mg/Zn5植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1)将钛片进行预处理；
1.1.1)使用砂纸将钛片(Ti)进行打磨抛光；如图1A所示，即为打磨抛光后的钛片的表面扫描电镜(SEM)图；
所述砂纸的目数为400，1000和2000目；
1.1.2)将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为10min，频率为40KHz。
1.2)将步骤1.1)中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于不同温度下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为5M；
所述温度范围为80℃；所述腐蚀时间为24h；
1.3)将步骤1.2)中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM)图如图1B所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
2)利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1)将步骤1.3)中得到的腐蚀样本(AT)浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.2)将步骤2.1)中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.05M；
所述浸泡时间为30min；
2.3)将步骤2.2)中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；得到的产物的表面扫描电镜(SEM) 图如图1C所示；
所述超声清洗过程中：时间为1min，频率为40KHz；
所述烘干过程中：温度为60℃，时间为12h。
3)利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF 涂层(AT-Mg/Zn)；
3.1)磁力搅拌条件下配置含有硝酸镁、硝酸锌和2,5-二羟基对苯二甲酸的电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为65︰4.5︰4.5；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.3235 ︰65；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比(g︰mL)为0.0325 ︰65；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比(g ︰mL)为0.167︰65；
所述电解液配置如下：2,5-二羟基对苯二甲酸首先溶于电解液混合溶剂后，分别加入硝酸镁和硝酸锌；
所述磁力搅拌条件如下：速率为150rpm，时间为5min；
3.2)将步骤2.3)中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1) 中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到样本AT-Mg/Zn5，样本AT-Mg/Zn5的表面扫描电镜(SEM)图如图1H所示。
实验例1：
将实施例1～6中的得到的中间物和产物进行观察，可知：
从图1中可以观测到：碱腐蚀处理后，材料表面有均匀的片状纳米结构出现；而水热处理后，不同样本表面均有颗粒状结构出现，且颗粒尺寸随着锌离子的添加逐渐减小。
上述形貌变化表明锌/镁复合MOF涂层在样本表面被成功制备，该结论进一步得到了X射线衍射(XRD)和元素含量结果(图2和3) 的验证。
从图2中XRD结果可发现：与纯钛组相比，碱腐蚀样本表面晶型几乎没有发生变化；但MOF涂层形成后，材料表面均有 Zn/Mg-MOF74的谱峰出现，且MOF谱峰的峰强随着涂层中锌离子添加量的增加逐渐减小，这表明样本表面相应的涂层厚度逐渐降低。
从图3中元素含量数据可观测到：从AT-Mg到AT-Mg/Zn5样本，材料表面碳(C)和镁(Mg)的元素含量逐渐降低，而钛(Ti)和锌 (Zn)的元素含量逐渐升高，这也是由于样本表面涂层逐渐变薄引起的。
综上所述，实施例1～6中的锌/镁复合MOF涂层修饰的材料被成功制备。
实验例2：
将实施例1～6中的得到的样本进行表面涂层稳定性检测，包括以下步骤：
1)将各组样本浸泡于PBS溶液(pH7.4)中，37℃条件下孵育不同时间(0、6、12和24h)；
2)对样本周围的涂层降解碎片进行光学成像观察。
实验结果如图4所示，即为PBS溶液中不同材料表面涂层稳定性光学图片；
从图4中可观测到：纯镁涂层样本(AT-Mg)具有最弱的稳定性，相同浸泡时间下该组具有最多的涂层碎片产生；随着涂层中锌含量增加，涂层稳定性逐渐增强。
因此可做出以下结论，纯镁MOF涂层稳定性较差，适当添加锌离子可以显著提高材料涂层的稳定性，其将有效改善涂层样本的综合生物学性能。
实验例3：
将实施例1～6中的得到的样本进行表面细菌形态检测，包括以下步骤：
