CN109045038A - 光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用。发明人通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色、免疫荧光、RT‑PCR和western blot检测，评估了光色素对破骨细胞分化、破骨细胞骨吸收和成骨细胞分化的影响。结果表明，光色素能抑制破骨细胞标记基因的表达，通过抑制RANKL诱导的NFAT活化和钙信号传导而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收。有趣的是，成骨细胞的分化也会被光色素促进，成骨细胞标记基因ALP、Runx 2和Collal的表达上调证明了这一点。此外，光色素通过减少破骨细胞的数量来抑制破骨作用从而预防去卵巢小鼠的骨丢失。因此，光色素可能是治疗骨丢失疾病尤其是骨质疏松症的候选药物。

Description

光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用
技术领域
本发明属于骨疾病治疗技术领域，尤其涉及光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用。
背景技术
骨是一种坚硬的结缔组织，具有保护各种器官、储存矿物质和藏匿骨髓等重要功能。不断的重塑使骨骼成为一个高度活跃的器官。骨吸收与骨形成的动态平衡是维持骨量的关键。骨重塑的平衡是由破骨细胞进行的骨吸收和成骨细胞进行的骨形成所构成的。破骨细胞是进行骨吸收的关键细胞，而成骨细胞和骨细胞在骨形成过程中起着重要作用。破骨细胞来源于单核/巨噬细胞造血谱系，是富含线粒体和溶酶体的特殊细胞。核因子受体激活因子κB配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是导致破骨细胞分化和活化的重要细胞因子。RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，可诱导细胞内信号通路NF-κB和MAPK的钙依赖性激活，从而上调NFATc 1的表达，NFATc 1是参与破骨细胞发生的重要转录因子。成骨细胞来源于间充质干细胞，是参与骨形成的主要细胞。在增殖、成熟和矿化后，成骨细胞分化为骨细胞，以促进骨生长和维持骨量。
骨质疏松症是一种以骨丢失和骨显微结构退化为特征的常见代谢性骨病，表现为骨丢失和微结构损伤，导致骨痛和骨折风险增加。骨质疏松症发生于破骨细胞的骨吸收超过成骨细胞的骨合成，其发展与低雌激素水平、高甲状旁腺激素水平和许多其他因素有关。破骨细胞介导的过度骨吸收是导致骨质疏松的重要机制。因此，骨吸收抑制剂通常被用作抗骨质疏松药物。由于天然化合物是丰富的，并具有许多生物功能，如抗氧化和抗炎，寻找破骨细胞形成和骨吸收的天然抑制剂治疗骨质疏松症已成为当务之急。
光色素是核黄素的光降解产物之一，在细胞氧化和能量代谢中起着重要的作用。此外，核黄素在体外对骨形成有积极作用并且促进成骨细胞相关基因表达。据报道，光色素和核黄素可保护大鼠心脏免受缺血再灌注损伤。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用。
上述骨丢失疾病由破骨细胞过度活动或成骨细胞早期分化不足引起。
上述骨丢失疾病为骨溶解性疾病。
上述骨溶解性疾病为骨质疏松。
上述骨质疏松由卵巢切除引起。
目前，核黄素的光降解产物光色素在骨骼系统疾病中的作用还没有被报道。因此，发明人通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色、免疫荧光、RT-PCR和western blot检测，评估了光色素对破骨细胞分化、破骨细胞骨吸收和成骨细胞分化的影响。结果表明，光色素能抑制破骨细胞标记基因的表达，包括组织蛋白酶K(CTSK)和NFatc 1的表达；光色素通过抑制RANKL诱导的NFAT活化和钙信号传导而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收。有趣的是，成骨细胞的分化也会被光色素促进，成骨细胞标记基因ALP、Runx 2和Col1a1的表达上调证明了这一点。此外，光色素通过减少破骨细胞的数量来抑制破骨作用从而预防去卵巢(OVX)小鼠的骨丢失。因此，光色素可能是治疗骨丢失疾病尤其是骨质疏松症的候选药物。
