CN108998475A - miR-21在调控电离辐射诱导上皮间质转化中的应用 - Google Patents

miR-21在调控电离辐射诱导上皮间质转化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR‑21在调控电离辐射诱导的上皮间质转化中的应用。本发明提供了miR‑21相关生物材料在制备用于调控辐射诱导的上皮间质转化的产品中的应用；所述miR‑21相关生物材料为miR‑21，或者能够促进所述miR‑21表达的物质，或者能够抑制所述miR‑21表达的物质；所述miR‑21为成熟miR‑21或前体miR‑21。本发明揭示了电离辐射诱导肺上皮细胞(A549及Beas‑2B)miR‑21表达升高，诱导的miR‑21通过抑制靶蛋白PTEN表达，激活Akt途径，从而促进EMT的发生。因此，miR‑21有可能成为治疗放射性肺纤维化的新的生物标志物和治疗靶标。

Description

miR-21在调控电离辐射诱导上皮间质转化中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR-21在调控电离辐射诱导的上皮间质转化中的应用。
背景技术
全基因组转录组研究表明，存在大量的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)，非编码RNA是指转录组中不翻译成蛋白质的RNA分子，包括微RNA(microRNA,miRNA)、细胞核内的小RNA(small nuclear RNA，snRNA)、核仁小分子RNA(small nucleolar RNAs,snoRNA)、干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)、与piwi蛋白相互作用的RNA(piwi-interactingRNA，piRNA)、长非编码RNA(long non-codingRNA,LncRNA)等。miRNA是一类内源性的，长度在19-25个核苷酸之间的小分子非编码RNA，能够介导mRNA阻遏或失调，并导致翻译受到抑制，因此是一类重要的基因表达调节因子。miRNA最初在线虫中发现，而现在是已知的普遍存在于真核生物体内并且具有高度保守性的一类分子。它们调节转录后基因表达，并且对细胞和环境均有依赖性。
电离辐射可引起放射性肺纤维化(radiation-induced pulmonary fibrosis,RIPF)，辐射诱导的上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是RIPF发生的重要原因。由于放射性的肺纤维化为不可逆的过程，临床上患者一旦发生，将严重影响病人的生活质量甚至危及生命，限制了放疗的有效应用。研究并揭示RIPF发生发展的机制，寻找具有潜在治疗作用的靶点，将为预防或缓解放射性肺纤维化提供重要理论依据，对于开发具有预防和(或)治疗RILF疾病的药物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供miR-21在调控辐射诱导的上皮间质转化中的应用。
第一方面，本发明要求保护miR-21相关生物材料在如下(A1)或(A2)中的应用：
(A1)制备用于调控辐射诱导的上皮间质转化的产品；
(A2)调控辐射诱导的上皮间质转化；
所述miR-21相关生物材料为miR-21，或者能够促进所述miR-21表达的物质，或者能够抑制所述miR-21表达的物质；所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
其中，所述调控辐射诱导的上皮间质转化是通过靶蛋白PTEN调控辐射诱导的上皮间质转化。
进一步地，所述调控辐射诱导的上皮间质转化是通过靶蛋白PTEN调节Akt途径进而调控辐射诱导的上皮间质转化。
第二方面，本发明要求保护能够抑制miR-21表达的物质在如下(a1)或(a2)中的应用：
(a1)制备用于抑制辐射诱导的上皮间质转化的产品；
(a2)抑制辐射诱导的上皮间质转化；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
其中，所述能够抑制miR-21表达的物质可为任何能够抑制miR-21表达的物质。
在本发明的具体实施方式中，所述能够抑制miR-21表达的物质为miR-21抑制剂。
进一步地，所述miR-21抑制剂(miR-21 inhibitor)具体为SEQ ID No.5所示的单链RNA。
第三方面，本发明要求保护miR-21或者能够促进miR-21表达的物质在如下(a1’)或(a2’)中的应用：
(a1’)制备用于促进辐射诱导的上皮间质转化的产品；
(a2’)促进辐射诱导的上皮间质转化；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
进一步地，所述用于促进辐射诱导的上皮间质转化的产品可为辐射诱导下发生上皮间质转化的能力增强的细胞模型，或者是用于制备辐射诱导下发生上皮间质转化的能力增强的细胞模型的物质。所述细胞可为肺上皮细胞，具体如A549细胞或Beas-2B细胞。
其中，所述能够促进miR-21表达的物质可为任何能够促进miR-21表达的物质，如miR-21模拟物(miR-21 mimics)；能够转录成所述miR-21的DNA，含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞等。
第四方面，本发明要求保护能够抑制PTEN蛋白表达的物质在制备具有如下功能的产品中的应用：逆转由于抑制miR-21表达而引起的辐射诱导的上皮间质转化受到抑制的情况。所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
第五方面，本发明要求保护能够抑制miR-21表达的物质在如下(b1)或(b2)中的应用：
(b1)制备用于治疗放射性肺纤维化的产品，或治疗放射性肺纤维化；
(b2)制备用于抑制放射性肺纤维化发生的产品，或抑制放射性肺纤维化发生；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。在上述各方面中，所述成熟miR-21具体为SEQ ID No.1所示的RNA分子；所述前体miR-21具体为SEQ ID No.2所示的RNA分子。所述miR-21模拟物(miR-21 mimics)具体为由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的RNA单链形成的双链RNA分子。所述PTEN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。所述能够抑制PTEN蛋白表达的物质为由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的RNA单链形成的双链RNA分子。
在上述各方面中，所述辐射诱导的上皮间质转化为辐射诱导的肺上皮细胞所发生的上皮间质转化。
在本发明的具体实施方式中，所述肺上皮细胞可为肿瘤细胞液可为正常细胞，具体如A549细胞(肿瘤细胞)或Beas-2B细胞(正常细胞)。
在上述各方面中，所述抑制辐射诱导的上皮间质转化具体体现为如下任一：E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达上调，N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、twist蛋白和α平滑肌动蛋白(α-SMA)表达下调。所述促进辐射诱导的上皮间质转化具体体现为如下任一：E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调，N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、twist蛋白和α平滑肌动蛋白(α-SMA)表达上调。
在上述各方面中，所述辐射均可为电离辐射。进一步地，所述辐射具体可为6Gyγ射线照射。
本发明揭示了电离辐射诱导肺上皮细胞(A549及Beas-2B)miR-21表达升高，诱导的miR-21通过抑制靶蛋白PTEN表达，激活Akt途径，从而促进EMT的发生。因此，miR-21有可能成为治疗放射性肺纤维化的新的生物标志物和治疗靶标。
附图说明
图1为电离辐射诱导miR-21表达。A为A549细胞结果；B为Beas 2B细胞结果。
