CN108956983A - 一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法 - Google Patents

一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法。该方法利用噬菌体展示技术，得到与特定功能纳米粒子结合的多肽分子；并通过基因测序，得到该多肽分子对应的基因序列。随后，通过分子生物学手段对烟草花叶病毒进行基因修饰，在其外壳蛋白吸附上述与特定功能纳米粒子结合的多肽分子，用于结合功能纳米粒子，得到敏感单元；同时，在其基底表面蛋白引入半胱氨酸(Cys)，利用半胱氨酸与金(Au)纳米粒子的结合机理，实现传感器敏感单元的阵列化分布。这种以烟草花叶病毒为模板来实现传感器可控阵列化的方法可极大减小阵列单元尺寸，提高传感器分辨率、灵敏度，可适用于压力传感器、气体传感器等的阵列化设计制备。

Description

一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法
技术领域
本发明属于微传感器制造技术领域，更具体地说，涉及一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法。
背景技术
随着工业化、信息化技术的不断发展进步，对传感器技术提出了更高的要求。目前传感器技术正朝着微型化、集成化、智能化、高精度、高灵敏等方向发展。传统的微传感器制造工艺主要是基于硅基加工技术，包括光刻、湿/干法刻蚀、减薄抛光、键合等，属于“自上而下”的加工工艺。这种传统的方法涉及复杂的制备工艺及昂贵的设备，并且难以实现复杂微小结构的制备及可控阵列化。
大自然界微生物种类繁多，形态各异，尺寸介于纳米、微米之间，是合成纳米、亚微米材料的天然模板。21世纪初，已有大量学者基于微生物合成众多纳米材料，并将其应用于锂离子电池、生物成像、骨细胞诱导等领域，取得显著成效。以微生物为模板，通过基因修饰技术控制微生物表面壳蛋白性能，实现其与功能纳米粒子的特异性结合；同时，依据生物识别、化学吸附机理，实现微生物的可控阵列化。
烟草花叶病毒直径为18nm，长为300nm，呈棒状结构。利用基因技术对烟草花叶病毒进行基因修饰，在其表面蛋白引入特异性多肽，用于结合功能纳米粒子，得到敏感单元；同时，在其底端蛋白引入半胱氨酸(Cys)，利用半胱氨酸与金(Au)纳米粒子的结合机理，实现传感器敏感单元的阵列化。
发明内容
本发明目的是提出一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法。该方法利用噬菌体展示技术，得到与特定功能纳米粒子结合的多肽分子，并通过基因测序，得到该多肽分子对应的基因序列。随后，通过分子生物学手段对烟草花叶病毒进行基因修饰，在其外壳蛋白引入上述与特定功能纳米粒子结合的多肽分子，用于结合功能纳米粒子，得到敏感单元；同时，在其底端蛋白引入半胱氨酸(Cys)，利用半胱氨酸与金(Au)纳米粒子的结合机理，实现传感器敏感单元的阵列化。这种以烟草花叶病毒为模板来实现微传感器阵列化的方法，可极大减小阵列单元尺寸，提高传感器分辨率、灵敏度，可适用于压力传感器、气体传感器等的阵列化设计制备。
本发明提出一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法，包括下列步骤：
步骤一：利用噬菌体展示技术得到与特定功能纳米粒子结合的多肽分子及其对应的基因序列：
A:将特定功能纳米粒子分散液与噬菌体培养液混合培养数小时后，离心得到沉淀，去除上层清液，并冲洗沉淀，去除未吸附的噬菌体；
B:对吸附特定功能纳米粒子的噬菌体进行洗脱处理，并通过大肠杆菌对洗脱得到的噬菌体进行富集培养；
C:对富集培养的噬菌体进行高通量测序，最终得到可以与特定功能纳米粒子结合的多肽对应的基因序列。
步骤二：利用重叠延伸PCR技术对烟草花叶病毒进行基因修饰
A:根据步骤一得到的基因序列，设计重叠延伸PCR扩增所需引物；
B:利用重叠延伸PCR技术，在烟草花叶病毒基因组特定位点插入步骤一中得到的与特定功能纳米粒子结合的多肽的基因序列及编码半胱氨酸(Cys)的基因序列，得到改良型烟草花叶病毒；
