CN108883084A - 氯硝柳胺在p53缺失细胞的处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了一种使用根据式(I)的氯硝柳胺衍生物对p53缺失细胞进行处理的方法。本公开还描述了一种利用根据式(I)的化合物来治疗癌症的方法、以及进行筛选以确认选择性地靶向其中p53是缺失的或无功能的细胞的化合物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月16日提交的新加坡临时专利申请No.10201507716Q的优先权,该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文中用于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学的领域。具体地,本发明涉及用于p53缺失细胞的处理的化合物。
背景技术
TP53(更通常地也称为p53)是在人类癌症中最常发生突变的肿瘤抑制基因之一。如在本领域中已知的,p53在许多信号通路中起结点的作用,因此许多重要的生物活性是由p53基因的转录活性所调节的:从生殖力和发育到维持基因组稳定性和细胞死亡。
已有研究证明p53是可以经受可变剪接的家族的一部分。p53最初被描述为原癌基因的事实与突变型p53已被证明展现出实际上驱动肿瘤发展和转移的功能获得性特性相符合。因此,p53具有治疗重要性,并且业界正在采用许多策略来重新构建其在肿瘤中的表达。虽然业界对于p53的生物活性和功能已有很多的了解,但到目前为止仍然没有靶向具有突变的p53或p53功能缺失的细胞的策略。考虑到在肿瘤中有高频率的p53突变,因此需要找到靶向并治疗显示p53功能缺失的肿瘤的治疗方法。
发明内容
在一个方面,本发明涉及使用如式I中所定义的化合物或其衍生物来治疗癌症的方法:
其中D是N或CR9;E是N或CR10;F是N或CR11;R1是H、卤素、OR12、SR13、NR14、R15,
R2是H、OH或OR12;R3是H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;或者R2与R3结合而形成六元环,其中位置1经由
连接到位置4;
R4和R8各自独立地选自H、卤素、CF3、OR28、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R5、R6和R7各自独立地选自H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基、卤素、NO2、CO2H、SO3H、CF3、CN、OR29、SR30,
X1、X2、X3和X4各自独立地是O、S;或NR38;Y是CR25R26、O、S或NR27;Z是O、S或CR50R51;各Q独立地是O、S或NR52;R9、R10和R11各自独立地是H、OH、OR12、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C1-7杂烷基、卤素或NO2;R12和R13各自独立地是酰基、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R17、R22、R35、R36、R37、R38和R52各自独立地是C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R14、R15、R16、R18、R19、R20、R21、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34各自独立地是H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50和R51各自独立地是H、卤素、CN、NO2、CF3、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基,其中该癌症包含p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞。
在另一个方面,本发明涉及使用如本文中所定义的化合物来治疗癌症的方法,其中该癌症包含p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞。
在又一个方面,本发明涉及鉴定患者是否有可能或不大可能响应于治疗方法,其中该治疗包括如本文中所定义的化合物的施用,其中该方法包括确定从患者所获得的细胞或组织样品是否包含(a)p53阳性细胞或p53缺失细胞或者(b)无功能的p53的无功能的细胞,其中将该细胞或组织样品鉴定为p53缺失或者含有是无功能的p53的细胞或组织样本鉴定有可能响应于所述治疗的患者,其中将所述样品鉴定为p53阳性鉴定不大可能响应于该治疗的患者。
在另一个方面,本发明涉及如本文中所定义的化合物或其衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的用途,其中该癌症包含p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞。