附图说明
图1是光色素抑制RANKL诱导的破骨发生的研究结果图，图中：(A)以不同剂量处理的TRACP的BMMS代表图像(标尺表示200μm)；(B)破骨细胞数目的定量(TRACP阳性，≥3核)；(C)用MTS细胞活力测定法评估BMMS在含光色素48小时情况下的存活情况；图中的数据代表平均±SD，干预组与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)或**(p＜0.01)。
图2是光色素抑制RANKL诱导的破骨细胞融合的研究结果图，图中：(A)具有代表性的破骨细胞共聚焦图像(F-actin和细胞核染色，标尺代表200μm)；(B)每个视野的破骨细胞数量；(C)每个破骨细胞的平均核数；图中的数据代表平均±SD，干预组与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。
图3是光色素能抑制破骨细胞骨吸收的研究结果图，图中：(A)破骨细胞去除后的代表图像(第二行和第三行)和相应的TRACP染色破骨细胞(第一行，标尺表示200μm)；(B)每个孔中破骨细胞的数量；(C)每个孔中骨吸收面积的量化；图中的数据代表平均±SD，治疗组与对照组的差异为***(p＜0.001)。
图4是光色素抑制RANKL诱导的基因表达的研究结果图，图中：用M-CSF(50ng/mL)和GST-rRANKL(100ng/mL)处理BMMS，基因表达被归一化为HMBS。A、B、C、D分别为破骨细胞分化过程中NFatc 1(A)、Fos(B)、CTSK(C)和Acp 5(TRACP)(D)的相对mRNA表达水平；图中的数据代表平均±SD，干预组与对照组的差异为**(p＜0.001)或***(p＜0.001)。
图5是光色素抑制NFATC1活化和相关的下游蛋白表达的研究结果图，图中：(A)用NFATC1荧光素酶构建体转染的RANKL刺激的264.7细胞中的荧光素酶活性，用指示浓度的光色素对转染的细胞进行预处理，随后用GST-RRANKL(100ng/m1)刺激24小时；(B)用RANKL(100ng/m1)和M-CSF(50ng/m1)在光色素的存在下诱导的BMMS的c-fos、NFatc1、Mmp9、ctsk、整联蛋白β3和ActB的代表性蛋白质印迹图像；图中的数据代表平均值±SD，干预组和对照组之间的显著差异显示为***(p&lt；0.001)。
图6是光色素能抑制RANKL诱导的NF-κB和MAPK通路的激活的研究结果图，图中：(A)RANKL的荧光素酶活性刺激转染NF-κB荧光素酶结构的RAW 264.7细胞，转染细胞经一定浓度的光色素预处理后，用GST-rRANKL(100ng/mL)刺激6h；(B)在100ng/mL的RANKL和50ng/mL的M-CSF存在下，从BMMS中提取P-P38、P38、p-ERK 1/2、ERK、IκB-d和ACTB的典型Westernblot图像；图中的数据代表平均±SD，治疗组与对照组的差异为**(p＜0.001)或***(p＜0.001)。
图7是光色素抑制RANKL诱导的钙振荡的研究结果图，图中：用GST-rRANKL(100ng/mL)刺激BMMS 24小时，用Fluo 4钙指示剂测定钙通量；(A)仅用M-CSF处理的三个细胞内的典型钙波动(阴性对照)；(B)M-CSF和RANKL(阳性对照)处理的三个细胞内钙的典型波动；(C)M-CSF、RANKL和光色素处理的三个细胞内钙的典型波动；(D)每个细胞强度的平均变化，图中的数据代表平均±SD，治疗组与对照组比较，差异有显著性P＜0.01)。
图8是光色素促进ALP的表达和对成骨细胞的矿化无影响的研究结果图，图中：(A)、(B)MTS分析不同浓度的光色素作用24h和48h后MC3T3-F1细胞的存活率；(C)各组MC3T3-E1细胞的典型ALP染色图像(第7天)；(D)各组MC3T3-F1细胞ALP相对mRNA表达水平(第0、7天)；(E)各组MC3T3-F1细胞典型茜素红染色图像(第28天)；(F)茜素红染色平均强度的量化；(G)、(H)不同剂量组(第0、7、14和21天)MC3T3-F1细胞Runx 2和Col1a1相对mRNA表达水平；图中的数据代表平均±SD，治疗组与对照组比较，差异有显著性(p＜0.001.05)、**(p＜0.01)或***(p＜0.01)。
