CN108956676A - 一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法 - Google Patents

一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，包括以下步骤：(1)将被检测的铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱；(2)获取图谱中积分区间为1.7‑3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，判断比值是否落入0.27‑0.30的范围，是则为纯品。通过本发明可快速、简单判断是否掺假，使用者无需特别专业技能，极易操作和推广使用；通过本发明检测已知掺入石斛品种的掺假比例，无需使用标准品对照，而且通过标准化分析流程可以将铁皮石斛特征谱建立数据库，不断扩大数据库的数据量可以进一步提高铁皮石斛质量评价的可靠性。

Description

一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法。
背景技术
铁皮石斛被誉为九大仙草之首，是一味名贵的中药材。研究报道铁皮石斛具有提高免疫力、抗氧化、抗癌、预防糖尿病等功效，使其受到越来越广泛的关注。由于石斛繁多，等级参差不齐，使得铁皮石斛市场出现很多问题，特别是铁皮石斛掺假，一些不法商人为了牟取暴利恶意将价格低廉的石斛品种混杂于铁皮石斛中，尤其是铁皮石斛粉末掺假，凭借肉眼很难识别。铁皮石斛掺假会造成很严重的后果：一方面，大大降低铁皮石斛药效，危害人们的身体健康；另一方面，严重损害消费者利益，破坏铁皮石斛市场安全保障。因此，加强铁皮石斛掺假检测极其重要，势在必行。
目前，针对铁皮石斛掺假，研究者开发了很多检测方法，比如形态解剖、色谱、毛细管电泳、红外光谱、分子生物标记物等分析技术。但是这些方法都存在样品前处理复杂，分析速度慢等不足之处，因此，发展一种简单快速的铁皮石斛掺假检测方法对于打击不法商贩，维护铁皮石斛市场秩序具有举足轻重的作用。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法。
本发明所采取的技术方案如下：一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，包括以下步骤：
(1)将被检测的铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱；
(2)获取图谱中积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，判断比值是否落入0.27-0.30的范围，是则为纯品。
步骤1中，提取通过微波辅助提取。采用微波提取可以提高提取效率，缩短提取时间，增加提取稳定性，也可以通过搅拌较长时间提取铁皮石斛粉末中的成分。
用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱采用的溶剂为含0.05％内标TSP的重水，上清液与溶剂的比例为1:3-5。
核磁共振图谱首先以TSP为标准进行位置校正，然后进行相位和基线校正，得到主要成分图谱。
步骤(2)，同时计算图谱中积分区间为3.0-4.4ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，判断比值是否落入0.64-0.68的范围。这个可以作为辅助判断，提高判断的准确度。
一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假比例检测方法，包括以下步骤：
(1)对判断为掺假的被检测的铁皮石斛通过形态解剖、色谱、毛细管电泳、红外光谱、分子生物标记物中的一种或多种分析技术获得掺入的石斛品种信息；定性分析判断掺入的石斛品种信息可以采用现有技术分析；
(2)将被纯品铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集纯品铁皮石斛的主要成分图谱；
(3)将铁皮石斛和掺假样品粉末过30-60目筛，按一定的比例将铁皮石斛粉末混合步骤(1)中所述的石斛品种样品，置入水中，进行提取，采集掺假铁皮石斛的主要成分图谱；
