CN108929258A - 一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Rho激酶抑制剂，结构如式Ⅰ所示：其中：R1、R2选自‑(CH2)nCH3，其中，n＝0～4。本发明通过ROCK I的酶抑制活性实验和癌细胞体外抑制实验证实式Ⅰ所示的化合物具有ROCK I的抑制活性，具有多种癌细胞的抑制活性，有机会成为治疗癌症的化学药物注册分类中的一类新药。

Description

一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用
技术领域
本发明涉及一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用
背景技术
Rho激酶(Rho-associated kinases,ROCK)是参与细胞有丝分裂粘附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶。包括ROCK I和ROCK II，前者主要存在于非神经组织如心脏、肺、骨胳肌等细胞，后者主要存在于中枢神经系统，如海马锥体神经元、大脑皮质、小脑浦肯野细胞等。
大量研究表明，Rho/ROCK信号通路参与了多种癌症疾病，比如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、脑癌、头颈部癌、睾丸癌和膀胱癌。ROCK的异常表达会引起几种类型癌细胞的入侵和转移，在体内外模型中发现，由ROCK抑制剂引起的Rho/ROCK通路抑制可以有效地抑制肿瘤生长。K.Itoh等发现Y27632可以抑制肌动球蛋白的Rho介导的激活，也可以抑制MM1肝癌细胞的入侵活动，此外，连续给予Y27632可以减少植入到同基因小鼠腹腔内的MM1细胞的散播。S.Liu等观察到在转移性人类乳腺瘤和乳腺肿瘤细胞中，ROCK被超高表达，有趣的是，ROCK的超表达赋予局部性MCF-7乳腺癌细胞一种转移性表现。此外，由Y27632引起的ROCK抑制或以ROCK为靶向的体外细胞迁移和扩散，也可以在体内阻止细胞迁移到人类的骨骼中。RKI1447是2012年发现的一种选择性的ROCK抑制剂，在转基因鼠模型中，RKI1447表现出十分重要的抗乳腺癌的反侵略性和抗肿瘤活性。这些实验证明了ROCK抑制剂在预防肿瘤侵袭、迁移和增殖方面的治疗潜能。
目前使用的ROCK抑制剂大概分成以下几类：异喹啉类、苯并吡唑类、尿素类、氨基嘧啶类。新型ROCK抑制剂的研发进展缓慢，新型ROCK抑制剂的研发具有重要意义。
发明内容
本发明提供的化合物为在已有的抑制剂信息和ROCK的空间结构信息的基础上设计的一类新型结构类型的化合物。ROCK精细结构为A、F和D区共同形成与ATP结合的口袋结构。具体为如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物，
其中，R1、R2选自-(CH2)nCH3，其中，n＝0～4。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物的合成方法，
在合适的溶剂中，向1,1,1-三氟-5-甲基己烷-2,4-二酮和(E)-(2-硝基丙-1-烯-1-基)苯的溶液中加入DBU后反应得到1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮(中间体1)。
所述的合适的溶剂选自2-丙醇，二氯甲烷，DCM，THF等，优选THF和2-丙醇的溶液。
以乙醇为溶剂，Raney镍为催化剂在合适的压力下将中间体1进行氢化，压力范围为2-10atm，优选4atm。经后续处理后得到2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2H-吡咯-4-基)丙-1-酮(中间体2)。
以THF和乙醇的混合溶液为溶剂，向中间体2中，加入氰基硼氢化钠和溴甲酚绿。反应结束后经硅胶色谱纯化得到2-甲基-1-((2R,3R,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3)。硅胶色谱中的洗脱剂可以为EtOAc-己烷，比例范围可以是65％:35％～95％:5％，优选85％EtOAc-15％己烷。
中间体3和相应的溴取代化合物在DIPEA和乙腈的混合物在50℃下加热1小时，经后续处理后可以得到本发明所述的化合物(式Ⅰ)。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐作为Rho激酶抑制剂的应用。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗癌症药物中的应用。
进一步地，所述的癌症选自肝癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌。
本发明还提供了一种药物组合物，包含如式Ⅰ所示的化合物和/或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的化合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。
为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明教溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要的话，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。
为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄著胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。
为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。
为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。根据需要，在治疗精神分裂症期间，也可加入着色剂、防腐剂、香料、调味剂、香化剂和其它药物等。
本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。
本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。
具体实施方式
中间体1：1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮的合成：