图9是光色素可防止OVX小鼠骨丢失的研究结果图，图中：(A)代表股骨纵断面的显微CT图像，股骨远端的横断面，重建ROI(红色虚线盒)的小梁结构；(B)TRAP染色组织学切片的典型图像，集中于不同组小鼠股骨远端干骺端区，标尺表示200μm和400μm；(C)各组股骨远端体积骨密度(BMD)和骨小梁体积分数(BV/TV)的定量显微CT分析；(D)破骨细胞表面/骨表面比率的定量分析；图中的数据代表平均±SD，治疗组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)，分别为**(p＜0.01)或***(p＜0.001)。
图10是光色素调控破骨细胞和成骨细胞分化的示意图。光色素通过抑制钙振荡和p38和ERK的磷酸化来降低NFATc1表达以抑制破骨细胞分化。此外，光色素上调Runx2表达促进成骨细胞分化。
图11是光色素处理BMMs和MC3T3-F1细胞5天的细胞毒性的研究结果图，图中：(A)用MTS细胞活力测定法评估BMMS在含光色素5天情况下的存活情况；(B)用MTS细胞活力测定法评估MC3T3-F1细胞在含光色素5天情况下的存活情况；图中的数据代表平均±SD，干预组与对照组比较，差异有显著性**(p＜0.01)。
图12是光色素调控RANKL诱导的STAT3和JNK的磷酸化的研究结果图，图中：光色素对RANKL诱导的STAT3和JNK的磷酸化没有影响。用p-STAT3，STAT3，p-JNK1/2和JNK特异性抗体检测蛋白质印迹，并将磷酸化蛋白质水平标准化未磷酸化蛋白质水平。
具体实施方式
一、材料
1.材料
α-最小必需培养基(α-MEM)和胎牛血清(FBS)购自赛默飞世尔科技(SCORESBY，澳大利亚)。光色素由南京大学提供，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的浓度为1mm时制备。从圣克鲁斯生物技术(San若泽，CA)获得整合素β3、c-fos、CTSK、NFATC1、STAT3、IκB-α、ERK、JNK、p38、磷酸化(P)ERK、p38、P-JNK、P-STAT3和β-actin的抗体。MTS和荧光素酶检测系统是从PROMEGA(悉尼，澳大利亚)购买的。从R&D(明尼阿波利斯，MN)购买重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。从Sigma Aldrich(澳大利亚悉尼)购买白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒。
2.细胞培养
RAW264.7小鼠巨噬细胞和MC3T3-F1前成骨细胞从美国培养物收集(VA马纳萨斯)购买。RAW264.7和MC3T3-F1分别在α-MEM和DMEM培养基中分别添加10％FBS、2mL谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。骨髓来源的单核巨噬细胞(BMMS)是从6周龄C57BL/6J小鼠骨中提取的，根据西澳大利亚大学动物伦理委员会(RA/3/100/1244)批准的程序进行安乐死。分离软组织与长骨，从股骨和胫骨冲洗骨髓，然后在完全培养基中加入M-CSF(50ng/ml)培养。
3.小鼠
12周龄雌性C57BL/6J小鼠由第三军医大学动物中心提供。本研究中的所有的动物使用步骤得到了第三军医大学实验动物伦理委员会的批准。本研究中的所有动物程序都是严格按照批准的指南进行的。小鼠分为假手术组(n＝4)、去卵巢小鼠组(n＝4)和去卵巢组(n＝4)。每周腹腔注射PBS或光色素，一周三次，共6周。最后一次给药后第1天，用颈椎脱位处死所有处理过的小鼠。
二、方法
1.成骨细胞分化实验
将MC3T3-F1细胞接种于6孔培养板中，密度为5×105个/孔，用成骨细胞分化培养基处理。培养基由地塞米松(10nmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和β-甘油磷酸盐(5mmol/L)组成，每隔3天更换一次。
