CN108949882A

CN108949882A - 提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法

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Publication number: CN108949882A
Application number: CN201810899721.9A
Authority: CN
Inventors: 张益奇; 涂丹; 戴志远
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: CN108949882B

Abstract

本发明公开了一种提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，包括如下步骤：对鱼鳞进行洗涤、除杂处理；将洗净后鱼鳞于0.4～2.0MPa压力下进行汽爆处理，然后再热水浸提、酶解；灭酶后过滤，所得滤液为粗酶解液，将粗酶解液进行真空浓缩后喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白肽粉；过滤所得的残渣干燥、粉碎后煅烧，得到羟基磷灰石。该方法采用汽爆法处理鱼鳞，使其在高温、高压、高湿条件下发生软化，以简化提取工艺、提高提取效率。本发明工艺简单、绿色环保、提取效率高。

Description

提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种利用汽爆处理提取鱼鳞中胶原蛋白肽和羟基磷灰石的方法。

背景技术

作为水产加工大国，我国水产品加工过程中产生大量的鱼皮、鱼鳞等下脚料，富含胶原蛋白资源。目前生产胶原蛋白制品的原料基本上是猪、牛等陆生动物的皮和骨，由于陆生动物的生存环境恶化导致疯牛病等流行病的发生，使其制品的使用受到限制。寻找陆生动物外的胶原蛋白原料成为当务之急。水产加工废弃物尤其是鱼鳞是理想的制备胶原蛋白肽和羟基磷灰石的替代原料。从水产动物中提取安全、无害的胶原蛋白成为近几年国内外研究的热门课题。

鱼鳞中有机物占41％-55％，主要是胶原蛋白、鱼鳞硬蛋白等，其余多为羟基磷灰石等无机物成分。鱼鳞中胶原蛋白的提取存在一定难度，目前通常采用大量酸、碱浸泡处理鱼鳞，以脱去鱼鳞中的灰分，使得胶原蛋白脱离羟基磷灰石的束缚。如CN103333220B提供了一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的脱脂、脱灰方法，首先在90-100℃加热10-20分钟，再经组织捣碎机粉碎处理，最后用浓盐酸和95％乙醇混合物进行脱脂、脱灰处理。CN 103211080B公开了一种通过鱼鳞制备胶原蛋白粉的方法，该方法首先需要对鱼鳞进行脱腥、脱钙、洗涤、冷冻粉碎处理，再在2.5-3.0MPa下汽爆处理8-10min，该工艺路线复杂且生产成本较高，所用汽爆压力过高，所用时间过长，且此条件下的鱼鳞易降解产生有害物质。上述技术中盐酸浸泡时间长且产生大量废水，污染环境。从鱼鳞中提取的羟基磷灰石多为通过直接煅烧法得到，造成蛋白资源的极大浪费。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鱼鳞胶原蛋白肽粉及羟基磷灰石的制备方法，该方法采用汽爆法处理鱼鳞，使其在高温、高压、高湿条件下发生软化，以简化提取工艺、提高提取效率。本发明工艺简单、绿色环保、提取效率高。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，包括如下步骤：

1)、洗涤：

对鱼鳞进行洗涤、除杂处理；

2)、汽爆处理：

将步骤1)所得的洗净后鱼鳞装入汽爆机爆腔，在0.4～2.0MPa压力下进行汽爆处理，汽爆处理时间为30～500秒；

3)、热水浸提：

按照1:3～15的重量比，在步骤2)所得的汽爆处理后鱼鳞中加入水于45～65℃恒温振荡 0.5～2h，搅拌转速为100-150r/min(从而提取胶原蛋白等)；得鱼鳞蛋白提取液；

4)、酶解：

先将鱼鳞蛋白提取液pH调节至6～9，然后加入占汽爆处理后鱼鳞重量0.05％～1％的酶制剂，于45～65℃酶解0.5～2h；

5)、分离：

步骤4)的酶解时间到后，灭酶，过滤(以除去不溶性残渣)，所得滤液为粗酶解液；

6)、干燥：

将粗酶解液进行真空浓缩至固形物质量分数达到30％～40％，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白肽粉(含水率≤5％)；