将1,1,1-三氟-5-甲基己烷-2,4-二酮(35.0g，0.192mol)和(E)-(2-硝基丙-1-烯-1-基)苯(37.9g，0.232mol)溶于210mL的THF和35mL的2-丙醇溶液中。加入1g1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一碳-7-烯(DBU)，然后将反应混合物在室温下搅拌2小时，在搅拌期间，隔20分钟后再加入0.65g的DBU，1小时后再加入0.25g的DBU。2小时后，TLC(95％CH2Cl2-5％EtOAc)显示大部分起始原料消失。将溶剂在真空中浓缩并加入500mL甲苯。有机相用稀盐酸洗涤，然后再用NaCl溶液洗涤。用Na2SO4干燥后，浓缩溶液，残余物经硅胶层析，用3:1己烷-EtOAc洗脱，得到中间体1的异构体混合物：1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮，产量是53.82g，产率为78％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.79(d,3H),2.39(m,1H),3.16(m,1H),3.46(dd,1H),3.97(d,1H),5.74(m,1H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:17.41,18.56,38.70,42.88,48.41,64.03,80.87,123.34,126.16,128.14,130.12,140.22,176.69,204.04.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:360[M+H]。
中间体2：2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2H-吡咯-4-基)丙-1-酮的合成：
将溶解在500mL乙醇中的中间体1(41.00g，0.114mol)在4atm压力下用81.00gRaney镍(在使用前用乙醇洗涤三次)氢化。过滤催化剂后，浓缩溶液，残余物经硅胶层析，用溶解在CH2Cl2中的8.5％EtOAc的溶液洗脱，得到2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2H-吡咯-4-基)丙-1-酮(中间体2)，32.23g，产率95％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.14(d,3H),2.19-2.34(m,2H),3.71(d,1H),4.28(m,1H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:18.56,20.06,38.70,54.46,58.81,75.60,124.23,124.79,128.52,129.68,141.16,160.67,208.88.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:298[M+H].
中间体3：2-甲基-1-((2R,3R,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮的合成：
将中间体2(21.89g，0.074mol)溶于27mLTHF和54mL乙醇中。加入氰基硼氢化钠(23.50g，0.374mol)和5mg溴甲酚绿。向该蓝色溶液中滴加浓HCl的乙醇溶液(1:2)，以使溶液颜色始终保持浅黄绿色的速率滴加。在不滴加HCl时，溶液颜色持续保持黄色，然后将该溶液再搅拌20分钟。将溶液真空浓缩，然后用CHCl3萃取，用KHCO3溶液洗涤。将有机相分离，用Na2SO4干燥并浓缩。将残余物在硅胶上进行色谱分离，用85％EtOAc-15％己烷洗脱，得到13.75g2-甲基-1-((2R,3R,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3)和7.75g2-甲基-1-((2R,4R)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3”)的混合物。用纯乙酸乙酯进一步洗脱，得到4.18g纯的2-甲基-1-((2R,3S,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3’)。将上述纯的中间体3’(4.18g)溶于10mL乙醇中，加入20滴乙醇钠的乙醇溶液。将该溶液回流过夜。TLC(EtOAc)显示无起始物质。用乙醇中的HCl中和过量的NaOEt，并将溶液真空浓缩。将残余物溶于甲苯中并用KHCO3溶液洗涤。将甲苯溶液用Na2SO4干燥并浓缩，得到3.89g经TLC(EtOAc)纯化的中间体3。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.06(d,3H),1.51(s,1H),2.34(m,1H),2.44(m,1H),3.43(t,1H),3.63(m,1H),4.10(m,1H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:17.94,18.56,38.52,54.97,58.49,64.08,71.00,124.96,128.50,129.49,129.79,141.06,217.91.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:300[M+H]。
实施例1：N,N-二丁基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成：
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二丁基溴乙酰胺(21.50g，0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二丁基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量38.85g，产率为98％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.90(t,6H),1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.06(d,3H),1.30(m,4H),1.51(m,4H),2.05-2.26(m,2H),3.21-3.44(m,6H),3.74(s,1H),4.14-4.31(m,2H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:14.00,16.36,18.56,20.75,28.88,38.52,45.35,51.11,57.03,57.65,64.51,65.96,125.28,127.07,128.47,130.16,140.97,172.34,217.97.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:470[M+H]