2.破骨细胞分化实验
药物筛选试验采用上述分离的BMMS来评价RANKL诱导的破骨细胞分化作用。将BMMS以6×103个细胞/孔的密度种入96孔培养板中，用含M-CSF(50ng/mL)和GST-rRANKL(100ng/mL)的完整培养基培养，用不同浓度的光色素对细胞进行处理。细胞培养液每2天更换一次。5天后，用4％多聚甲醛固定10min，用PBS洗涤3次。然后用白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒，按照程序对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)的染色。TRACP阳性多核细胞(＞3核)为破骨细胞。
3.细胞毒性实验
将BMMS和MC3T3-E1细胞毒试验接种于6×103个/孔96孔板中，留置过夜使其粘附。第二天，细胞被不同浓度的光色素孵育。分别在48h和120h后再加入20μL/孔的MTS溶液，与细胞共孵育2h。在490nm处用全自动定量绘图酶标仪(MultiScan谱，ThermoLabsystem，Chantilly，VA)读出吸光度。
4.免疫荧光染色
BMMS在MCSF(50ng/mL)存在下，密度为6×103个/孔。用M-CSF和GST-rRANKL(100ng/mL)刺激细胞，直至成熟破骨细胞形成。破骨细胞用不同浓度的光色素处理48h。细胞经4％多聚甲醛固定，0.1％TritonX-100PBS渗透，3％BSA封闭。然后，将细胞与罗丹明标记的鬼笔环肽在黑暗中孵育45分钟，使F-actin染色。然后用PBS清洗细胞，用DAPI对细胞核进行染色，在共聚焦显微镜下扫描。
5.羟基磷灰石吸收法
采用羟基磷灰石吸收法测定破骨细胞活性，首先用BMMS(1×105细胞/孔)在6孔胶原包被板(BDBioCoat，ThermoFisher，SCORE，澳大利亚)中培养。用100ng/ml GST-RRANKL和50ng/mlM-CSF刺激细胞，直至产生成熟破骨细胞。使用细胞解离溶液(Sigma-Aldrich，SymmID，澳大利亚)将细胞轻轻地从平板上分离。将相同数量的成熟破骨细胞接种到羟基磷灰石涂层96孔板中的各个孔中(康宁骨测定，Corning，NY)。成熟破骨细胞在含有GST-RRANKL和M-CSF的培养基中以不同浓度光色素孵育。48小时后，将一半的孔进行组织化学染色以用于TRAP活性，以评估每孔多核细胞的数目。将剩余的孔漂白10分钟以除去细胞并测量吸收区。在标准光学显微镜下拍摄吸收区。使用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)量化破骨细胞对羟基磷灰石表面吸收的百分比面积。
6.荧光素酶报告基因检测
为了检测NF-κB和NFATc1转录激活情况，raw264.7细胞稳定转染NF-κB应答荧光素酶报告结构或NFATc 1应答荧光素酶报告结构。转染细胞在密度为1.5×105个/孔的48孔板中培养，用不同浓度的光色素预处理1h。预处理后用GST-rRANKL(100ng/mL)刺激细胞6h(NF-κ B荧光素酶报告基因法)或24h(NFAT荧光素酶报告基因法)。根据制造商提供的说明书使用荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性(Promega，澳大利亚悉尼)。
7.细胞内钙离子振荡测量
用钙结合染料Fluo4-AM(分子探针，热费雪科学，Scoresby，澳大利亚)研究细胞内钙离子振荡的测定。将BMMS接种到48孔板中，浓度为1×104个/孔；第二天，用含10μM光色素+GST-rRANKL和M-CSF的完整培养基换液培养24小时。之后用试验缓冲液(Hanks平衡盐溶液+1mm丙磺舒+1％FBS)洗涤细胞，接着用4mM Fluo 4染色液将细胞在37℃下孵育45min，之后用试验缓冲液中洗涤细胞一次，室温下孵育20min。然后用反转荧光显微镜在488nm的激发波长下检测细胞的荧光，2分钟内，每2秒采集1次图像，用Nikon基础研究软件进行钙流量分析。
8.碱性磷酸酶(ALP)染色