图2为miR-21能促进电离辐射诱导的EMT。A-C：miR-21 mimic促进A549细胞发生EMT；D-E：miR-21 mimic促进Beas 2B细胞发生EMT。A为A549细胞中转染miR-21 mimics的转染效率；B为过表达miR-21的A549细胞的Western blot检测结果；C为过表达miR-21的A549细胞的免疫荧光检测结果；D为Beas 2B细胞中转染miR-21 mimics的转染效率；E为过表达miR-21的Beas 2B细胞的Western blot检测结果。
图3为抑制miR-21逆转电离辐射诱导的EMT。A-C：miR-21 inhibitor抑制辐射诱导的A549细胞发生EMT；D-E：miR-21 inhibitor抑制辐射诱导的Beas 2B细胞发生EMT。A为A549细胞中转染miR-21 inhibitor的转染效率；B为转染miR-21 inhibitor的A549细胞的Western blot检测结果；C为转染miR-21 inhibitor的A549细胞的免疫荧光检测结果；D为Beas 2B细胞中转染miR-21 inhibitor的转染效率；E为转染miR-21 inhibitor的Beas 2B细胞的Western blot检测结果。
图4为miR-21靶向调节PTEN。A：A549细胞，RT-qPCR实验结果显示出照射后miR-21表达上调，PTEN表达下调。B：Beas 2B细胞，RT-qPCR实验结果显示出照射后miR-21表达上调，PTEN表达下调。C：统计学相关性分析显示辐射诱导的miR-21与PTEN统计学上存在很强的负相关。D：RT-qPCR在mRNA水平检测发现过表达miR-21将下调PTEN的表达。E：Westernblot在蛋白水平检测发现过表达miR-21将下调PTEN的表达。F：RT-qPCR在mRNA水平检测发现敲低miR-21将上调PTEN的表达。G：Western blot在蛋白水平检测发现敲低miR-21将上调PTEN的表达。
图5为miR-21通过PTEN介导辐射诱导的EMT。A：A549细胞，Western blot在蛋白水平检测发现miR-21通过PTEN介导辐射诱导的EMT。B：Beas 2B细胞，Western blot在蛋白水平检测发现miR-21通过PTEN介导辐射诱导的EMT。C：A549细胞，免疫荧光在蛋白水平检测发现miR-21通过PTEN介导辐射诱导的EMT。
图6为MiR-21通过PTEN调节Akt途径调节EMT。A：在A549中过表达miR-21，PTEN表达减少，总AKT表达无明显改变，而P-AKT的表达明显增加。B：敲低miR-21后照射细胞，单独照射后总AKT表达无明显改变，P-AKT的表达明显增加，敲低miR-21照射后，能够逆转P-AKT的表达。C：在B基础上进一步敲低PTEN又能够使P-AKT的表达增加。
各图中，IR表示辐射诱导；NC表示对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的人源成熟miR-21(hsa-miR-21-5p)具体为：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’(SEQ ID No.1)。
下述实施例中所涉及的人源前体miR-21具体为：5’-UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3’(SEQ ID No.2)。
下述实施例中所涉及的miR-21模拟物(miR-21 mimics)具体为模拟生物体内源的miR-21，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miR-21的功能。其序列如下：
Sense：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’(SEQ ID No.3)；
Antisense：5’-AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3’(SEQ ID No.4)。
下述实施例中所涉及的miR-21抑制剂(miR-21 inhibitor)具体为化学修饰的专门针对细胞中miR-21的抑制剂，是化学修饰的RNA单链，能够与成熟miRNA序列竞争性结合。使用化学合成方法合成的miR-21 inhibitor，能特异的靶向和敲除miR-21分子，可以削弱内源miR-21的基因沉默效应，提高靶蛋白表达量。其序列为：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’(SEQ ID No.5)。
下述实施例中所涉及的PTEN蛋白的氨基酸序列如下：MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV(SEQ ID No.6)。
下述实施例中所涉及的能够抑制PTEN蛋白表达的物质(siPETN)的序列为：
Sense：5’-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3’(SEQ ID No.7)；
Antisense：5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’(SEQ ID No.8)。
下述实施例中所涉及的miRNA mimics NC序列为：
sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
antisense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
下述实施例中所涉及的miRNA inhibitor NC序列为：
5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。
肺上皮细胞A549：A549细胞是人肺腺癌肺泡基底上皮细胞。
肺上皮细胞Beas 2B：人正常支气管上皮细胞。
实施例1、miR-21调控辐射诱导的上皮间质转化
一、电离辐射诱导miR-21表达
1、正常培养肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)。保持细胞边界清晰，形状正常贴壁，没有被微生物污染。
2、接种细胞。将状态好的细胞接种于60mm培养皿中，培育24小时内使其汇合度达到60％-80％。
3、辐照细胞。当接种好的细胞汇合度达到60％-80％时，6Gy60Coγ射线照射细胞。
4、Trizol法收取细胞提取总RNA。收取对照组细胞(标记为0h)，依次收取辐照后1、3、6、12、24和48小时的细胞(标记为1h、3h、6h、12h、24h和48h)。具体步骤如下：
(1)倒掉细胞培养液，4℃PBS缓冲液清洗细胞3遍。每60mm培养皿加1ml Trizol，室温放置5分钟。使其充分裂解，吹打细胞至拉丝状，吸至1.5mlEP管中。
(2)加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置5分钟。
(3)4℃，12000g离心15分钟。
(4)吸取上层水相至另一1.5ml无RNA酶EP管中。
(5)接着加入500μl异丙醇(沉淀RNA)，颠倒混匀，室温放置10分钟。
(6)4℃，12000g离心10分钟，倒掉上清，RNA沉于管底。
(7)加入1ml 75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
(8)4℃，12000g离心5分钟，倒掉上清，吸干残留，扣在位置上。
(9)室温晾干10分钟。
(10)用20μl无RNA酶水溶解沉淀。
(11)测OD值，定量RNA浓度。
(12)将样品RNA浓度调整到500ng/μl，按10ul每EP管分装RNA，冻于-80℃冰箱。
5、RNA逆转录为cDNA。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将试剂盒中试剂取出解冻，放于冰中备用。
(2)将无RNA酶的反应管在冰上预冷，加入各组分试剂至总体积20ul，逆转录反应体系：Total RNA 1μg；2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl；miRNA RT Enzyme Mix2μl；RNase-Free ddH2O补至20μl。
(3)将反应液轻柔混匀，轻微离心后，按如下程序进行miRNA的逆转录反应：42℃60min(miRNA加A尾反应和逆转录反应)；95℃3min(酶失活反应)。