实施例2：N,N-二乙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二乙基溴乙酰胺(0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二乙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量32.96g，产率为94％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:413[M+H]。
实施例3：N,N-二丙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二丙基溴乙酰胺(0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二丙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量34.08g，产率为91％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:441[M+H]。
实施例4：N,N-二甲基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二甲基溴乙酰胺(0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二甲基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量30.39g，产率为93％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:385[M+H]。
实施例5～实施例9：
合成方法如实施例1～实施例4所述，得到实施例5～9如下表所示：
试验例1：ROCK I的酶抑制活性实验
一、实验原理：
ROCK I抑制活性的测量采用了Invitrogen公司的Z′-LYTETM技术，该技术基于荧光共振能量转移(FRET)原理，以磷酸化和非磷酸化多肽对蛋白水解切割的敏感性差异为基础。
二、实验方法：
1、试剂的准备
激酶缓冲液：将2ml的5X激酶缓冲液用水稀释到10ml；
化合物：将所要测试的化合物用水稀释到一个浓度梯度；
ROCK激酶/底物的混合溶液：配制2250μLROCK/底物的混合溶液；
酶的浓度为10ng/ml，底物的浓度为4μM，溶剂为激酶缓冲液；
磷酸化多肽溶液：将2μL的丝氨酸/苏氨酸磷酸化7肽加到498μL的激酶缓冲液中，充分混匀；
ATP溶液：配制1110μL的ATP溶液，浓度为50μM，溶剂为激酶缓冲液；
显色剂：按1:32768的比例稀释显色剂A。
2、实验步骤
(1)将2.5μL配制好的化合物溶液加到黑色384孔板；
(2)加入5μL ROCK激酶/底物的混合溶液；
(3)加入2.5μL的ATP溶液；
(4)将384孔板在室温下震荡并培养1小时；
(5)将5μL显色剂加入到孔板中，继续反应1小时；
(6)将孔板置于酶标仪中读数。
三、实验结果：
使用不同浓度的本发明化合物进行ROCK I的抑制活性实验，发现本发明化合物具有很好的抑制活性，其半抑制浓度IC50如下表所示：
实施例 IC50(μM)
实施例1 2.32
实施例2 0.57
实施例3 0.50
实施例4 1.64
实施例5 1.82
实施例6 1.55
实施例7 1.18
实施例8 0.71
实施例9 0.98
试验例2：癌细胞体外抑制实验
一、实验原理
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。二、实验步骤
(1)取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，RPMI 1640细胞培养液调细胞悬液浓度为6×104个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h，细胞贴壁。
(2)移走RPMI 1640细胞培养液，加入浓度梯度的待测药物的RPMI 1640细胞培养液100μL，每个浓度设6个平行孔。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
(3)96孔板离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含0.5％MTT的RPMI1640细胞培养液100μL，继续培养4h。
(4)移走上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使formazan结晶充分溶解。
(5)在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的光密度(OD值)。
(6)平行孔OD值以mean±SD表示，计算抑制率公式：[(OD对照组-OD空白组)-(OD药物实验组-OD空白组)]/(OD对照组-OD空白组)*100％。
对照组(加入浓度梯度的待测药物改为加入不含药物的RPMI 1640细胞培养液)；空白组(与对照组相比，不加细胞)。
(7)采用GraphPad Prism 5数据处理软件，通过绘制量效曲线计算半数抑制浓度(IC50)。
三、实验结果
在肝癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞株、乳腺癌细胞株、膀胱细胞株等上的研究中均发现ROCK的过高表达，本实验采用多种癌细胞来证实本发明化合物抗癌细胞活性，使用的4种癌细胞为人肺癌细胞A549，人肝癌细胞SMMC-7721，人大细胞肺癌细胞NCI-H460，人乳腺癌细胞MCF-7。下表中所列实施例化合物对四种癌细胞的IC50均＜10μM。
综上所述，本发明所述的如式Ⅰ所示的化合物具有ROCK I的抑制活性，具有多种癌细胞的抑制活性，有机会成为治疗癌症的化学药物注册分类中的一类新药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

Claims (4)

1.如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中，R1、R2选自-(CH2)nCH3，其中，n＝0～4。
2.如权利要求1所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐作为ROCK抑制剂的应用。
3.如权利要求1所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗癌症药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述的癌症选自肝癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌。
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