在又一个方面,本发明涉及进行筛选以确认选择性地靶向第一细胞类型或第二细胞类型的化合物的方法,其中该第一细胞类型是p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞,并且其中第二细胞类型是p53阳性细胞,并且其中用第一可检测标志物标记第一细胞类型并且其中用第二可检测标志物标记所述第二细胞类型;该方法包括:A.使该第一细胞类型和第二细胞类型与该化合物接触;和B.确定该第一可检测标志物和第二可检测标志物的相对量;其中该第一可检测标志物和第二可检测标志物可独立地检测,并且其中与第二标志物的量相比第一标志物的量的相对增加表征选择性地靶向p53阳性细胞的化合物的指示,并且其中该第二标志物的量的相对增加表征选择性地靶向p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞的化合物。
在再一个方面,本发明涉及包含如本文中所描述的化合物和另外的治疗剂的试剂盒。
附图说明
结合非限制性实施例和附图参考详细说明将更好地理解本发明,其中:
图1示出了使用In Cell Analyzer 2000的细胞的荧光图像。捕捉了H2B-GFP标记的HCT116 p53+/+和H2BRFP标记的HCT116 p53-/-细胞的荧光图像,并且对细胞数进行定量。这些图像(单数的和合并的)显示根据p53的存在或不存在的细胞的特异性标记。
图2示出了在图2A(上部)中的组合柱线图、描绘氯硝柳胺对细胞存活率的影响的线图(图2B)、及在图2C和图2D(下部)中的结晶紫染色细胞的显微图像。图2A示出了使用InCell Analyzer 2000而成像的细胞。将H2B-GFP标记的HCT116 p53+/+细胞和H2B-RFP标记的HCT116 p53-/-细胞的共培养物用指定浓度的氯硝柳胺处理达48小时。在成像之前使细胞恢复达7天。对H2B-GFP标记的HCT116 p53+/+细胞和H2B-RFP标记的HCT116 p53-/-的细胞的相对百分比进行了定量并图示于图表中。图2C和图2D:用非靶向性(NT)shRNA或者p53特异性shRNAs(p53sh I和p53sh II)对HCT116 p53突变体和野生型自身(2C)或者HCT116 p53+/+进行转染。将细胞用指定浓度的氯硝柳胺处理达48小时并且在新鲜培养基中恢复达12天。图2C和图2D示出了用结晶紫染色的在细胞培养板中的细胞集落的图像。结晶紫仅对在染色时为活的细胞进行染色。因此,染色脱色的增加是细胞死亡的指示。该数据表明氯硝柳胺处理对HCT166细胞(具体地HCT116p53-/-细胞)的存活率的影响。
图3示出了在确定与野生型人成纤维细胞相比氯硝柳胺对p53缺失人成纤维细胞的凋亡行为的作用中所采集的试验数据。图3A示出了在将细胞用氯硝柳胺处理7天后而成像的正常原代人成纤维细胞的亮视场图像。sh对照、sh p53(III)和sh p53(II)是指用编码shRNA对照和shRNAs的载体转染p53的细胞。图3B示出了描绘来自Annexin V-FITC测定的数据的多个流式细胞术图。Annexin V-FITC测定是在用shRNA对照或p53特异性shRNA转染的正常人成纤维细胞中进行。将细胞用指定浓度的氯硝柳胺(1-4μM)进行处理,随后在新鲜培养基中恢复48小时。7天后,使用Annexin V-FITC将细胞染色,并且使用流式细胞术对Annexin V-FITC阳性细胞群的百分比进行定量。一并考虑,图3中所示出的数据表明p53缺失细胞对氯硝柳胺处理具有增加的敏感性/易感性,这导致对p53缺失细胞的优先杀伤。
图4示出了具有野生型p53或内含p53突变(+/R172或R172/R172)的小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞针对氯硝柳胺的敏感性的测试结果。图4A示出了亮视场图像数据,该数据表明不同于野生型细胞,p53突变细胞对氯硝柳胺敏感。如同人成纤维细胞,也测试了这些细胞的凋亡性细胞死亡,将其数据显示于图4B)所示的图表中。细胞的结晶紫染色的图像表明p53突变MEF细胞对氯硝柳胺敏感,如在图4C)中所示。将具有野生型p53和是p53缺失的两种HCT116细胞用氯硝柳胺处理,并且用半胱天冬酶-3抗体对蛋白质样品实施免疫印迹。在p53-(亦即p53缺失)细胞中被剪切的半胱天冬酶的明显诱导表明在这些细胞中的凋亡性细胞死亡。将该数据图示于如图4D中所示的蛋白质印迹的图像中。
图5示出了在共培养中生长并且用指定浓度的氯硝柳胺孵育的HCT116 p53+/+(绿色荧光蛋白(GFP)标记的)细胞和HCT116 p53-/-(红色荧光蛋白(RFP)标记的)细胞的荧光显微镜捕捉的图像。图5中所示的数据表示氯硝柳胺优先地减小p53缺失细胞的球状体生长的能力。
图6示出了在用于测试氯硝柳胺在处理p53-/-肿瘤细胞中的用途的体内小鼠肿瘤模型中的设置和采集的数据。图6A示出了该试验的示意性设计图。图6B示出了被解剖以显示在右侧面的肿瘤生长(R:DMSO处理的对照细胞(阴性对照))但在左侧面为较小程度(L:用氯硝柳胺处理的细胞)的裸小鼠的照片。图6C示出了被切除肿瘤的照片,将这些肿瘤称重,将这些肿瘤的测量值显示于图表中的右侧。R:右侧面:DMSO处理的对照细胞(阴性对照)。L:左侧面:用氯硝柳胺处理的细胞。图6中所示的数据表明氯硝柳胺具有体内抗肿瘤作用,亦即用氯硝柳胺对肿瘤进行处理导致体内肿瘤体积的显著生长减小。