(4)可将得到的反应液用无RNA酶水稀释10倍，放于-20℃保存或直接进行下游RT-qPCR实验。
6、荧光定量PCR反应
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将各反应试剂放于室温融化。
(2)使用时应将2×miRcute Plus miRNA Premix上下颠倒，混合均匀，并轻微离心。
(3)根据样品数量计算好每个组成成分的总量先加入一个无RNA酶的反应管中(由于引物不同，需根据检测miRNA的数量确定需要配制几份反应液)，分装至八连管中(注意加Premix时需避光，反应液的配制以及加样过程均需在冰上进行)，具体配置体系如下：2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)10μl；Forward Primer(10μM)0.4μl；Reverse Primer(10μM)0.4μl；miRNA第一链cDNA1-2μl；ddH2O补至20μl。
(4)将八连管轻微离心，再放入Real Time PCR仪中，按照以下程序进行q-PCR反应：95℃15min；94℃20sec，60℃34sec，40-45个循环。
(5)反应结束后，保存数据，通过2-△△Ct法分析miR-21的表达变化水平。
7、MiR-21和U6引物序列(表1)
表1 MiR-21和U6(内参)引物序列
结果显示：6Gyγ射线照射肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)，RT-qPCR检测到在A549细胞中随着照射后时间的延长miR-21的表达上调，在照射后12h、24h和48h与对照组相比miR-21的表达量超过了4倍，在照后48h达到了5.44倍。在Beas 2B细胞中也检测到miR-21表达量上调，照后24h和48h与对照组相比miR-21的表达量都超过了4倍，照后48h达到了4.86倍。可见：辐射诱导miR-21在A549、Beas 2B细胞中表达上调(图1中A、B)。
二、miR-21表达升高促进EMT
1、正常培养肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)。保持细胞边界清晰，形状正常贴壁，没有被微生物污染。
2、接种细胞。将状态好的细胞接种于60mm培养皿中，培育24小时内使其汇合度达到60％-80％。
3、转染miRNA mimics NC和miR-21 mimics。具体步骤如下：
(1)在miRBase数据库查询得hsa-miR-21-5p成熟序列，由苏州吉玛公司设计合成miR-21 mimics和miRNA mimics NC。
(2)转染前30分钟，弃培养液，用PBS缓冲液洗一遍细胞，用移液枪吸除多余PBS，加入5ml无血清培养液。
(3)提前准备好一皿无血清培养液(约2ml)在培养箱中预热10分钟。
(4)取EP管，编号N1、M1；N2、M2。加提前预热好的培养液50μl，然后加对应的NC12.5μl，mimics12.5ul于N1、N2和M1、M2中。另取EP管加入预热双无培养液100μl，培养液先在火上预热一下，再加入lip2000 10μl，轻轻混匀，静置5分钟。
(5)将加了lip2000的EP管中的液体转移到N1、M1；N2、M2中，轻轻混匀，静置20分钟，再混悬液体。
(6)将混悬液加到细胞培养液中，前后轻轻振荡以混匀。
(7)转染培养6-8小时后，将培养液更换成含有10％血清的培养液。
(8)在培养箱中继续培养48小时后，分别收取RNA样和蛋白质样用于后续实验。
4、总RNA提取(参考上述Trizol法收取细胞提取总RNA)。具体步骤如下：
(1)倒掉细胞培养液，4℃PBS缓冲液清洗细胞3遍。每60mm培养皿加1ml Trizol，室温放置5分钟。使其充分裂解，吹打细胞至拉丝状，吸至1.5ml EP管中。
(2)加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置5分钟。
(3)4℃，12000g离心15分钟。
(4)吸取上层水相至另一1.5ml无RNA酶EP管中。
(5)接着加入500μl异丙醇(沉淀RNA)，颠倒混匀，室温放置10分钟。
(6)4℃，12000g离心10分钟，倒掉上清，RNA沉于管底。
(7)加入1ml 75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
(8)4℃，12000g离心5分钟，倒掉上清，吸干残留，扣在位置上。
(9)室温晾干10分钟。
(10)用20μl无RNA酶水溶解沉淀。
(11)测OD值，定量RNA浓度。
(12)将样品RNA浓度调整到500ng/μl，按10μl每EP管分装RNA，冻于-80℃冰箱。
5、裂解细胞，收取蛋白质。具体步骤如下：
(1)倒掉培养液，用移液枪吸尽皿中残余培养液。
(2)向皿中加入1ml 4℃预冷的PBS，平缓摇动平皿使PBS漫过整个皿底，持续1分钟，重复三次。
(3)向皿中加入50-120μl冰上预冷的裂解液(根据细胞密度调整)，摇动平皿，使裂解液浸过整个皿。
(4)将平皿放置于冰上裂解20分钟，为使细胞充分裂解要经常摇动平皿。
(5)裂解完后，用干净的刮刀将细胞裂解液刮于培养皿一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中(整个过程尽量在冰上操作)。
(6)4℃，12000rpm离心10分钟(提前开离心机预冷)。
(7)将上清吸入另一EP管中(记录上清液体积V)，测蛋白浓度或-80℃保存。
(8)收集上清液Vμl，测浓度耗费V1μl，则剩余V2＝V-V1。按蛋白质：5×buffer＝4：1比例加入buffer，混匀，煮沸10分钟。得到样品标记为：mimic NC和miR-21 mimic。
6、RT-qPCR检测mimics转染效率。
第一步：RNA逆转录为cDNA。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将试剂盒中试剂取出解冻，放于冰中备用。
(2)将无RNA酶的反应管在冰上预冷，加入各组分试剂至总体积20μl，逆转录反应体系：Total RNA 2μl；2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl；miRNA RT Enzyme Mix 2μl；RNase-Free ddH2O补至20μl。
(3)将反应液轻柔混匀，轻微离心后，按如下程序进行miRNA的逆转录反应：42℃60min(miRNA加A尾反应和逆转录反应)；95℃3min(酶失活反应)。
(4)可将得到的反应液用无RNA酶水稀释10倍，放于-20℃保存或直接进行下游RT-qPCR实验。
第二步：荧光定量PCR反应。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将各反应试剂放于室温融化。
(2)使用时应将2×miRcute Plus miRNA Premix上下颠倒，混合均匀，并轻微离心。
(3)根据样品数量计算好每个组成成分的总量先加入一个无RNA酶的反应管中(由于引物不同，需根据检测miRNA的数量确定需要配制几份反应液)，分装至八连管中(注意加Premix时需避光，反应液的配制以及加样过程均需在冰上进行)，具体配置体系如下：2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)10μl；Forward Primer(10μM)0.4μl；Reverse Primer(10μM)0.4μl；miRNA第一链cDNA1-2μl；ddH2O补至20μl。
(4)将八连管轻微离心，再放入Real Time PCR仪中，按照以下程序进行q-PCR反应：95℃15min；94℃20sec，60℃34sec，40-45个循环。
(5)反应结束后，保存数据，通过2-△△Ct法分析miR-21的表达变化水平。
其中，用于检测MiR-21和U6(内参)的引物序列如表1所示。
7、western blot检测相关蛋白。具体操作如下：
(1)装板倒胶。
(2)上样跑胶。按70μg蛋白量每孔加得到样品mimic NC和miR-21 mimic两组。电泳程序设置电压为80V，电泳30分钟。待marker条带开始分离，说明样品已经进入分离胶，此时按电源暂停键，修改电压为120V，继续电泳60分钟。
(3)割胶转膜：设恒定电压100V，130分钟。
(4)膜放入5％封闭液中，摇床上封闭1小时。