(4)获取步骤(2)和步骤(3)所得图谱中积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，建立铁皮石斛纯度与比值之间的关系模型，构成“特征谱强度-掺假比例”关系模型；
(5)将被检测的铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集纯品铁皮石斛的主要成分图谱；
(6)获取步骤(5)所得图谱中积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，代入步骤(4)得到的“特征谱强度-掺假比例”关系模型中，得到掺假比例。
步骤1中，提取通过微波辅助提取。
用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱采用的溶剂为含0.05％内标TSP的重水，上清液与溶剂的比例为1:3-5。
核磁共振图谱首先以TSP为标准进行位置校正，然后进行相位和基线校正，得到主要成分图谱。
步骤(1)中所述的石斛品种为黄皮石斛、铜皮石斛、金钗石斛、紫皮石斛中的一种。这几种石斛品种作为掺假物所得到的“特征谱强度-掺假比例”关系模型可靠程度较高，所得到的掺假比例相对比较精确。
本发明的有益效果如下：
(1)经过研究分析，核磁图谱中区间为1.7-3.0ppm的部分可以作为铁皮石斛特征谱，掺入黄皮石斛、水草石斛、铜皮石斛、金钗石斛、紫皮石斛等对铁皮石斛特征谱的积分值影响较大，而0.27-0.30的积分比值可以作为评判标准，判断是否掺假，结果可靠，准确率大。
(2)通过本发明可快速、简单判断是否掺假，使用者无需特别专业技能，极易操作和推广使用。
(3)通过本发明检测已知掺入石斛品种的掺假比例，无需使用标准品对照，而且通过标准化分析流程可以将铁皮石斛特征谱建立数据库，不断扩大数据库的数据量可以进一步提高铁皮石斛质量评价的可靠性。
附图说明
图1为铁皮石斛核磁共振特征谱的选择：A1为氧乙酰化多糖部分(O-acetylgroup；A2为葡萄糖和甘露糖组成的单糖部分(Glucose&Mannose)。B图展示不同铁皮石斛样本核磁共振图谱A1和A2区间积分值分布情况。
图2为基于铁皮石斛特征谱A1区的“特征谱强度-掺假比例”关系模型：A、铁皮石斛+黄皮石斛；B、铁皮石斛+水草石斛；C、铁皮石斛+铜皮石斛；D、铁皮石斛+金钗石斛；E、铁皮石斛+紫皮石斛。
图3为基于铁皮石斛特征谱A2区的“特征谱强度-掺假比例”关系模型：A、铁皮石斛+黄皮石斛；B、铁皮石斛+水草石斛；C、铁皮石斛+铜皮石斛；D、铁皮石斛+金钗石斛；E、铁皮石斛+紫皮石斛。
图4为步骤6中模型预测值和实际值的相关性图。
具体实施方式
步骤1：利用微波辅助提取法获得纯品铁皮石斛粉末提取液，并用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱。步骤1具体包括以下步骤：
步骤1-1：利用微波辅助提取方法对纯品铁皮石斛粉末进行10s的提取，离心并收集上清液。微波辅助提取可以直接使用家用微波炉，例如我们使用格兰仕微波炉(功率：0-700W；时间：0-10min)辅助提取。首先，称取0.1g铁皮石斛粉末置于1.5ml离心管中，加入1ml去离子水，开盖置于微波炉中进行辅助提取10s，功率设置为700W，之后在4℃条件下10,000g离心10min，收集上清液用于后续核磁共振分析。
步骤1-2：将步骤1-1)所得上清液用核磁共振波谱仪测定铁皮石斛主要成分图谱。吸取100μL上清液加入5mm核磁管中，同时加入400μL含0.05％内标TSP的重水(D2O)。铁皮石斛主要成分图谱采集采用布鲁克600MHz核磁共振波谱仪(Bruker AVANCE III,BrukerBioSpin,Rheinstetten,Germany)，参数设置为：采样温度，25℃；数据点,64K；波谱宽度,12,000Hz；弛豫衰减时间,2s；采集时间，2.65s/scan。核磁共振图谱首先以TSP(0ppm)为标准进行位置校正，然后进行相位和基线校正。
步骤2：根据铁皮石斛主要成分鉴定将步骤1)采集的核磁共振图谱划分不同区间，计算不同区间的积分值，分析不同样品间每个积分区间的稳定性，并将稳定性好的区间作为铁皮石斛特征谱。如图1所示，铁皮石斛的核磁共振图谱主要分成两个区间，区间A1主要是氧乙酰化多糖部分(O-acetyl group)和A2主要包括葡萄糖和甘露糖组成的单糖部分(Glucose&Mannose)；分别获取这两个区间的积分值，分析不同样品的稳定性，如图1B所示，两个区间都具有较好的稳定性，因此可以作为潜在的铁皮石斛特征谱。