定义
在对本发明的化合物的一般性描述中,取代基中的特定类型的原子的数目通常是以范围的形式给出,例如含有1至7个碳原子的烷基或者C1-7烷基。对这种范围的引述意图包括对具有在该规定范围内的整数个原子的每个的基团的具体引述。例如,具有1至7、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、3至4、3至5、3至6、3至7、4至5、4至6、4至7、5至6、5至7、6至7个碳原子的烷基包括C1、C2、C3、C4、C5、C6和C7中的每个。例如,C1-7杂烷基除一个或更多个杂原子外,还包含1至6、1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6、5至6个碳原子。可以以类似的方式来表示其他数目的原子和其他类型的原子。
本文中所使用的术语“烷基”和前缀“烷-(alk-)”包括直链基团和支链基团两者、及无环基团和环状基团(即环烷基)。环状基团可以是单环的或多环的,并且可以具有3至6个环碳原子(包括性的)。示例性的环状基团包括环丙基、环丁基、环戊基、和环己基基团。例如,C1-7烷基基团可以是被取代的或未被取代的。示例性的取代基包括但不限于:烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代氨基、季氨基、羟烷基、羧烷基和羧基基团。C1-7烷基包括但不限于:甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、环丙基甲基、环丙基乙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、正戊基、环戊基、环戊基甲基、环戊基乙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基和环己基。
本文中所使用的术语“C2-7烯基”是指含有一个或更多个双键并且具有2至7个碳原子的支链或无支链的烃基团。C2-7烯基可任选地包括无环、单环或多环,其中各环合乎期望地为3元至6元环。该C2-7烯基基团可以是被取代的或未被取代的。示例性的取代基包括但不限于:烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代氨基、季氨基、羟烷基、羧烷基和羧基。C2-7烯基包括但不限于:乙烯基、烯丙基、2-环丙基-1-乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、2-乙基-2-丙烯基、1-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基和2,2-二甲基-3-丁烯基。
本文中所使用的术语“C2-7炔基”是指含有一个或更多个三键并且具有2至7个碳原子的支链或无支链的烃基团。C2-7炔基可任选地包括无环、单环、双环、或三环,其中各环合乎期望地为5元或6元环。C2-7炔基基团可以是被取代的或未被取代的。示例性的取代基包括但不限于:烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代氨基、季氨基、羟烷基、羧烷基和羧基。C2-7炔基包括但不限于:乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、5-己烯-1-炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-甲基-2-丙炔基、1-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、1,2-二甲基-3-丁炔基、2,2-二甲基-3-丁炔基、1-甲基-2-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、2-甲基-4-戊炔基、和3-甲基-4-戊炔基。
本文中所使用的术语“C2-6杂环基”是指稳定的5至7元的单环或者7至14元的双环杂环,这些杂环是饱和、部分不饱和、或不饱和的(芳香环),是由2至6个碳原子及1、2、3或4个独立地选自由N、O和S所组成的组的杂原子所组成并且包括任何双环基团,其中任何上面所定义的杂环稠合到苯环。该杂环基可以是被取代的或未被取代的。示例性的取代基包括但不限于:烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代氨基、季氨基、羟烷基、羧烷基和羧基。氮和硫杂原子可任选地被氧化。该杂环可经由任何杂原子或碳原子而共价连接,这形成稳定的结构,例如咪唑啉基环可在环碳原子位置或者在氮原子处连接。杂环中的氮原子可任选地被季铵化。在一个实施例中,当杂环中的S和O原子的总数超过1时,那么这些杂原子彼此不邻接。