C:将得到的改良型烟草花叶病毒进行富集培养，并配制成相应的缓冲溶液。
步骤三：基底预处理：在清洗干净的玻璃基底上旋涂PDMS层；
步骤四：基底的阵列化处理：
A:将步骤三得到的基底置于溅射仪中，在表面溅射一层金(Au)层，随后将其安装在涂胶机上，旋涂一层光刻胶，得到复合基片；
B:将上述复合基片进行热烘处理，随后将其安装在光刻机中，并在复合基片上安装具有阵列化图形的掩模，在紫外光中曝光处理；
C:将上述复合基片置于显影液中显影，去除非图形化区域的光刻胶；
D:将上述复合基片置于金(Au)刻蚀液中，去除未被光刻胶保护的区域，随后用去离子水冲洗，去除金刻蚀液，并将其置于丙酮溶液中浸泡，得到阵列化金层基底。
步骤五：烟草花叶病毒的阵列化：
A:将步骤四得到的金层基底置于步骤二得到的烟草花叶病毒的缓冲溶液中浸泡，在摇床上振荡培养，使烟草花叶病毒底端蛋白的半胱氨酸与金纳米粒子充分结合，形成稳定的Au-S键；
B:取出上述基底，并用去离子水反复冲洗数次，去除未吸附的烟草花叶病毒，得到阵列化的烟草花叶病毒基底层。
步骤六：功能性微传感器的阵列化：
A:配制功能性纳米粒子对应的溶胶溶液；
B:将步骤五得到的阵列化烟草花叶病毒基底置于功能纳米粒子的溶胶溶液中，在摇床上振荡培养至少12h，使烟草花叶病毒表面蛋白引入的特异性多肽与功能性纳米粒子溶胶分子充分结合并结晶生长；
C：取出基底，用去离子水冲洗，去除多余溶胶溶液，得到功能性微传感器阵列层。
本发明以烟草花叶病毒为模板实现微传感器的可控阵列化制备方法，其具有以下优点：
(1)烟草花叶病毒是人类发现的第一类病毒，对其结构、性能、基因序列、蛋白性质等有着系统完善的研究。并且其在自然界中广泛存在，获取原料高效，成本低廉。
(2)通过基因技术对烟草花叶病毒进行基因修饰，利用基因控制蛋白表达的机理，可精准控制其表面蛋白或多肽的性能及结构；同时，通过病毒的自我复制，可以在短时间内得到大量性能优异的烟草花叶病毒复制品。
(3)病毒自我复制得到的复制品一致性极高，以烟草花叶病毒为模板合成的功能材料其晶相、结构、组份一致性极高，性能优良。
(4)利用半胱氨酸与金(Au)纳米粒子的共价键吸附原理，在亚微米甚至纳米尺度下对传感器的敏感功能单元进行可控阵列化设计，极大减小敏感单元的尺寸，大大提高传感器的空间分辨率。
(5)烟草花叶病毒为纳米棒状结构，通过对其阵列化排布，使其垂直分布于柔性基底表面，若用于压力传感器，可有效提高敏感单元的应变量，从而提高压力传感器的测试灵敏度；若用于气体传感器，可有效增加敏感单元与气体的接触面积，提高传感器的测试灵敏度。
(6)相比于传统的加工工艺，本发明利用化学吸附机理来实现传感器的阵列化，工艺简单，易于操作。
附图说明
图1为基于烟草花叶病毒的微传感器阵列化方法原理图。
图2为烟草花叶病毒的TEM图。
图3为烟草花叶病毒结构示意图。
图4为利用噬菌体展示技术筛选特异性蛋白(多肽)原理示意图。
图5为重叠延伸PCR技术示意图。
图6为烟草花叶病毒特异性结合功能原子示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点等更加清晰明白，以下将结合附图和实施例对本发明进行进一步地详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施案例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：基于烟草花叶病毒的压电传感器阵列化制备方法
步骤一：利用噬菌体展示技术得到可以特异性结合钛酸钡(BTO)压电纳米粒子的多肽及对应的基因序列
A:取适量钛酸钡(BTO)纳米粒子分散液，将其置于含有M13噬菌体库的缓冲液中，在室温下振荡混合培养2h，使M13噬菌体与钛酸钡纳米粒子充分混合；
B:在3500rpm转速下对上述混合液离心40min，去除上层清液；
C:用缓冲液冲洗沉淀3次，去除吸附不牢固的噬菌体；
D:对吸附特定功能纳米粒子的噬菌体进行洗脱处理，，并置于大肠杆菌培养液中富集培养30min；
E:对富集培养的噬菌体进行高通量测序，最终得到可以与特定功能纳米粒子结合的多肽对应的基因序列