7)、煅烧：

将步骤5)过滤所得的残渣干燥、粉碎后置于马弗炉中在600～900℃煅烧0.5～1h，得到羟基磷灰石。

备注说明：

步骤6)中，真空浓缩为在-0.1MPa的真空度、60±5℃温度下进行浓缩；喷雾干燥时进风温度180±20℃，出风温度80±10℃。

步骤7)中，先干燥至含水率≤10％，粉碎至过100目的筛，再进行煅烧。

作为本发明的提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法的改进，所述步骤4)中的酶制剂为以下至少一种的蛋白酶：真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。

上述蛋白酶均能通过常规市购的方式获得，例如，碱性蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶，诺维信公司，酶活力为3.0AU/g；胰蛋白酶的酶活力为250U/mg。

作为本发明的提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法的进一步改进，所述步骤5) 中，于85～95℃保持8～20min灭酶，冷却至50～60℃后再进行过滤。

作为本发明的提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法的进一步改进，所述步骤4) 为：加入占汽爆处理后鱼鳞重量0.5％的碱性蛋白酶以及加入占汽爆处理后鱼鳞重量0.5％的胰蛋白酶，于50℃酶解1.5h。

在本发明中，鱼鳞在洗涤后不经过切割、粉碎、脱灰处理而直接使用(即，将洗净后的鱼鳞直接进行步骤2)。

在本发明中，胶原蛋白肽的检测条件如下：

分析柱：TSKgel G2000SWxl(7.8×300mm，Tosh)，检测波长：220nm，洗脱液：45％乙腈-55％水溶液(0.1％TFA)，流速：0.5mL/min。相对分子质量校正曲线所用标准品：HHL(429Da)、杆菌肽(1422Da)、抑肽酶(6500Da)、细胞色素C(12400Da)，由Sigma公司提供。

本发明与现有技术相比具有如下技术优势：

1、本发明利用汽爆技术处理鱼鳞，使得鱼鳞中蛋白质适度变性，有利于胶原蛋白的溶出；即，采用汽爆处理从而坏鱼鳞胶原蛋白三维结构的稳定性，使其从羟基磷灰石束缚中解离出来，可短时间实现预处理效果，极大降低了工业生产的单位能耗，降低生产成本，所用鱼鳞不需粉碎、不需酸碱浸泡处理，工艺简单、易于操作。

2、采用酶法综合利用工艺，使鱼鳞变为可溶性小肽，由于酶解反应条件温和，避免了剧烈化学反应，且小分子胶原蛋白肽的得率高、预处理后(即，汽爆处理)鱼鳞对酶的可及性增加，可显著提高酶解效率，降低了酶制剂用量。

3、本发明的方法可显著降低胶原蛋白肽生产成本，所得鱼鳞胶原蛋白肽分子量小于3000 Da的肽段占总氮的92％以上(最高能达98.6％)，灰分含量小于1.0％。

4、本发明将残渣进一步干燥、粉碎、煅烧，可得羟基磷灰石；从而充分实现原料的合理利用。

5、本发明无需酸、碱、粉碎预处理，且不会对鱼鳞胶原蛋白肽和羟基磷灰石的活性造成影响。

6、本发明方法简单、绿色、高效，生产成本低、加工周期短；鱼鳞胶原蛋白肽粉收率高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明方法制备的鱼鳞胶原蛋白肽的凝胶色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下案例中，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH值；