步骤3：将铁皮石斛和掺假样品粉末过30-60目筛，按一定的比例将掺假样品混合与铁皮石斛粉末中模拟市场上的掺假产品。掺假样品都为较为廉价且与相应中草药相近的材料，为了谋取暴利，不法商贩往往将价格低廉的材料与真正的铁皮石斛混杂，但是仅凭肉眼是无法判断伪劣。我们将拿价格较贵的铁皮石斛茎粉末掺假低廉的其它石斛品种粉末(如黄皮石斛、水草石斛、铜皮石斛、金钗石斛、紫皮石斛等)为例描述一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法。首先，将铁皮石斛和其它石斛品种叶粉末分别过40目筛，然后按10-90％间的任意比例将铁皮石斛和其它石斛品种粉末混合，模拟市场上铁皮石斛掺假产品。
步骤4：将步骤3)中模拟掺假的铁皮石斛粉末按步骤1)采集主要成分核磁共振图谱，获取步骤2)中鉴定出的铁皮石斛特征谱，以铁皮石斛掺假比例为自变量，为铁皮石斛特征谱积分值因变量，建立“特征谱强度-掺假比例”关系模型，线性关系越强说明特征谱越可靠，线性关系强弱用相关系数(R2)表示，计算公式如下：
公式中，Cov(x,y)代表x与y的协方差；Var(x)代表x的方差；Var(y)表示y的方差。
在评价铁皮石斛与多种其它低廉的石斛品种掺假的过程中，如图2所示，以A1区(氧乙酰化多糖部分)为铁皮石斛特征谱的“特征谱强度-掺假比例”关系模型线性关系都较好(R2＝0.7664-0.9587)，但是以A2区(葡萄糖和甘露糖组成的单糖部分)为铁皮石斛特征谱的“特征谱强度-掺假比例”关系模型线性关系除了与黄皮石斛掺假的较好(R2＝0.9843)，其它均较差(R2＝0.0314-0.6875)，如图3所示。因此，氧乙酰化多糖部分具有较好的普遍性和可靠性，被鉴定为铁皮石斛特征谱。
步骤5：运用双盲法试验测试铁皮石斛特征谱检测其掺假的准确度。具体包括以下步骤：
步骤5-1：志愿者建立100组铁皮石斛粉末样品，其中包括纯品铁皮石斛以及铁皮石斛和黄皮石斛、水草石斛、铜皮石斛、金钗石斛、紫皮石斛中的一种或多种以不同比例混合的样品，编好号；
步骤5-2：将步骤5-1提供的铁皮石斛样本按步骤1)和步骤2)进行核磁共振分析，并进一步获得铁皮石斛特征谱强度，积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，即核磁共振图谱中氧乙酰化多糖部分，判断是否落入0.27-0.30的范围；
步骤5-3：计算图谱中积分区间为3.0-4.4ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，即单糖部分(Glucose&Mannose)，核磁共振图谱中判断比值是否落入0.64-0.68的范围。
测试结果如下：以A1为判断标准，判断是否掺假，准确度为95％；以A2为判断标准，判断是否掺假，准确度为47％；以A1、A2同时为判断标准，判断是否掺假，准确度为98％。
步骤6：运用双盲法试验测试铁皮石斛特征谱检测其掺假比例的准确度。包括以下步骤：
步骤6-1：选择黄皮石斛作为测试，志愿者任意模拟不同掺假比例的铁皮石斛产品，但掺假比例数据不告知分析员，只提供铁皮石斛样本用于质量分析评价；
步骤6-2：将步骤5-1提供的铁皮石斛样本按步骤1)和步骤2)进行核磁共振分析，并进一步获得铁皮石斛特征谱强度，即核磁共振图谱中氧乙酰化多糖部分的积分值；
步骤6-3：将步骤5-2所得的铁皮石斛特征谱强度(即氧乙酰化多糖部分的积分值)作为步骤4)中建立的“特征谱强度-掺假比例”关系模型的输入值，计算出相应的铁皮石斛粉末掺假比例；
步骤6-4：将步骤5-3中所得的模型评价结果与真实结果进行比较，测试铁皮石斛特征谱鉴别铁皮石斛粉末是否掺假以及定量铁皮石斛粉末纯度的可靠程度。采用判定系数(r)表示模型预测值和真实值之间的相近程度，r值范围在0-1之间，越接近于1表示预测值和真实值之间越接近，说明铁皮石斛特征谱的可靠程度越大，计算公式如下：
公式中，N代表样本总数；VPi代表模型预测值；VAi和分别表示真实值以及相应的平均值。
如图4所示，通过双盲法检验，基于以氧乙酰化多糖部分为铁皮石斛特征谱的“特征谱强度-掺假比例”关系模型预测铁皮石斛纯度与实际纯度非常接近，r值为0.9982，由此说明氧乙酰化多糖部分可以作为铁皮石斛特征谱。