杂环包括但不限于:1H-吲唑、2-吡咯烷酮基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶基、4aH-咔唑(4aH-carbazole)、4H-喹嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫呋喃基、苯并硫苯基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑基、咔唑基、4aH-咔唑基、b-咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、亚吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲哚嗪基、吲哚基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑烷基嘧啶基、菲啶基、啡咯啉基(phenanthrolinyl)、吩砒嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathionyl、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、蝶啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑基、吡啶并咪唑基、吡啶并噻唑基、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基(quinoxahnyl,)、奎宁环基、咔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基、三嗪基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,5-三唑基、1,3,4-三唑基、氧杂蒽基。在一个实施例中,5至10元的杂环包括但不限于:吡啶基、嘧啶基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、四唑基、苯并呋喃基、苯并硫呋喃基、吲哚基、苯并咪唑基、1H-吲唑基、噁唑烷基、异噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基(oxindolyl)、苯并噁唑基、喹啉基和异喹啉基。在一个实施例中,5至6元的杂环包括但不限于:吡啶基、嘧啶基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基和四唑基。
本文中所使用的术语“C6-12芳基”是指具有由带共轭π电子的碳原子所组成的环系统的芳香基团(例如,苯基)。芳基基团可具有在6至12之间的碳原子。芳基基团可任选地包括单环、双环或三环,其中各环合乎期望地是5元或6元环。该芳基基团可以是被取代的或未被取代的。示例性的取代基包括但不限于:烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、氟烷基、羧基、羟烷基、羧烷基、氨基、氨基烷基、单基取代的氨基、二基取代的氨基和季氨基团。
本文中所使用的术语“C7-14烷芳基”是指具有7至14个碳原子的被芳基所取代的烷基(例如,苄基、苯乙基、或3,4-二氯苯乙基)。
本文中所使用的术语“C3-10烷杂环基”是指除一个或更多个杂原子外还具有3至10个碳原子的烷基取代的杂环基(例如但不限于:3-呋喃基甲基、2-呋喃基甲基、3-四氢呋喃基甲基、或2-四氢呋喃基甲基)。
本文中所使用的术语“C1-7杂烷基”是指除一个或更多个杂原子外还具有1至7个碳原子的支链或无支链的烷基、烯基、或炔基基团,其中一个或更多个亚甲基(CH2)或次甲基(CH)被氮、氧、硫、羰基、硫代羰基、磷酰基、或磺酰基所替代。
杂烷基包括但不限于:叔胺类、仲胺类、醚类、硫醚类、酰胺类、硫代酰胺类、氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、磷酰胺类、磺酰胺类和二硫化物类。杂烷基可任选地包括单环、双环或三环,其中各环合乎期望地是3元至6元环。该杂烷基可以是被取代的或未被取代的。示例性的取代基包括但不限于:烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代氨基、季氨基、羟烷基、羟烷基、羧烷基和羧基基团。
本文中所使用的术语“酰基”是指具有式R-C(O)-的化学部分,其中R是选自C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基。
本文中所使用的术语“卤素”是指溴、氯、碘或氟。
本文中所使用的术语“氟烷基”是指用氟取代的烷基。
本文中所使用的术语“全氟烷基”是指仅由碳原子和氟原子所构成的烷基。
本文中所使用的术语“羧烷基”是指具有式-(R)-COOH的化学部分,其中R可以是但不限于:C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基。
本文中所使用的术语“羟烷基”是指具有式-(R)-OH的化学部分,其中R可以是但不限于:C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基。
本文中所使用的术语“烷氧基”是指式-OR的化学取代基,其中R可以是但不限于:C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基。
本文中所使用的术语“芳氧基”是指式-OR的化学取代基,其中R是例如C6-12芳基基团。