将MC3T3-F1细胞接种于48孔板，密度2×104/细胞。用三氯蔗糖处理细胞7d，每3天换液一次。然后用4％-多聚甲醛固定细胞20min。然后在黑暗条件下，用100μL BCIP(Sigma奥德里奇，悉尼，澳大利亚)在37℃下染色30min。丢弃染色液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并拍摄。
9.定量RT-PCR分析
用Trizol试剂从细胞中分离出总RNA。用1μg RNA模板和寡核苷酸引物合成了小鼠白血病病毒逆转录酶。聚合酶链式反应扩增特异性序列采用以下周期：94℃连续5min，94℃30次，40s，60℃40s，72℃40s，72℃最后延伸5min，72℃，最后延伸5min，特异引物的详细信息见表1。用HMBS或HPRT归一化法计算相对mRNA水平。
表1特异引物信息
10.蛋白印记分析
BMMS在含M-CSF的6孔板中培养，用100ng/mL GST-rRANKL刺激。用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液溶解细胞。蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在5％脱脂乳中封闭1小时后，在4℃下用各种特异性初级抗体在4℃处轻轻摇动一夜，然后用辣根过氧化物酶(HRP)结合的次级抗体孵育膜。然后用增强化学发光试剂检测抗体反应性(美国药典生物技术公司，Piscataway，NJ)，在图像量化LAS 4000上显示(GEHealthcare，Silverwater，澳大利亚)。
11.微聚焦计算机断层(MicroCT)扫描和组织学分析
使用各向同性体素尺寸为10.0μm的布鲁克显微CT扫描1272系统(比利时康蒂奇)对整个股骨进行了成像。扫描采用4％多聚甲醛，X射线管电位为60kV，X射线强度为166个μA，曝光时间为1700ms。小梁骨的阈值为86-255(8位灰度位图)。采用各向同性体素大小为148μm，对小鼠全身(头骨除外)进行了微CT扫描。重建用NRecon(Ver)完成。利用原始灰度图像(CTvox，Ver)的距离变换方法，从等高线二维图像中获取三维图像。用CT分析仪软件(Ver)进行三维和二维分析。展示的所有图像都代表各自的组。
对于骨的组织学分析，将股骨解剖并固定在4％多聚甲醛-PBS中48小时。然后通过每天更换的15％四钠EDTA浸泡溶液使股骨脱钙2周。脱钙的股骨通过使其通过一系列浓度的乙醇脱水，然后在二甲苯中两次清除，包埋在石蜡中。然后将股骨从前向后分为8μm厚切片。脱钙股段用TRAP染色。
12.统计
除非另有说明，所有数据均代表至少三次实验的一式三份。数据以平均值±SD表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和两两比较检验后确定结果间差异的显著性，P＜0.05，差异有显著性(P＜0.05)。
三、结果
1.光色素抑制RANKL诱导的破骨细胞形成与融合
观察光色素对破骨细胞形成的影响，将BMMS与RANKL和M-CSF共同培养5天，加入不同浓度的光色素，观察其对破骨细胞形成的影响。研究发现，当光色素浓度达到7.5μM时，其对TRACP阳性细胞的形成有抑制作用(图1A，1B)。为了确定光色素的作用是否是由于细胞毒性，进行了MTS试验。结果表明，在10μM浓度和更低浓度(图1C，11A)条件下，光色素对小鼠无细胞毒作用。此外，为了评价光色素对破骨细胞融合的影响，发明人用罗丹明-鬼笔环肽染色形成的破骨细胞来显示F-actin，并用DAPI识别细胞核(图2A)。结果表明，10μM浓度下的光色素对破骨细胞的形成和每个破骨细胞的平均核数均有明显的抑制作用(图2B，2C)。综上所述，光色素对RANKL诱导的破骨细胞形成和破骨细胞融合具有抑制作用，但对BMMS无细胞毒性作用。
2.光色素抑制破骨细胞的骨吸收
为探讨光色素对破骨细胞骨吸收的抑制作用，发明人在羟基磷灰石板上种植了相同数量的成熟破骨细胞，观察其对破骨细胞骨吸收的影响。将成熟的破骨细胞暴露于7.5μm或10μm光色素24h。TRACP染色显示，光色素不影响成熟破骨细胞的数量(图3A，3B)。然而，与未干预组相比，用光色素干预组的吸收面积明显减少(图3A，3C)。因此，这些数据表明，光色素抑制破骨细胞的骨吸收，但对成熟的破骨细胞没有细胞毒性作用。
3.光色素对RANKL诱导的基因表达有抑制作用