(5)孵育一抗。将封闭好的膜取出，用TBST进行冲洗，然后进行裁剪，将裁剪好的条带放入杂交带中，进行封边，然后加入相应抗体(一抗)，封口，4℃过夜。E cadherin抗体(abcam,USA；ab76055,1:1000)；N cadherin抗体(abcam,USA；ab18203,1:1000)；Vimentin抗体(abcam,USA；ab8978,1:1000)；Twist抗体(abcam,USA；ab175430,1:1000)；GAPDH抗体(Santa Cruz,USA；sc-25778,1:1000)。
(6)取出条带在TBST中冲洗3次，每次10分钟，将一抗回收，孵育二抗，常温摇床摇动1小时。
(7)化学发光显影。将条带从二抗中取出，用TBST振荡清洗3次，每次10分钟。在显影机上进行条带显影。
8、细胞免疫荧光检测E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin和α-SMA。具体如下：
(1)接种细胞：将转染好的细胞(A和B)接种2.5×104个细胞于小室中。
A：转染miRNA mimics NC和miR-21 mimics。
B：转染48小时后消化细胞，离心收集细胞用于接种。
(2)用4℃预冷的PBS清洗细胞3次，每次2分钟。除尽PBS，加入4℃预冷的4％多聚甲醛，以完全浸没小室底部为准，室温下固定30分钟或4摄氏度过夜。
(3)除去多聚甲醛，用4℃预冷PBS清洗3次，每次5分钟(摇床上)。
(4)去除PBS，在小室中央轻轻滴加4℃预冷的0.25％Trintor X-100，室温静止破膜30分钟，去破膜液后用PBS洗1遍。
(5)加入用PBS配制的3％BSA室温封闭30分钟。
(6)吸尽封闭液，按1：200比例用1％BSA稀释一抗，每小室200μl，然后将玻片放于湿盒中4℃过夜。(可常温下孵育1小时)
(7)第二天，取出小室回收一抗，4℃预冷PBS洗3遍，每次5分钟。
(8)除去PBS，按1：400的比例用1％BSA稀释荧光二抗，然后向小室中加入200μl，放于湿盒中常温孵育1小时。从此步骤开始避光。
(9)回收二抗，PBS洗3次，每次5分钟。按1：500比例用PBS稀释DAPI，然后每小室加入200ul进行染核。放于湿盒内避光，室温下孵育20分钟。
(10)PBS清洗3次，每次5分钟，除尽PBS。
(11)除去小室，拿出载玻片，滴加40ul 10％甘油，用盖玻片倒扣于载玻片上，湿盒中4℃避光保存。
(12)使用激光共聚焦显微镜观察、拍片并分析实验结果。
其中，荧光二抗：anti-rabbit IgG-Alexa Fluor568 or an anti-mouse IgG-Alexa Fluor488(Invitrogen,1:500)。
结果显示：在A549细胞中转染miR-21 mimics，转染效率为15倍(图2中A)。Westernblot实验显示与对照组比较，过表达miR-21的A549细胞中Western blot显示E-Cadherin表达下调，N-Cadherin、vimentin和twist表达上调(图2中B)，免疫荧光显示同样结果(图2中C)。在Beas 2B细胞中转染miR-21 mimics，转染效率为8倍(图2中D)，同时过表达miR-21的Beas 2B细胞中E-Cadherin表达下调，N-Cadherin、vimentin和twist表达上调(图2中E)。提示过表达miR-21促进肺上皮细胞发生EMT。
三、抑制miR-21逆转电离辐射诱导的EMT
1、正常培养肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)。保持细胞边界清晰，形状正常贴壁，没有被微生物污染。
2、接种细胞。将状态好的细胞接种于60mm培养皿中，培育24小时内使其汇合度达到60％-80％。
3.转染miRNA inhibitor NC和miR-21 inhibitor。具体步骤如下：
(1)在miRBase数据库查询得hsa-miR-21-5p成熟序列，由苏州吉玛公司设计合成miR-21 inhibitor和miRNA inhibitor NC。
(2)转染前30分钟，弃培养液，用PBS缓冲液洗一遍细胞，用移液枪吸除多余PBS，加入5ml无血清培养液。
(3)提前准备好一皿无血清培养液(约2ml)在培养箱中预热10分钟。
(4)取EP管，编号N1、M1；N2、M2。加提前预热好的培养液50μl，然后加对应的NC12.5μl，inhibitor 12.5ul于N1、N2和M1、M2中。另取EP管加入预热双无培养液100μl，培养液先在火上预热一下，再加入lip2000 10μl，轻轻混匀，静置5分钟。
(5)将加了lip2000的EP管中的液体转移到N1、M1；N2、M2中，轻轻混匀，静置20分钟，再混悬液体。
(6)将混悬液加到细胞培养液中，前后轻轻振荡以混匀。
(7)转染培养6-8小时后，将培养液更换成含有10％血清的培养液。
(8)在培养箱中继续培养48小时后，分别收取RNA样和蛋白质样用于后续实验。
4.转染48小时进行辐照。具体操作如下：
(1)辐照前30分钟提前换液(完全培养液)。
(2)6Gy60Coγ射线照射细胞，非照射组也携带但不照射。
(4)照射后放于培养箱继续培养，48小时后进行后续实验。
5、照射后48小时提取总RNA(参考上述Trizol法收取细胞提取总RNA)。具体如下：
(1)倒掉细胞培养液，4℃PBS缓冲液清洗细胞3遍。每60mm培养皿加1ml Trizol，室温放置5分钟。使其充分裂解，吹打细胞至拉丝状，吸至1.5mlEP管中。
(2)加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置5分钟。
(3)4℃，12000g离心15分钟。
(4)吸取上层水相至另一1.5ml无RNA酶EP管中。
(5)接着加入500ul异丙醇(沉淀RNA)，颠倒混匀，室温放置10分钟。
(6)4℃，12000g离心10分钟，倒掉上清，RNA沉于管底。
(7)加入1ml 75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
(8)4℃，12000g离心5分钟，倒掉上清，吸干残留，扣在位置上。
(9)室温晾干10分钟。
(10)用20μl无RNA酶水溶解沉淀。
(11)测OD值，定量RNA浓度。
(12)将样品RNA浓度调整到500ng/μl，按10μl每EP管分装RNA，冻于-80℃冰箱。
6、裂解细胞，收取蛋白质。具体步骤如下：
(1)倒掉培养液，用移液枪吸尽皿中残余培养液。
(2)向皿中加入1ml 4℃预冷的PBS，平缓摇动平皿使PBS漫过整个皿底，持续1分钟，重复三次。
(3)向皿中加入50-120μl冰上预冷的裂解液(根据细胞密度调整)，摇动平皿，使裂解液浸过整个皿。
(4)将平皿放置于冰上裂解20分钟，为使细胞充分裂解要经常摇动平皿。
(5)裂解完后，用干净的刮刀将细胞裂解液刮于培养皿一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中(整个过程尽量在冰上操作)。
(6)4℃，12000rpm离心10分钟(提前开离心机预冷)。
(7)将上清吸入另一EP管中(记录上清液体积V)，测蛋白浓度或-80℃保存。
(8)收集上清液Vμl，测浓度耗费V1μl，则剩余V2＝V-V1。按蛋白质：5xbuffer＝4：1比例加入buffer，混匀，煮沸10分钟。得到样品标记为：inhibitor NC、IR+inhibitor NC和IR+miR-21 inhibitor。
7、RT-qPCR检测inhibitor转染效率。
第一步：RNA逆转录为cDNA。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将试剂盒中试剂取出解冻，放于冰中备用。
(2)将无RNA酶的反应管在冰上预冷，加入各组分试剂至总体积20ul，逆转录反应体系：Total RNA 2μl；2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl；miRNA RT Enzyme Mix2μl；RNase-Free ddH2O补至20μl。
(3)将反应液轻柔混匀，轻微离心后，按如下程序进行miRNA的逆转录反应：42℃60min(miRNA加A尾反应和逆转录反应)；95℃3min(酶失活反应)。
(4)可将得到的反应液用无RNA酶水稀释10倍，放于-20℃保存或直接进行下游RT-qPCR实验。