以上所述仅为本发明的一种实施例，并非用来限制本发明的保护范围；本发明的保护范围由权利要求书中的权利要求限定，并且凡是依发明所作的等效变化与修改，都在本发明专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将被检测的铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱；
(2)获取图谱中积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，判断比值是否落入0.27-0.30的范围，是则为纯品。
2.根据权利要求1所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，其特征在于：步骤1中，提取通过微波辅助提取。
3.根据权利要求1所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，其特征在于：用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱采用的溶剂为含0.05％内标TSP的重水，上清液与溶剂的比例为1:3-5。
4.根据权利要求3所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，其特征在于：核磁共振图谱首先以TSP为标准进行位置校正，然后进行相位和基线校正，得到主要成分图谱。
5.根据权利要求1所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假检测方法，其特征在于：步骤(2)，同时计算图谱中积分区间为3.0-4.4ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，判断比值是否落入0.64-0.68的范围。
6.一种基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假比例检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对判断为掺假的被检测的铁皮石斛通过形态解剖、色谱、毛细管电泳、红外光谱、分子生物标记物中的一种或多种分析技术获得掺入的石斛品种信息；
(2)将被纯品铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集纯品铁皮石斛的主要成分图谱；
(3)将铁皮石斛和掺假样品粉末过30-60目筛，按一定的比例将铁皮石斛粉末混合步骤(1)中所述的石斛品种样品，置入水中，进行提取，采集掺假铁皮石斛的主要成分图谱；
(4)获取步骤(2)和步骤(3)所得图谱中积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，建立铁皮石斛纯度与比值之间的关系模型，构成“特征谱强度-掺假比例”关系模型；
(5)将被检测的铁皮石斛粉碎，置入水中，进行提取，然后离心收集上清液，并用核磁共振波谱仪采集纯品铁皮石斛的主要成分图谱；
(6)获取步骤(5)所得图谱中积分区间为1.7-3.0ppm的积分值相对图谱总积分值的比值，代入步骤(4)得到的“特征谱强度-掺假比例”关系模型中，得到掺假比例。
7.根据权利要求6所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假比例检测方法，其特征在于：步骤1中，提取通过微波辅助提取。
8.根据权利要求6所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假比例检测方法，其特征在于：用核磁共振波谱仪采集主要成分图谱采用的溶剂为含0.05％内标TSP的重水，上清液与溶剂的比例为1:3-5。
9.根据权利要求8所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假比例检测方法，其特征在于：核磁共振图谱首先以TSP为标准进行位置校正，然后进行相位和基线校正，得到主要成分图谱。
10.根据权利要求6所述的基于核磁共振特征谱的铁皮石斛粉末掺假比例检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的石斛品种为黄皮石斛、铜皮石斛、金钗石斛、紫皮石斛中的一种。
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