搅拌转速为100-150r/min。

实施例1、一种提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，依次进行如下步骤：

1)、洗涤(此为常规技术)：

对鱼鳞进行洗涤、除杂处理；

2)、汽爆处理：

将步骤1)所得的洗净后鱼鳞装入汽爆机爆腔，在0.6MPa压力下进行汽爆处理，保压时间1min，泄压后取出；

3)、热水浸提：

在步骤2)所得的汽爆处理后鱼鳞中加入10重量倍的水，于50℃恒温振荡2h，转速为 125r/min；得鱼鳞蛋白提取液；

4)、酶解：

先将鱼鳞蛋白提取液pH调节至8，然后加入占汽爆处理后鱼鳞重量1％的Alcalase碱性蛋白酶(诺维信公司，酶活力为3.0AU/g)，于搅拌下55℃酶解1h；

5)、分离：

步骤4)的酶解时间到后，于90℃保持10min灭酶，冷却至50～60℃后再进行过滤(以除去不溶性残渣)，所得滤液为粗酶解液；

6)、干燥：

将粗酶解液进行真空浓缩(-0.1MPa的真空度、60℃温度下进行浓缩)至固形物质量分数达到30％，喷雾干燥(进风温度180℃，出风温度80℃)，得鱼鳞胶原蛋白肽粉(含水率≤ 5％)；

每1kg汽爆处理后鱼鳞，可得到鱼鳞胶原蛋白肽粉175g，即，收率为17.5％。

经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于3000Da的肽段占总氮量98.6％，小于200Da的肽段占总氮量0.9％。

7)、煅烧：

将步骤5)过滤所得的残渣干燥(干燥至含水率≤10％)、粉碎后(粉碎至过100目的筛) 置于马弗炉中在700℃煅烧1h，得到羟基磷灰石，通过计算得羟基磷灰石的收率为31.5％，钙磷比为1.69。

实施例2、一种提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，依次进行如下步骤：

1)、洗涤：

对鱼鳞进行洗涤、除杂处理；

2)、汽爆处理：

将步骤1)所得的洗净后鱼鳞装入汽爆机爆腔，在1.0MPa压力下进行汽爆处理，保压时间0.5min，泄压后取出；

3)、热水浸提：

在步骤2)所得的汽爆处理后鱼鳞中加入8重量倍的水，于50℃恒温振荡2h，转速为125r/min；得鱼鳞蛋白提取液；

4)、酶解：

先将鱼鳞蛋白提取液pH调节至7.5，然后加入占汽爆处理后鱼鳞重量1％的胰蛋白酶(酶活力为250U/mg)，于搅拌下50℃酶解1.5h；

5)、分离：

步骤4)的酶解时间到后，于95℃保持10min灭酶，冷却至50～60℃后再进行过滤所得滤液为粗酶解液；

6)、干燥：

将粗酶解液进行真空浓缩至固形物质量分数达到40％，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白肽粉 (含水率≤5％)；

每1kg汽爆处理后鱼鳞，可得到鱼鳞胶原蛋白肽粉189g，即，收率为18.9％。

经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于3000Da的肽段占总氮的92.2％，小于200Da的肽段占总氮量0.6％。

7)、煅烧：

将步骤5)过滤所得的残渣干燥、粉碎后于马弗炉中在800℃煅烧1h，得到羟基磷灰石，通过计算得羟基磷灰石的收率为30.6％，钙磷比为1.64。

实施例3、一种提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，依次进行如下步骤：

1)、洗涤：

对鱼鳞进行洗涤、除杂处理；

2)、汽爆处理：

将步骤1)所得的洗净后鱼鳞装入汽爆机爆腔，在0.4MPa压力下进行汽爆处理，保压时间3min，泄压后取出；

3)、热水浸提：

在步骤2)所得的汽爆处理后鱼鳞中加入12重量倍的水，于50℃恒温振荡2h，转速为 125r/min；得鱼鳞蛋白提取液；

4)、酶解：

先将鱼鳞蛋白提取液pH调节至7.5，然后加入占汽爆处理后鱼鳞重量1％的胰蛋白酶(酶活力为250U/mg)，于搅拌下50℃酶解2h；

5)、分离：

步骤4)的酶解时间到后，于90℃保持10min灭酶，冷却至50～60℃后再进行过滤，所得滤液为粗酶解液；

6)、干燥：

将粗酶解液进行真空浓缩至固形物质量分数达到30％，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白肽粉 (含水率≤5％)；