第二步：荧光定量PCR反应。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将各反应试剂放于室温融化。
(2)使用时应将2×miRcute Plus miRNA Premix上下颠倒，混合均匀，并轻微离心。
(3)根据样品数量计算好每个组成成分的总量先加入一个无RNA酶的反应管中(由于引物不同，需根据检测miRNA的数量确定需要配制几份反应液)，分装至八连管中(注意加Premix时需避光，反应液的配制以及加样过程均需在冰上进行)，具体配置体系如下：2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)10μl；Forward Primer(10μM)0.4μl；Reverse Primer(10μM)0.4μl；miRNA第一链cDNA1-2μl；ddH2O补至20μl。
(4)将八连管轻微离心，再放入Real Time PCR仪中，按照以下程序进行q-PCR反应：95℃15min；94℃20sec，60℃34sec，40-45个循环。
(5)反应结束后，保存数据，通过2-△△Ct法分析miR-21的表达变化水平。
其中，MiR-21和U6(内参)引物序列具体如表1所示。
8、western blot检测相关蛋白。具体操作如下：
(1)装板倒胶。
(2)上样跑胶。按70μg蛋白量每孔加得到样品inhibitor NC、IR+inhibitor NC和IR+miR-21 inhibitor三组。电泳程序设置电压为80V，电泳30分钟。待marker条带开始分离，说明样品已经进入分离胶，此时按电源暂停键，修改电压为120V，继续电泳60分钟。
(3)割胶转膜：设恒定电压100V，130分钟。
(4)膜放入5％封闭液中，摇床上封闭1小时。
(5)孵育一抗。将封闭好的膜取出，用TBST进行冲洗，然后进行裁剪，将裁剪好的条带放入杂交带中，进行封边，然后加入相应抗体(一抗)，封口，4℃过夜。E cadherin抗体(abcam,USA；ab76055,1:1000)；N cadherin抗体(abcam,USA；ab18203,1:1000)；Vimentin抗体(abcam,USA；ab8978,1:1000)；Twist抗体(abcam,USA；ab175430,1:1000)；GAPDH抗体(Santa Cruz,USA；sc-25778,1:1000)。
(6)取出条带在TBST中冲洗3次，每次10分钟，将一抗回收，孵育二抗，常温摇床摇动1小时。
(7)化学发光显影。将条带从二抗中取出，用TBST振荡清洗3次，每次10分钟。在显影机上进行条带显影。
9、细胞免疫荧光检测E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin和α-SMA。具体如下：
(1)接种细胞：将转染好的细胞(A和B)接种2.5x104个细胞于小室中。
A：转染miRNA inhibitor NC和miR-21 inhibitor。
B：转染48小时后，miRNA inhibitor NC+IR和miR-21 inhibitor+IR组进行辐射处理。
(2)用4℃预冷的PBS清洗细胞3次，每次2分钟。除尽PBS，加入4℃预冷的4％多聚甲醛，以完全浸没小室底部为准，室温下固定30分钟或4摄氏度过夜。
(3)除去多聚甲醛，用4℃预冷PBS清洗3次，每次5分钟(摇床上)。
(4)去除PBS，在小室中央轻轻滴加4℃预冷的0.25％Trintor X-100，室温静止破膜30分钟，去破膜液后用PBS洗1遍。
(5)加入用PBS配制的3％BSA室温封闭30分钟。(BSA)
(6)吸尽封闭液，按1：200比例用1％BSA稀释一抗，每小室200μl，然后将玻片放于湿盒中4℃过夜。(可常温下孵育1小时)
(7)第二天，取出小室回收一抗，4℃预冷PBS洗3遍，每次5分钟。
(8)除去PBS，按1：400的比例用1％BSA稀释荧光二抗，然后向小室中加入200ul，放于湿盒中常温孵育1小时。从此步骤开始避光。
(9)回收二抗，PBS洗3次，每次5分钟。按1：500比例用PBS稀释DAPI，然后每小室加入200μl进行染核。放于湿盒内避光，室温下孵育20分钟。
(10)PBS清洗3次，每次5分钟，除尽PBS。
(11)除去小室，拿出载玻片，滴加40μl 10％甘油，用盖玻片倒扣于载玻片上，湿盒中4℃避光保存。
(12)使用激光共聚焦显微镜观察、拍片并分析实验结果。
荧光二抗：anti-rabbit IgG-Alexa Fluor568 or an anti-mouse IgG-AlexaFluor488(Invitrogen,1:500)。
结果显示：将miR-21抑制剂inhibitor转染到A549细胞中，Q-PCR检测结果显示转染miR-21inhibitor后，miR-21表达为对照组的0.1倍(图3中A)，表明转染效率良好。6Gy照射后48小时，A549细胞发生EMT，当转染miR-21 inhibitor继续培养48小时，接着6Gy照射后48小时EMT发生了抑制(图3中B)，免疫荧光显示同样结果(图3中C)，说明敲低miR-21能抑制辐射诱导EMT。在Beas 2B细胞系中，将miR-21抑制剂inhibitor转染到Beas 2B细胞中，Q-PCR检测结果显示转染miR-21inhibitor后，miR-21表达为对照组的0.35倍(图3中D)，表明转染效率良好。当转染miR-21 inhibitor继续培养48小时，接着6Gy照射后48小时EMT发生了抑制(图3中E)，也显示敲低miR-21能抑制辐射诱导EMT。
四、miR-21靶向调节PTEN
生物信息学预测发现PTEN是miR-21的靶蛋白。
从Pictar、miRanda及Targetscan三个miRNA的靶基因预测网站上查询miR-21可能的靶基因，发现三个网站上均给出了PTEN与miR-21的结合位点，接着通过文献调研发现PTEN能够减缓肺纤维化，因此本发明对PTEN到底是否能够作为miR-21的靶蛋白在电离辐射诱导的EMT中发挥作用进行了验证。
RT-qPCR验证6Gyγ射线照射后A549和Beas 2B细胞中PTEN的表达，及通过RT-qPCR和western blot验证miR-21靶向PTEN。实验方法步骤：
1、正常培养肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)。保持细胞边界清晰，形状正常贴壁，没有被微生物污染。
2、接种细胞。将状态好的细胞接种于60mm培养皿中，培育24小时内使其汇合度达到60％-80％。
3、转染miRNA inhibitor NC、miR-21 inhibitor、miRNA mimic NC和miR-21mimic。
4、辐照细胞。当接种好的细胞汇合度达到60％-80％时，6Gy 60Coγ射线照射细胞。
5、Trizol法收取细胞提取总RNA。收取对照组细胞(标记为0h)，依次收取辐照后1、3、6、12、24和48小时的细胞(标记为1h、3h、6h、12h、24h和48h)。具体步骤如下：
(1)倒掉细胞培养液，4℃PBS缓冲液清洗细胞3遍。每60mm培养皿加1ml Trizol，室温放置5分钟。使其充分裂解，吹打细胞至拉斯状，吸至1.5mlEP管中。
(2)加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置5分钟。
(3)4℃，12000g离心15分钟。
(4)吸取上层水相至另一1.5ml无RNA酶EP管中。
(5)接着加入500μl异丙醇(沉淀RNA)，颠倒混匀，室温放置10分钟。
(6)4℃，12000g离心10分钟，倒掉上清，RNA沉于管底。
(7)加入1ml 75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
(8)4℃，12000g离心5分钟，倒掉上清，吸干残留，扣在位置上。
(9)室温晾干10分钟。
(10)用20μl无RNA酶水溶解沉淀。
(11)测OD值，定量RNA浓度。
(12)将样品RNA浓度调整到500ng/ul，按10μl每EP管分装RNA，冻于-80℃冰箱。
6、RNA逆转录为cDNA。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将试剂盒中试剂取出解冻，放于冰中备用。
(2)将无RNA酶的反应管在冰上预冷，加入各组分试剂至总体积20μl，逆转录反应体系：Total RNA 2μl；2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl；miRNA RT Enzyme Mix2μl；RNase-Free ddH2O补至20μl。