步骤二：利用重叠延伸PCR技术对烟草花叶病毒进行基因修饰
A:根据步骤一得到的基因序列，设计重叠延伸PCR扩增所需引物；
B:利用重叠延伸PCR技术，在烟草花叶病毒基因组特定位点插入步骤一中得到的与特定功能纳米粒子结合的多肽的基因序列及编码半胱氨酸(Cys)的基因序列，得到改良型烟草花叶病毒；
C:将得到的改良型烟草花叶病毒进行富集培养，并按一定浓度配制成相应的缓冲溶液。
步骤三：基底预处理
A:用去离子水-无水乙醇-去离子水依次冲洗玻璃基底；
B:用氮气吹除玻璃基底上的去离子水，并在温度为80℃的恒温箱中干燥30min，随炉冷却至常温后取出玻璃基底；
C:利用旋涂机，在玻璃基底上旋涂一层10μm厚度的PDMS层，并置于90℃的恒温箱中固化2h，得到预处理基底。
步骤四：基底的阵列化处理
A:将步骤三得到的基底置于溅射仪中，在表面溅射一层50纳米厚度的金(Au)层，得到第一复合基片；
B:将第一复合基片安装在匀胶机上，在500r/min转速下滴加1ml的光刻胶BP212，预涂15s；；随后提高转速至4000r/min，匀胶60s，得到第二复合基片；
C:将第二复合基片安装在热烘板上，调节热烘板温度至80℃，软烘2min,得到第三复合基片；
D:将第三复合基片安装在光刻机中，并在其上安装具有阵列化的掩模，将第三复合基片在紫外光中曝光10s，得到第四复合基片；
E:将第四复合基片置于显影液中浸泡30s后取出，用去离子水冲洗3min定影，第四复合基片表面非阵列化图形区域的光刻胶被移除，暴露出金层，得到第五复合基片；
F:将第五复合基片置于金刻蚀液中浸泡10s后取出，用去离子水冲洗，去除暴露的金层，得到第六复合基片；
G:将第六复合基片置于丙酮中浸泡10s后取出，用去离子水冲洗，得到第七复合基片，即阵列化的金基底层。
步骤五：烟草花叶病毒的阵列化
A:将步骤四得到的阵列化金基底层置于步骤二得到的烟草花叶病毒的缓冲溶液中浸泡，在摇床上振荡培养12h，使烟草花叶病毒底端蛋白的半胱氨酸与金纳米粒子充分结合，形成稳定的Au-S键；
B:取出上述基底，并用去离子水反复冲洗3次，去除未吸附的烟草花叶病毒，得到阵列化的烟草花叶病毒基底层。
步骤六：功能型微传感器的阵列化
A:取适量醋酸钡和草酸钛钾溶于分散剂中配制成浓度为0.2mmol/L的溶液；
B:将步骤五得到的阵列化烟草花叶病毒基底置于上述溶液中，在摇床上振荡培养12h，使烟草花叶病毒表面蛋白引入的特异性多肽与功能性纳米粒子溶胶分子充分结合并结晶生长；
C:取出基底，用去离子水反复冲洗3次，去除多余溶液，得到功能型的微传感器阵列层。
实施例2：基于烟草花叶病毒的氨气传感器阵列化制备方法
步骤一：利用噬菌体展示技术得到可以特异性结合二氧化钛(TiO2)压电纳米粒子的多肽及对应的基因序列
A:取适量二氧化钛(TiO2)纳米粒子分散液，将其置于含有M13噬菌体库的缓冲液中，在室温下振荡混合培养2h，使M13噬菌体与二氧化钛(TiO2)纳米粒子充分混合；
B:在3500rpm转速下对上述混合液离心40min，去除上层清液；
C:用缓冲液冲洗沉淀3次，去除吸附不牢固的噬菌体；
D:对吸附特定功能纳米粒子的噬菌体进行洗脱处理，，并置于大肠杆菌培养液中富集培养30min；
E:对富集培养的噬菌体进行高通量测序，最终得到可以与特定功能纳米粒子结合的多肽对应的基因序列
步骤二：利用重叠延伸PCR技术对烟草花叶病毒进行基因修饰
A:根据步骤一得到的基因序列，设计重叠延伸PCR扩增所需引物；
B:利用重叠延伸PCR技术，在烟草花叶病毒基因组特定位点插入步骤一中得到的与特定功能纳米粒子结合的多肽的基因序列及编码半胱氨酸(Cys)的基因序列，得到改良型烟草花叶病毒；
C:将得到的改良型烟草花叶病毒进行富集培养，并按一定浓度配制成相应的缓冲溶液。
步骤三：基底预处理
A:用去离子水-无水乙醇-去离子水依次冲洗玻璃基底；
B:用氮气吹除玻璃基底上的去离子水，并在温度为80℃的恒温箱中干燥30min，随炉冷却至常温后取出玻璃基底；
C:利用旋涂机，在玻璃基底上旋涂一层10μm厚度的PDMS层，并置于90℃的恒温箱中固化2h，得到预处理基底。
步骤四：基底的阵列化处理
A:将步骤三得到的基底置于溅射仪中，在表面溅射一层50纳米厚度的金(Au)层，得到第一复合基片；