每1kg汽爆处理后鱼鳞，可得到鱼鳞胶原蛋白肽粉154g，即，收率为15.4％。

经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于3000Da的肽段占总氮的94.7％，小于200Da的肽段占总氮量1.1％。

7)、煅烧：

将步骤5)过滤所得的残渣干燥、粉碎后置于马弗炉中在900℃煅烧1h，得到羟基磷灰石，通过计算得羟基磷灰石的收率为29.2％，钙磷比为1.60。

实施例4、将实施例1步骤4)中的“1％的Alcalase碱性蛋白酶”改成“0.5％的Alcalase 碱性蛋白酶+0.5％胰蛋白酶”，其余等同于实施例1。

所得结果为：

鳞胶原蛋白肽粉的收率为20.5％；经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于 3000Da的肽段占总氮的98.1％，小于200Da的肽段占总氮量1.5％；通过计算得羟基磷灰石的收率为32.3％，钙磷比1.70。

对比例1、

将实施例1步骤4)的酶解改为：先将鱼鳞蛋白提取液pH调节至4.0，然后加入占汽爆处理后鱼鳞重量0.03％的胃蛋白酶，于40℃，120r/min下进行酶水解反应40分钟；

其余等同于实施例1。

所得结果为：

鱼鳞胶原蛋白肽粉的收率为9.8％；经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于 3000Da的肽段占总氮的55.21％，小于200Da的肽段占总氮量4.8％，羟基磷灰石的收率为 25.6％。

对比例2、将实施例1步骤2)的汽爆处理由“0.6MPa、1min”改成“2.5MPa、8分钟”；

其余等同于实施例1。

所得结果为：

鱼鳞胶原蛋白肽粉收率为10.7％；经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于 3000Da的肽段占总氮的76.5％，小于200Da的肽段占总氮量21.7％；羟基磷灰石的收率为 24.6％。

对比例3、将实施例1步骤3)中的“50℃恒温振荡2h”改成为“20℃室温下恒温振荡4h”；其余等同于实施例1。

所得结果为：

鱼鳞胶原蛋白肽粉收率为12.5％；经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于 3000Da的肽段占总氮的87.2％，小于200Da的肽段占总氮量12.1％；羟基磷灰石的收率为 26.1％。

对比例3-2、将实施例1步骤3)中的“50℃恒温振荡2h”改成为“90℃恒温振荡2h；其余等同于实施例1。

所得结果为：

鱼鳞胶原蛋白肽粉收率为13.8％；经凝胶过滤法检测，该鱼鳞胶原蛋白肽中分子量小于 3000Da的肽段占总氮的85.7％，小于200Da的肽段占总氮量14.3％；羟基磷灰石的收率为 26.5％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)、洗涤：

对鱼鳞进行洗涤、除杂处理；

2)、汽爆处理：

3)、热水浸提：

按照1:3～15的重量比，在步骤2)所得的汽爆处理后鱼鳞中加入水于45～65℃恒温振荡0.5～2h，搅拌转速为100-150r/min；得鱼鳞蛋白提取液；

4)、酶解：

5)、分离：

步骤4)的酶解时间到后，灭酶，过滤，所得滤液为粗酶解液；

6)、干燥：

将粗酶解液进行真空浓缩至固形物质量分数达到30％～40％，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白肽粉；

7)、煅烧：

2.根据权利要求1所述的提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，其特征在于所述步骤4)中的酶制剂为以下至少一种的蛋白酶：真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，其特征在于所述步骤5)中，于85～95℃保持8～20min灭酶，冷却至50～60℃后再进行过滤。

4.根据权利要求1～3任一所述的提取鱼鳞胶原蛋白肽粉和羟基磷灰石的方法，其特征在于所述步骤4)为：加入占汽爆处理后鱼鳞重量0.5％的碱性蛋白酶以及加入占汽爆处理后鱼鳞重量0.5％的胰蛋白酶，于50℃酶解1.5h。