(3)将反应液轻柔混匀，轻微离心后，按如下程序进行miRNA的逆转录反应：42℃60min(miRNA加A尾反应和逆转录反应)，95℃3min(酶失活反应)。
(4)可将得到的反应液用无RNA酶水稀释10倍，放于-20℃保存或直接进行下游RT-qPCR实验。
7、荧光定量PCR反应。
根据天根生物公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)说明书操作，具体操作步骤如下：
(1)将各反应试剂放于室温融化。
(2)使用时应将2×miRcute Plus miRNA Premix上下颠倒，混合均匀，并轻微离心。
(3)根据样品数量计算好每个组成成分的总量先加入一个无RNA酶的反应管中(由于引物不同，需根据检测miRNA的数量确定需要配制几份反应液)，分装至八连管中(注意加Premix时需避光，反应液的配制以及加样过程均需在冰上进行)，具体配置体系如下：2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)10μl；Forward Primer(10μM)0.4μl；Reverse Primer(10μM)0.4μl；miRNA第一链cDNA 1-2μl；ddH2O补至20μl。
(4)将八连管轻微离心，再放入Real Time PCR仪中，按照以下程序进行q-PCR反应：95℃15min；94℃20sec，60℃34sec，40-45个循环。
(5)反应结束后，保存数据，通过2-△△Ct法分析miR-21的表达变化水平。
其中，MiR-21、PTEN、β-actin(内参)和U6(内参)引物序列如表2所示。
表2 MiR-21、PTEN、β-actin(内参)和U6(内参)引物序列
8、裂解细胞，收取蛋白质。具体步骤如下：
(1)倒掉培养液，用移液枪吸尽皿中残余培养液。
(2)向皿中加入1ml 4℃预冷的PBS，平缓摇动平皿使PBS漫过整个皿底，持续1分钟，重复三次。
(3)向皿中加入50-120μl冰上预冷的裂解液(根据细胞密度调整)，摇动平皿，使裂解液浸过整个皿。
(4)将平皿放置于冰上裂解20分钟，为使细胞充分裂解要经常摇动平皿。
(5)裂解完后，用干净的刮刀将细胞裂解液刮于培养皿一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中(整个过程尽量在冰上操作)。
(6)4℃，12000rpm离心10分钟(提前开离心机预冷)。
(7)将上清吸入另一EP管中(记录上清液体积V)，测蛋白浓度或-80℃保存。
(8)收集上清液Vμl，测浓度耗费V1μl，则剩余V2＝V-V1。按蛋白质：5xbuffer＝4：1比例加入buffer，混匀，煮沸10分钟。得到样品标记为：mimic NC和miR-21 mimic。
9、western blot检测相关蛋白。
(1)装板倒胶。
(2)上样跑胶。按70μg蛋白量每孔加得到样品inhibitor NC、miR-21 inhibitor、mimic NC和miR-21 mimic四组。电泳程序设置电压为80V，电泳30分钟。待marker条带开始分离，说明样品已经进入分离胶，此时按电源暂停键，修改电压为120V，继续电泳60分钟。
(3)割胶转膜：设恒定电压100V，130分钟。
(4)膜放入5％封闭液中，摇床上封闭1小时。
(5)孵育一抗。将封闭好的膜取出，用TBST进行冲洗，然后进行裁剪，将裁剪好的条带放入杂交带中，进行封边，然后加入相应抗体(一抗)，封口，4℃过夜。PTEN抗体(abcam,USA；ab32199,1:1000)；GAPDH抗体(Santa Cruz,USA；sc-25778,1:1000)。
(6)取出条带在TBST中冲洗3次，每次10分钟，将一抗回收，孵育二抗，常温摇床摇动1小时。
(7)化学发光显影。将条带从二抗中取出，用TBST振荡清洗3次，每次10分钟。在显影机上进行条带显影。
结果显示：在A549和Beas 2B细胞模型中RT-qPCR实验结果显示出照射后miR-21表达上调，PTEN表达下调(图4中A和B)。统计学相关性分析显示辐射诱导的miR-21与PTEN统计学上存在很强的负相关，相关系数为-0.82(图4中C)。
实验组分别转染miR-21 mimics和miR-21 inhibitor，RT-qPCR在mRNA水平检测发现过表达miR-21将下调PTEN的表达(图4中D)，而敲低miR-21将上调PTEN的表达(图4中F)。Western blot结果显示与RT-qPCR结果一致(图4中E、G)。可以认为miR-21负调控PTEN。
五、miR-21通过PTEN介导辐射诱导的EMT
1、正常培养肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)。保持细胞边界清晰，形状正常贴壁，没有被微生物污染。
2、接种细胞。将状态好的细胞接种于60mm培养皿中，培育24小时内使其汇合度达到60％-80％。
3、转染miRNA inhibitor NC、miR-21inhibitor和siPTEN。具体步骤如下：
(1)在miRBase数据库查询得hsa-miR-21-5p成熟序列，由苏州吉玛公司设计合成siPTEN、miR-21 inhibitor和inhibitor NC。
(2)转染前30分钟，弃培养液，用PBS缓冲液洗一遍细胞，用移液枪吸除多余PBS，加入5ml无血清培养液。
(3)提前准备好一皿无血清培养液(约2ml)在培养箱中预热10分钟。
(4)取EP管，编号N1、M1；N2、M2和siPTEN。加提前预热好的培养液50μl，然后加对应的NC 12.5μl，inhibitor12.5ul于N1、N2和M1、M2中，加siPTEN 12.5μl。另取EP管加入预热双无培养液100μl，培养液先在火上预热一下，再加入lip200010μl，轻轻混匀，静置5分钟。
(5)将加了lip2000的EP管中的液体转移到N1、M1；N2、M2中，轻轻混匀，静置20分钟，再混悬液体。
(6)将混悬液加到细胞培养液中，前后轻轻振荡以混匀。
(7)转染培养6-8小时后，将培养液更换成含有10％血清的培养液。
(8)在培养箱中继续培养48小时后，用于后续实验。
4、6Gyγ射线照射细胞。具体如下：
(1)辐照前30分钟提前换液(完全培养液)。
(2)6Gy60Coγ射线照射细胞，非照射组也携带但不照射。
(3)照射后放于培养箱继续培养，48小时后进行后续实验。
5、裂解细胞，收取蛋白质。具体步骤如下：
(1)倒掉培养液，用移液枪吸尽皿中残余培养液。
(2)向皿中加入1ml 4℃预冷的PBS，平缓摇动平皿使PBS漫过整个皿底，持续1分钟，重复三次。
(3)向皿中加入50-120μl冰上预冷的裂解液(根据细胞密度调整)，摇动平皿，使裂解液浸过整个皿。
(4)将平皿放置于冰上裂解20分钟，为使细胞充分裂解要经常摇动平皿。
(5)裂解完后，用干净的刮刀将细胞裂解液刮于培养皿一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中(整个过程尽量在冰上操作)。
(6)4℃，12000rpm离心10分钟(提前开离心机预冷)。
(7)将上清吸入另一EP管中(记录上清液体积V)，测蛋白浓度或-80℃保存。
(8)收集上清液Vμl，测浓度耗费V1μl，则剩余V2＝V-V1。按蛋白质：5×buffer＝4：1比例加入buffer，混匀，煮沸10分钟。
6、western blot检测相关蛋白。具体如下：
(1)装板倒胶。
(2)上样跑胶。按70μg蛋白量每孔加得到样品mimic NC和miR-21 mimic两组。电泳程序设置电压为80V，电泳30分钟。待marker条带开始分离，说明样品已经进入分离胶，此时按电源暂停键，修改电压为120V，继续电泳60分钟。
(3)割胶转膜：设恒定电压100V，130分钟。
(4)膜放入5％封闭液中，摇床上封闭1小时。
(5)孵育一抗。将封闭好的膜取出，用TBST进行冲洗，然后进行裁剪，将裁剪好的条带放入杂交带中，进行封边，然后加入相应抗体(一抗)，封口，4℃过夜。E cadherin抗体(abcam,USA；ab76055,1:1000)；N cadherin抗体(abcam,USA；ab18203,1:1000)；Vimentin抗体(abcam,USA；ab8978,1:1000)；Twist抗体(abcam,USA；ab175430,1:1000)；PTEN抗体(abcam,USA；ab32199,1:1000)；GAPDH抗体(Santa Cruz,USA；sc-25778,1:1000)。