B:将第一复合基片安装在匀胶机上，在500r/min转速下滴加1ml的光刻胶BP212，预涂15s；；随后提高转速至4000r/min，匀胶60s，得到第二复合基片；
C:将第二复合基片安装在热烘板上，调节热烘板温度至80℃，软烘2min,得到第三复合基片；
D:将第三复合基片安装在光刻机中，并在其上安装具有阵列化的掩模，将第三复合基片在紫外光中曝光10s，得到第四复合基片；
E:将第四复合基片置于显影液中浸泡30s后取出，用去离子水冲洗3min定影，第四复合基片表面非阵列化图形区域的光刻胶被移除，暴露出金层，得到第五复合基片；
F:将第五复合基片置于金刻蚀液中浸泡10s后取出，用去离子水冲洗，去除暴露的金层，得到第六复合基片；
G:将第六复合基片置于丙酮中浸泡10s后取出，用去离子水冲洗，得到第七复合基片，即阵列化的金基底层。
步骤五：烟草花叶病毒的阵列化
A:将步骤四得到的阵列化金基底层置于步骤二得到的烟草花叶病毒的缓冲溶液中浸泡，在摇床上振荡培养12h，使烟草花叶病毒底端蛋白的半胱氨酸与金纳米粒子充分结合，形成稳定的Au-S键；
B:取出上述基底，并用去离子水反复冲洗3次，去除未吸附的烟草花叶病毒，得到阵列化的烟草花叶病毒基底层。
步骤六：功能型微传感器的阵列化
A:取适量钛酸四丁酯溶于分散剂中配制成浓度为0.2mmol/L的溶液；
B:将步骤五得到的阵列化烟草花叶病毒基底置于上述溶液中，在摇床上振荡培养12h，使烟草花叶病毒表面蛋白引入的特异性多肽与功能性纳米粒子溶胶分子充分结合并结晶生长；
C:取出基底，用去离子水反复冲洗3次，去除多余溶液，得到功能型的微传感器阵列层。

Claims (1)

1.一种以烟草花叶病毒为模板的微传感器可控阵列化制备方法，包括下列步骤：
步骤一：利用噬菌体展示技术得到与特定功能纳米粒子结合的多肽分子及其对应的基因序列：
A:将特定功能纳米粒子分散液与噬菌体培养液混合培养数小时后，离心得到沉淀，去除上层清液，并冲洗沉淀，去除未吸附的噬菌体；
B:对吸附特定功能纳米粒子的噬菌体进行洗脱处理，并通过大肠杆菌对洗脱得到的噬菌体进行富集培养；
C:对富集培养的噬菌体进行高通量测序，最终得到可以与特定功能纳米粒子结合的多肽对应的基因序列；
步骤二：利用重叠延伸PCR技术对烟草花叶病毒进行基因修饰：
A:根据步骤一得到的基因序列，设计重叠延伸PCR扩增所需引物；
B:利用重叠延伸PCR技术，在烟草花叶病毒基因组特定位点插入步骤一中得到的与特定功能纳米粒子结合的多肽的基因序列及编码半胱氨酸(Cys)的基因序列，得到改良型烟草花叶病毒；
C:将得到的改良型烟草花叶病毒进行富集培养，并配制成相应的缓冲溶液；
步骤三：基底预处理：在清洗干净的玻璃基底上旋涂PDMS层；
步骤四：基底的阵列化处理：
A:将步骤三得到的基底置于溅射仪中，在表面溅射一层金(Au)层，随后将其安装在涂胶机上，旋涂一层光刻胶，得到复合基片；
B:将上述复合基片进行热烘处理，随后将其安装在光刻机中，并在复合基片上安装具有阵列化图形的掩模，在紫外光中曝光处理；
C:将上述复合基片置于显影液中显影，去除非图形化区域的光刻胶；
D:将上述复合基片置于金(Au)刻蚀液中，去除未被光刻胶保护的区域，随后用去离子水冲洗，去除金刻蚀液，并将其置于丙酮溶液中浸泡，得到阵列化金层基底；
步骤五：烟草花叶病毒的阵列化：
A:将步骤四得到的金层基底置于步骤二得到的烟草花叶病毒的缓冲溶液中浸泡，在摇床上振荡培养，使烟草花叶病毒底端蛋白的半胱氨酸与金纳米粒子充分结合，形成稳定的Au-S键；
B:取出上述基底，并用去离子水反复冲洗数次，去除未吸附的烟草花叶病毒，得到阵列化的烟草花叶病毒基底层；
步骤六：功能性微传感器的阵列化：
A:配制功能性纳米粒子对应的溶胶溶液；
B:将步骤五得到的阵列化烟草花叶病毒基底置于功能纳米粒子的溶胶溶液中，在摇床上振荡培养至少12h，使烟草花叶病毒表面蛋白引入的特异性多肽与功能性纳米粒子溶胶分子充分结合并结晶生长；
C：取出基底，用去离子水冲洗，去除多余溶胶溶液，得到功能性微传感器阵列层。
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