发明人进一步研究了光色素在破骨细胞形成过程中对RANKL诱导的基因表达的影响。用RT-PCR方法分析了不同剂量的光色素对RANKL和M-CSF作用5d后BMMS的基因表达水平。光色素干预后，破骨细胞分化相关基因NFatc 1、Fos、CTSK和Acp 5的mRNA表达水平明显下调(图4)。这些结果与光色素对破骨细胞分化和骨吸收的抑制作用是一致的。
4.光色素抑制NFATc1的活化和相关下游蛋白的表达
将转染NFATc 1荧光素酶报告基因的RAW 264.7细胞与不同浓度的光色素联合刺激以观察光色素对RANKL诱导的NFATc 1活性的影响。结果表明，在浓度为7.5和10μM的条件下，光色素能降低NFATc 1荧光素酶活性(图5A)。免疫印记分析在蛋白质水平证实荧光素酶报告实验的结果。与抑制NFATc 1的激活相一致，在第3天和第5天，光色素明显阻断了NFATc1蛋白的表达(图5B)。另外，在10μM浓度下，c-Fos、基质金属蛋白酶9(MMP9)、组织蛋白酶K(CTSK)和整合素-β3等与NFATc1相关的下游蛋白表达也受到下调(图5B)。
5.光色素能抑制RANKL诱导的NF-κB和MAPK通路的激活
众所周知，RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路在破骨细胞形成过程中起着重要作用。因此，发明人用荧光素酶报告法检测了光色素对RANKL诱导的NF-κB活性的影响。经过7.5和10μM光色素处理后，NF-kB荧光素酶的活性降低(图6A)。免疫蛋白印记显示RANKL诱导的IκB-α降解被抑制(图6B)。有趣的是，光色素还抑制ERK 1/2和p38的磷酸化(图6B)，对STAT 3和JNK 1/2磷酸化作用不大(图12)。综上所述，这些数据表明，光色素抑制了RANKL诱导的NF-kB和MAPK信号通路的激活。
6.光色素抑制RANKL诱导的钙离子振荡
为解释光色素对NFAT激活的抑制作用，发明人研究其对RANKL诱导的钙离子信号传导的影响。正如预期所想，与对照组相比，RANKL可激活钙振荡(图7A，7B)。光色素显著降低RANKL诱发的钙振荡幅度(图7C，7D)。这些结果表明，光色素抑制了RANKL诱导的钙信号通路，这与其对NFAT激活和RANKL诱导破骨细胞形成的抑制作用是一致的。
7.光色素提高了成骨细胞中ALP的表达
为进一步研究光色素对成骨细胞分化和增殖的影响，发明人采用了MTS法检测了光色素对成骨细胞的毒性作用。用不同剂量的光色素处理成骨细胞MC3T3-E124、48和120h。结果表明，在12μ M和较低浓度下，光色素无细胞毒作用(图8A、8B、11B)。在第7天观察光色素对成骨细胞分化、碱性磷酸酶(ALP)活性和基因表达的影响。发明人发现，与对照组相比，光色素处理组ALP的活性和基因表达增加(图8C-D)。培养第28天，用茜素红染色法测定成骨细胞矿化情况。结果表明，钙沉积法评估的矿化作用在光色素干预后未发生变化(图8E-F)。此外，在成骨细胞分化的早期阶段(第7天)，光色素可促进成骨细胞特异性基因Runx 2和Col1a1的表达，但在第21天(图8G，8H)已恢复正常。在早期阶段，光色素对成骨细胞的分化有促进的作用。
8.光色素预防去卵巢所致的骨丢失
发明人用OVX小鼠检测了光色素对去卵巢所致骨丢失的影响。假手术或去卵巢后，每2天腹腔注射一次，每次7.5mg/kg，每2天腹腔注射一次，共6周。然后收集股骨进行显微CT分析。重建区域的轮廓如虚红框中所示。结果表明，光色素能抑制OVX小鼠骨丢失(如图9A)。定量分析显示，与OVX对照组相比，光色素处理的OVX小鼠骨密度(BMD)和骨小梁体积分数(BV/TV)均显著升高(图9C)。为了进一步证实光色素在体内对破骨细胞形成的抑制作用，发明人还进行了组织学TRAP染色。结果表明，与对照组相比，OVX小鼠破骨细胞表面/骨表面(Oc.S/BS)明显增加，且光色素显著降低了OVX小鼠的Oc.S/BS比值(图9B，9D)。因此，这些数据表明，光色素通过抑制破骨细胞形成而抑制卵巢切除引起的骨丢失。四、讨论
核黄素被报道对成骨有促进作，而光色素是核黄素的降解产物，很少有研究探讨光色素在骨生物学中的作用，其对成骨细胞及破骨细胞的作用尚未报到。发明人的研究表明，光色素可以通过抑制破骨细胞形成来防止卵巢切除引起的骨丢失。此外，光色素还通过抑制NFAT活化和钙信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收。发明人还发现，光色素能促进成骨细胞的早期分化。