(6)取出条带在TBST中冲洗3次，每次10分钟，将一抗回收，孵育二抗，常温摇床摇动1小时。
(7)化学发光显影。将条带从二抗中取出，用TBST振荡清洗3次，每次10分钟。在显影机上进行条带显影。
7、细胞免疫荧光检测E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin和α-SMA。具体如下：
(1)接种细胞：将转染好的细胞(A和B)接种2.5×104个细胞于小室中。
A：转染miRNA inhibitor NC和miR-21 inhibitor。
B：转染48小时后进行辐照处理。
(2)用4℃预冷的PBS清洗细胞3次，每次2分钟。除尽PBS，加入4℃预冷的4％多聚甲醛，以完全浸没小室底部为准，室温下固定30分钟或4摄氏度过夜。
(3)除去多聚甲醛，用4℃预冷PBS清洗3次，每次5分钟(摇床上)。
(4)去除PBS，在小室中央轻轻滴加4℃预冷的0.25％Trintor X-100，室温静止破膜30分钟，去破膜液后用PBS洗1遍。
(5)加入用PBS配制的3％BSA室温封闭30分钟。(BSA)
(6)吸尽封闭液，按1：200比例用1％BSA稀释一抗，每小室200ul，然后将玻片放于湿盒中4℃过夜。(可常温下孵育1小时)
(7)第二天，取出小室回收一抗，4℃预冷PBS洗3遍，每次5分钟。
(8)除去PBS，按1：400的比例用1％BSA稀释荧光二抗，然后向小室中加入200μl，放于湿盒中常温孵育1小时。从此步骤开始避光。
(9)回收二抗，PBS洗3次，每次5分钟。按1：500比例用PBS稀释DAPI，然后每小室加入200ul进行染核。放于湿盒内避光，室温下孵育20分钟。
(10)PBS清洗3次，每次5分钟，除尽PBS。
(11)除去小室，拿出载玻片，滴加40ul 10％甘油，用盖玻片倒扣于载玻片上，湿盒中4℃避光保存。
(11)使用激光共聚焦显微镜观察、拍片并分析实验结果。
其中，荧光二抗：anti-rabbit IgG-Alexa Fluor568 or an anti-mouse IgG-Alexa Fluor488(Invitrogen,1:500)。
结果显示：电离辐射诱导下调PTEN，诱导EMT。在A549细胞转染miR-21 inhibitor敲低miR-21时western blot显示辐射诱导的EMT减弱，PTEN表达上调。敲低PTEN和敲低miR-21的照射组western blot显示，敲低PTEN能逆转敲低miR-21减弱的EMT。免疫荧光观察到同样结果(图5中C)。结果提示miR-21通过PTEN介导辐射诱导的EMT(图5中A)。在Beas 2B细胞Western blot观察到同样地结果(图5中B)。
六、MiR-21通过PTEN调节Akt途径调节EMT
1、正常培养肺上皮细胞(A549和Beas 2B细胞)。保持细胞边界清晰，形状正常贴壁，没有被微生物污染。
2、接种细胞。将状态好的细胞接种于60mm培养皿中，培育24小时内使其汇合度达到60％-80％。
3、转染miRNA mimic NC、miR-21mimic、miRNA inhibitor NC、miR-21inhibitor和siPTEN。具体步骤如下：(参考上述转染步骤)
(1)在miRBase数据库查询得hsa-miR-21-5p成熟序列，由苏州吉玛公司设计合成miR-21-5p mimics、mimics NC、miRNA inhibitor NC和miR-21inhibitor。
(2)转染前30分钟，弃培养液，用PBS缓冲液洗一遍细胞，用移液枪吸除多余PBS，加入5ml无血清培养液。
(3)提前准备好一皿无血清培养液(约2ml)在培养箱中预热10分钟。
(4)取EP管，编号N1、M1；N2、M2和siPTEN。加提前预热好的培养液50μl，然后加对应的NC 12.5μl，inhibitor12.5μl于N1、N2和M1、M2中，加siPTEN 12.5μl。另取EP管加入预热双无培养液100μl，培养液先在火上预热一下，再加入lip2000 10μl，轻轻混匀，静置5分钟。
(5)将加了lip2000的EP管中的液体转移到N1、M1；N2、M2中，轻轻混匀，静置20分钟，再混悬液体。
(6)将混悬液加到细胞培养液中，前后轻轻振荡以混匀。
(7)转染培养6-8小时后，将培养液更换成含有10％血清的培养液。
(8)在培养箱中继续培养48小时后，用于后续实验。
4、6Gyγ射线照射细胞。
(1)辐照前30分钟提前换液(完全培养液)。
(2)6Gy60Coγ射线照射细胞，非照射组也携带但不照射。
(3)照射后放于培养箱继续培养，48小时后进行后续实验。
5、裂解细胞，收取蛋白质。具体步骤如下：
(1)倒掉培养液，用移液枪吸尽皿中残余培养液。
(2)向皿中加入1ml 4℃预冷的PBS，平缓摇动平皿使PBS漫过整个皿底，持续1分钟，重复三次。
(3)向皿中加入50-120μl冰上预冷的裂解液(根据细胞密度调整)，摇动平皿，使裂解液浸过整个皿。
(4)将平皿放置于冰上裂解20分钟，为使细胞充分裂解要经常摇动平皿。
(5)裂解完后，用干净的刮刀将细胞裂解液刮于培养皿一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中(整个过程尽量在冰上操作)。
(6)4℃，12000rpm离心10分钟(提前开离心机预冷)。
(7)将上清吸入另一EP管中(记录上清液体积V)，测蛋白浓度或-80℃保存。
(8)收集上清液Vμl，测浓度耗费V1μl，则剩余V2＝V-V1。按蛋白质：5xbuffer＝4：1比例加入buffer，混匀，煮沸10分钟。
6、western blot检测相关蛋白。
(1)装板倒胶。
(2)上样跑胶。按每孔70μg蛋白量加样。电泳程序设置电压为80V，电泳30分钟。待marker条带开始分离，说明样品已经进入分离胶，此时按电源暂停键，修改电压为120V，继续电泳60分钟。
(3)割胶转膜：设恒定电压100V，130分钟。
(4)膜放入5％封闭液中，摇床上封闭1小时。
(5)孵育一抗。将封闭好的膜取出，用TBST进行冲洗，然后进行裁剪，将裁剪好的条带放入杂交带中，进行封边，然后加入相应抗体(一抗)，封口，4℃过夜。AKT抗体(abcam,USA；1:1000)；p-AKT抗体(abcam,USA；1:1000)；PTEN抗体(abcam,USA；1:1000)；PTEN抗体(abcam,USA；ab32199,1:1000)；GAPDH抗体(Santa Cruz,USA；sc-25778,1:1000)。
(6)取出条带在TBST中冲洗3次，每次10分钟，将一抗回收，孵育二抗，常温摇床摇动1小时。
(7)化学发光显影。将条带从二抗中取出，用TBST振荡清洗3次，每次10分钟。在显影机上进行条带显影。
结果显示：在A549中过表达miR-21，PTEN表达减少，总AKT表达无明显改变，而P-AKT的表达明显增加(图6中A)。敲低miR-21后照射细胞，单独照射后总AKT表达无明显改变，P-AKT的表达明显增加，敲低miR-21照射后，能够逆转P-AKT的表达(图6中B)，而在此基础上进一步敲低PTEN又能够使P-AKT的表达增加(图6中C)，表明MiR-21能够通过PTEN调节AKT途径，进一步调节电离辐射诱导的EMT。
以上各实验结果表明电离辐射能诱导miR-21表达；诱导的miR-21通过抑制靶蛋白PTEN表达，激活Akt途径，从而促进EMT的发生。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> miR-21在调控电离辐射诱导上皮间质转化中的应用
<130> GNCLN181541
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 72
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60
ggcugucuga ca 72
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aacaucaguc ugauaagcua uu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ucaacaucag ucugauaagc ua 22
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<211> 403