1)将1mL初始浓度为1×106个/mL的金黄色葡萄球菌 (S.aureus,ATCC29213)和大肠杆菌(E.coli,ATCC2592)分别接种于不同样本表面，37℃条件下孵育6小时后，利用浓度为多聚甲醛溶液(4％)对粘附生长的细菌进行固定化处理；
2)利用梯度乙醇溶液对上述固定细菌进行脱水处理，最后进行 SEM观察；
实验结果如图5所示，即为不同材料表面金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的SEM图；
从图5中可以看出：细菌接种6小时后，各MOF涂层样本表面的细菌数目均明显减少(相较于Ti和AT组)，且AT-Mg、AT-Mg/Zn3 和AT-Mg/Zn5三组的细菌数目最少，细菌完整性较差。
上述结果说明，MOF涂层可赋予钛基材优越的抗菌性能。
实验例4：
将实施例1～6中的得到的样本材料表面上巨噬细胞及成骨细胞增殖检测
成骨细胞实验中各材料被预先分为两组：Presoak(0d)组中样本被直接应用于接种细胞；而Presoak(3d)组样本在细胞接种前需在PBS中预先浸泡3d。
具体实验步骤如下：
1)初始浓度为5×104个/孔的巨噬细胞和2×104个/孔的成骨细胞分别被接种于各样本表面，培养3天后，移除旧培养基，且每孔中添加1mL含噻唑蓝(MTT，0.5mg/mL)的培养基溶液；
3)细胞孵育4h后，每孔加入0.2mL二甲基亚砜溶液，并于490nm 波长下测量溶液吸光度；
实验结果如图6所示，即为巨噬细胞及成骨细胞于正常 [Presoak(0d)]或预浸泡3d[Presoak(3d)]处理后，各样本表面培养 3天后的细胞活性图，置信区间为99.5％(*p<0.05)和99.9％ (**p<0.01)；
从图6中可发现：与纯钛组相比，未浸泡处理时AT及MOF涂层修饰样本对两种细胞均表现出显著的细胞毒性；但材料预浸泡3d处理后，MOF材料的细胞相容性显著改善，AT-Mg/Zn3样本呈现出最优越的成骨细胞活性。
上述成骨细胞及巨噬细胞活性结果表明，AT-Mg/Zn3样本拥有相对优越的细胞相容性。
实验例5：
将实施例1～6中的得到的样本表面巨噬细胞炎症相关基因表达检测，具体实验步骤如下：
1)初始浓度为5×104个/孔的巨噬细胞被直接接种于材料表面，培养3天后，利用RNA提取试剂盒收集各组细胞内总RNA；
3)利用反转录试剂盒获取单链cDNA，并进一步通过定量PCR 试剂盒检测各样本表面巨噬细胞内炎症相关基因表达，引物序列如表1所示；
实验结果如图7所示，即为巨噬细胞直接于各样本表面培养3 天后的抗炎因子(IL-10和IL-1ra)及促炎因子(IL-1β和TNFα) 基因表达，置信区间为99.5％(*p<0.05)和99.9％(**p<0.01)；
从图7中可观测到：与纯钛及AT组相比，MOF涂层修饰后各材料表面巨噬细胞抗炎基因表达均上调，而促炎基因表达被显著地抑制；且随着锌离子含量的增加，样本表面巨噬细胞的抗炎基因表达逐渐增强。
上述结果说明，MOF涂层修饰样本均具有良好的抗炎性能。
实验例6：
将实施例1～6中的得到的样本表面成骨细胞成骨分化性能检测，具体实验步骤如下：
1)实验过程中，初始浓度为2×104个/孔的成骨细胞被接种于 PBS预浸泡3d的样本表面；
2)培养7天后，分别使用碱性磷酸酶活性检测试剂盒、胶原染色试剂盒及茜素红染液对细胞进行染色及定量分析，具体实验流程可参考试剂盒说明书；
实验结果如图8和图9所示，即为成骨细胞于预浸泡3d处理后各样本表面培养3天后的碱性磷酸酶活性及矿化染色的定量数据统计图，置信区间为99.9％(**p<0.01)；
从图8和图9中的相应结果中可看出：浸泡处理后，MOF涂层修饰样本均呈现出良好的促成骨分化潜能；且随着锌离子添加量增加，成骨分化呈现先升高后降低的趋势，AT-Mg/Zn3样本表现最优越的促分化效果。
上述结果表明，AT-Mg/Zn3涂层在降解后期缓慢释放的锌离子可有效的促进成骨细胞成骨分化。
实验例7：
将实施例4中得到的AT-Mg/Zn3样本在体内抗菌、抗炎及促成骨性能的探究：
正常植入模型中，大鼠后肢股骨暴露/打孔后，可将Ti、AT和 AT-Mg/Zn3植入体分别植入；为了构建细菌模型，植入体放入骨腔前需提前向其内注入1000个金黄色葡萄球菌；
细菌模型中，植入手术后3d时需对骨组织内部的细菌感染及炎症情况进行探究：直接对部分股骨剖解处理后获取内部植入体，通过琼脂平板压印培养的途径直接观测植入体表面的细菌含量，通过 PBS超声处理后可定量性分析植入体表面及周围骨髓腔内细菌的含量；通过石蜡切片及HE组织学染色途径，观测植入体髓腔段及骨骺段周围骨组织内部局部炎症反应的发生；
植入手术28d后，收集正常及细菌模型的股骨，利用Micro-CT 技术扫面分析不同组植入体周围0.6mm内新生骨组织的体积；
实验结果如图10～14所示；
如图10所示，即为术后3d动物感染模型中，不同植入体表面或周围骨髓腔内金黄色葡萄球菌的压印平板或涂布平板图片；
如图11所示，即为术后3d动物感染模型中，不同植入体表面或周围骨髓腔内金黄色葡萄球菌的抑菌率统计图，置信区间为99.9％ (**p<0.01)；