在破骨细胞形成的初始阶段，RANKL与RANK结合，肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)与RANK的胞内结构域结合，诱导NFATc1的激活。NFATc1作为破骨细胞形成过程中的重要转录因子，调控破骨细胞特异性基因的表达，如MMP-9、ctsk、降钙素受体(calcitonreceptor，ctr)和整合素β 3。据报道，在RANKL的刺激下，NFATc1缺乏的胚胎干细胞不能分化为破骨细胞。发明人的研究表明，光色素能抑制RANKL诱导的NFATc 1激活和钙信号传导，进而抑制下游基因MMP-9和CTSK的表达。
发明人进一步研究了光色素对NFATc1抑制作用的机制，包括对NF-κ B和MAPK信号的影响。NF-κ B信号在调节破骨细胞形成中起重要作用，RANKL激活NF-κ B-诱导激酶(NiK)分离NF-κ B和I κ B-α，然后，NF-κ B迅速进入细胞核，调节破骨细胞的分化和成熟。有趣的是，光色素通过抑制Iκ B-α的降解而降低RANKL诱导的NF-α B活性，这与其对RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收的抑制作用是一致的。MAPK信号通路，包括ERK、JNK和p38通路，通过激活c-Fos和NFATc1等关键转录因子来调控破骨细胞的分化。研究发现，p38突变小鼠出现骨质疏松症，这与破骨细胞形成和骨吸收增加有关。从发明人的数据来看，光色素抑制RANKL诱导的p38和ERK的激活，对JNK磷酸化无影响。这些结果表明，光色素通过调节p38和ERK通路抑制NFATc 1的表达。
除了这些信号途径之外，RANKL还促进钙释放并增加细胞内钙水平。NFATC1的活化取决于钙的持续低浓度而钙振荡增加可降低其活化的阈值。最近研究证实，受损的钙动员加重骨质疏松小鼠的创伤后骨丢失。发明人发现，光色素显著地削弱了钙振荡的平均振幅，这与它对破骨细胞生成和骨吸收的抑制作用一致。
除破骨细胞外，成骨细胞也是骨组织的重要组成部分，是骨形成的主要功能细胞。成骨细胞在调节骨矿化和维持骨量方面发挥着关键作用。成骨细胞在分化成熟过程中逐渐表达ALP、骨钙素(OCN)、Col1a1等特异性标记基因，这些基因受一系列转录因子的调控。成骨细胞特异性转录因子Runx 2对于成骨细胞的分化和骨形成是必不可少的，Runx 2基因敲除小鼠颅骨骨结节形成减少，骨标记基因表达减少。在发明人的研究中，发明人发现光色素促进了成骨细胞分化过程中的ALP活性以及Runx 2和Col1a1的表达，而骨矿化不受光色素干预的影响。
综上所述，发明人的结果表明，光色素可减弱OVX小鼠骨丢失，并通过抑制RANKL诱导的NFAT、钙信号、NF-κ B和MAPK的激活，抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收，光色素还能促进成骨细胞的早期分化(图10)。因此，光色素有潜力开发程治疗骨质疏松和其他骨溶解性疾病的药物。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcatttctt tggggctt 18

Claims (5)

1.光色素在制备治疗骨丢失疾病药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨丢失疾病由破骨细胞过度活动或成骨细胞早期分化不足引起。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨丢失疾病为骨溶解性疾病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述骨溶解性疾病为骨质疏松。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述骨质疏松由卵巢切除引起。
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