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile
20 25 30
Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn
35 40 45
Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His
50 55 60
Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys
65 70 75 80
Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu
100 105 110
Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys
115 120 125
Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys
130 135 140
Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr
145 150 155 160
Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr
165 170 175
Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala
180 185 190
Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile
210 215 220
Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr
225 230 235 240
Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu
245 250 255
Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His
260 265 270
Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu
275 280 285
Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys
290 295 300
Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu
305 310 315 320
Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr
325 330 335
Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu
340 345 350
Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp
355 360 365
Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp
370 375 380
Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile
385 390 395 400
Thr Lys Val
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guaugacaac agccucaagt t 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cuugaggcug uugucauact t 21

Claims (10)

1.miR-21相关生物材料在如下(A1)或(A2)中的应用：
(A1)制备用于调控辐射诱导的上皮间质转化的产品；
(A2)调控辐射诱导的上皮间质转化；
所述miR-21相关生物材料为miR-21，或者能够促进所述miR-21表达的物质，或者能够抑制所述miR-21表达的物质；所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控辐射诱导的上皮间质转化是通过靶蛋白PTEN调控辐射诱导的上皮间质转化；
进一步地，所述调控辐射诱导的上皮间质转化是通过靶蛋白PTEN调节Akt途径进而调控辐射诱导的上皮间质转化。
3.能够抑制miR-21表达的物质在如下(a1)或(a2)中的应用：
(a1)制备用于抑制辐射诱导的上皮间质转化的产品；
(a2)抑制辐射诱导的上皮间质转化；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述能够抑制miR-21表达的物质为miR-21抑制剂；
进一步地，所述miR-21抑制剂为SEQ ID No.5所示的单链RNA。
5.miR-21或者能够促进miR-21表达的物质在如下(a1’)或(a2’)中的应用：
(a1’)制备用于促进辐射诱导的上皮间质转化的产品；
(a2’)促进辐射诱导的上皮间质转化；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述能够促进miR-21表达的物质为如下任一：miR-21模拟物；能够转录成所述miR-21的DNA，含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞。
7.能够抑制PTEN蛋白表达的物质在制备具有如下功能的产品中的应用：逆转由于抑制miR-21表达而引起的辐射诱导的上皮间质转化受到抑制的情况；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
8.能够抑制miR-21表达的物质在如下(b1)或(b2)中的应用：
(b1)制备用于治疗放射性肺纤维化的产品，或治疗放射性肺纤维化；
(b2)制备用于抑制放射性肺纤维化发生的产品，或抑制放射性肺纤维化发生；
所述miR-21为成熟miR-21或前体miR-21。
9.根据权利要求1-8所述的应用，其特征在于：
所述成熟miR-21为SEQ ID No.1所示的RNA分子；所述前体miR-21为SEQ ID No.2所示的RNA分子；和/或
所述miR-21模拟物为由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的RNA单链形成的双链RNA分子；和/或
所述PTEN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；和/或
所述能够抑制PTEN蛋白表达的物质为由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的RNA单链形成的双链RNA分子。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：所述辐射诱导的上皮间质转化为辐射诱导的肺上皮细胞所发生的上皮间质转化；
具体的，所述肺上皮细胞为A549细胞或Beas-2B细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "Homo sapiens microRNA 21 (MIR21), microRNA", 《GENBANK》 *
GENBANK: "phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN isoform PTEN [Homo sapiens]", 《GENBANK》 *
XIN LI等: "Antagonism of miR-21 reverses radiation-induced EMT in alveolar epithelial cells via PI3K/Akt pathway", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057766A (zh) * 2019-12-26 2020-04-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Snhg17在筛选用于调控放射所致肺上皮细胞间质转化和/或肺纤维化的药物中的应用

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