如图12所示，即为术后3d动物感染模型中，不同植入体髓腔段和骨骺段周围骨组织苏木精-伊红(HE)染色示意图，白色箭头部分为单核细胞聚集部位(代表局部炎症发生)；
如图13所示，即为术后28d动物正常及细菌感染模型中，不同植入体髓腔段和骨骺段周围(0.6mm)新生骨组织微计算机断层扫描(Micro-CT)三维图片；
如图14所示，即为术后28d动物正常及细菌感染模型中，不同植入体髓腔段和骨骺段周围(0.6mm)新生骨体积统计图，置信区间为99.5％(*p<0.05)和99.9％(**p<0.01)。
从图10和11中的抗菌结果可发现：与纯钛组相比，体内AT样本几乎无抗菌性能，但AT-Mg/Zn3组植入体表面及骨髓腔内的细菌抗菌率均达90％以上。
图12中的HE结果表明：细菌存在条件下，Ti和AT组植入体周围骨组织内有严重的早期炎症发生，但AT-Mg/Zn3组植入体髓腔段及骨骺段周围均无明显炎症发生。
从图13和14中的新骨形成结果可观测到：细菌感染发生时， Ti和AT组植入体周围新骨组织形成显著受阻，28d培养后两类植入体周围仅有少量骨组织出现；与Ti和AT相比，正常及细菌模型中 AT-Mg/Zn3周围均有最多的骨组织形成。
以上结果表明，无论细菌感染与否，AT-Mg/Zn3样本均可有效地促进周围骨组织形成，其对于正常或细菌感染性骨损伤患者均有良好的应用前景。
因此，本发明可通过表层锌/镁MOF复合涂层赋予AT-Mg/Zn3样本优越的局部抗菌、抗炎及促成骨性能，最终实现正常或细菌感染条件下的局部骨损伤治疗。

Claims (6)

1.一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）利用碱热腐蚀法构建纳米片结构化钛基表面；
1.1）将钛片进行预处理；
1.2）将步骤1.1）中得到的预处理过的钛片浸入到氢氧化钠溶液中，再置于40～100℃的温度范围下进行腐蚀；
所述氢氧化钠溶液的浓度为1～10M；
腐蚀时间为12～48h；
1.3）将步骤1.2）中得到的腐蚀样本置于去离子水中，进行超声清洗，烘干后备用；
2）利用离子交换法获取表面钛酸镁预化涂层；
2.1）将步骤1.3）中得到的腐蚀样本浸泡在稀盐酸溶液中；
所述稀盐酸溶液的浓度为0.01～0.1M；
所述浸泡时间为10～60min；
2.2）将步骤2.1）中得到的酸化后的腐蚀样本浸泡在硝酸镁溶液中；
所述硝酸镁溶液的浓度为0.01～0.1M；
所述浸泡时间为10～60min；
2.3）将步骤2.2）中得到的钛酸镁预化处理样本置于去离子水中，进行浸泡清洗处理，烘干后备用；
3）利用水热反应途径，在纳米片表面构建系列锌/镁复合MOF涂层；
3.1）在搅拌状态下，将2,5-二羟基对苯二甲酸溶于电解液溶剂中后，再将硝酸镁和硝酸锌加入其中，得到电解液；
所述电解液的溶剂包括二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水；
所述二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水的体积比为（54～74）︰10︰10；
所述硝酸镁和二甲基甲酰胺的重量体积比（g︰mL）为1.0︰（54～74）；
所述硝酸锌和二甲基甲酰胺的重量体积比（g︰mL）为0.2︰（54～74）；
所述2,5-二羟基对苯二甲酸和二甲基甲酰胺的重量体积比（g︰mL）为（0.2～1.0）︰（54～74）；
3.2）将步骤2.3）中得到的钛酸镁预化处理样本浸入到步骤3.1）中配置好的电解液中，并置于80～150℃条件下反应12～48h，得到目标产物。
2.根据权利要求1所述的一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1.1）中钛片的预处理过程为：
1.1.1）使用砂纸将钛片进行打磨抛光；
所述砂纸的目数为400～2000目；
1.1.2）将打磨抛光后的钛片依次用乙醇、丙酮和去离子水，进行超声清洗；
所述超声清洗过程中：时间为5～20min，频率为30～50KHz。
3.根据权利要求1所述的一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3）中超声清洗过程中：时间为0.5～2min，频率为30～50KHz；
所述烘干过程中：温度为40～100℃，时间为6～12h。
4.根据权利要求1所述的一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，其特征在于：步骤2.3）中，清洗处理是采用超声清洗，超声清洗过程中：时间为0.5～2min，频率为30～50KHz；
所述烘干过程中：温度为40～100℃，时间为6～12h。
5.根据权利要求1所述的一种锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料的制备方法，其特征在于：步骤3.1）中，搅拌操作是采用磁力搅拌，磁力搅拌过程中：速率为100～200rpm，时间为2～10min。
6.一种通过权利要求1～5任一项所述的制备方法所获得的锌/镁复合MOF涂层介导抗菌/抗炎/促成骨型钛基植入材料。
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