本文中所使用的术语“烷硫基”是指式-SR的化学取代基,其中R可以是但不限于:C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基。
本文中所使用的术语“芳硫基”是指式-SR的化学取代基,其中R是例如C6-12芳基基团。
本文中所使用的术语“季胺基”是指式-(R)-N(R')(R")(R'")+的化学取代基,其中R、R'、R"和R'"各自独立地是烷基、烯基、炔基或芳基基团。R可以是将季氨基氮原子(作为取代基)连接到另一部分的烷基。该氮原子(N)共价连接到烷基和/或芳基基团的四个碳原子,从而形成在氮原子处的正电荷。
本文中所使用的术语“突变”是指在细胞遗传物质中的突然随机变化,该变化可能地会导致该细胞和来源于该细胞的所有细胞在外观和行为上(即,在表型上)与正常的、未突变的类型不同。受突变影响的(特别是具有视觉效应的)生物体被描述为突变体。体细胞突变影响非生殖细胞并因此局限于单个生物体的组织,而生殖细胞系突变(发生于生殖细胞或它们的前体细胞中)可传递至该生物体的后代并导致异常的发育。在本申请中,突变是指生物体、病毒的基因组的核苷酸序列、或者染色体外DNA或其他遗传因子的永久性改变。突变是由对DNA的损伤所造成,该DNA然后会经历易错修复,否则会导致在复制期间的错误。突变也可由由于可移动的遗传因子所导致的DNA片段的插入或缺失而造成。不同类型的突变是但不限于:置换突变、单碱基置换、沉默突变、错义突变、无义突变、中性突变、插入、缺失、扩增、染色体易位、中间缺失和染色体倒位。突变也可以根据它们的结果而进行分类,亦即例如与未突变形式的基因产物相比,功能丧失性突变(也称为失活性突变)形成不具有或几乎不具有功能的基因产物。因此,功能获得性突变(也称为激活性突变)导致未突变基因产物的特性的增强。
本文中所使用的术语“多态性”是指在一生物物种的某些成员中发生的遗传区域的序列中的变异或差异。变异序列可以参考该生物物种的任意的或非任意的标准序列而定义。因此,多态性被说成是“等位基因的”,这是因为,由于多态性的存在,一生物物种的某些成员可具有“标准的”序列(即,标准的“等位基因”)而其他成员可具有变异序列(即,变异的“等位基因”)。因此,本文中所使用的等位基因是在染色体上的特定位置的基因或其他遗传区域的两个或更多个可替代形式的中的一个。在最简单的情况下,可仅存在一个变异序列,因此多态性被说成是双等位基因的。在其他情况下,该生物物种的群体可含有多个等位基因,并且该多态性被称为三等位基因的等。单个基因或遗传区域可具有多种不同的不相关的多态性。例如,它可具有在一个位点处的一个双等位基因多态性、在另一个位点处的另一个双等位基因多态性以及在又一个位点处的多等位基因多态性。当植物中的一染色体基因座的一组等位基因的所有序列都为相同时,这些等位基因被说成在该基因座是“纯合的”。当植物中的特定基因座的任何等位基因的序列为不同时,该等位基因群体被说成在该基因座是“杂合的”。表型性状会由于环境因素和/或遗传因素而变化。例如,在一特定染色体基因座的多态性可以影响与该基因座相关的表型性状。
本文中所使用的术语“衍生物”是指是通过化学反应由类似化合物衍生得到的化合物。衍生物也可被称为结构类似物或功能类似物。
在本说明书中,预防疾病是指完全地或部分地阻止例如在已知具有对疾病的易患病体质的个人中疾病的发展或进展。已知具有易患病体质的个人的示例是在家族中具有癌症史的某人或者已暴露于使受试者易于经历肿瘤发展的各因素的某人。
另外,在本说明书中,治疗疾病是指阻止或抑制肿瘤生长、消除肿瘤、减轻疾病或病理状态的至少一个病征或症状、或者在疾病或病理状态已开始发展之后干预病理生理过程的治疗性干预。
本文中所使用的术语“综合性致死(synthetically lethal)”是指其中在两个或更多基因中的突变的组合导致细胞死亡的情况,也就是说这些两个或更多基因中的突变的最终结果对细胞是致死性的。然而,在各突变是综合性致死的情况下,各单独突变的发生并不导致细胞死亡。例如,关于宿主中的两个基因(基因A和基因B),如果存在于基因A和B中的每个的突变导致细胞死亡,那么该突变被认为是综合性致死的。在细胞中基因A的未突变拷贝和仅基因B的突变拷贝(反之亦然,即基因A的突变拷贝和基因B的未突变拷贝)的存在对所述细胞不是致死的。在这种情况下(亦即例如,当未突变形式的基因A与突变形式的基因B共同存在时),这会导致综合性疾病,该疾病是各突变的组合(也称为遗传事件)导致宿主的健康状态的非致死性下降。因此,综合性致死是生物体能够维持边界误差和/或缓冲方案的结果,这继而使得尽管存在遗传变异、环境变化和随机事件(如突变),表型稳定性仍为可能。所有的这些因素在生物体的总体(遗传)稳健性中发挥了作用。
具体实施方式
所采用的方法是进行高通量筛选以发现对具有p53功能丧失的细胞为综合性致死的分子。该高通量筛选是使用包含荧光标记的HCT116野生型细胞和HCT116 p53-/-细胞的基于细胞的竞争测定进行。对由超过1600种化合物构成的pharmakon库进行筛选,该筛选针对这些化合物对HCT116 p53-/-细胞的存活率的不同活性。进行二次筛选以验证候选化合物,这些候选化合物是基于它们对HCT116 p53-/-细胞的优先杀伤而被选择。
在使用来自MicroSource Discovery Systems的、由1600个不同的FDA批准的化合物构成的被称为pharmakon库的独立的药物筛选中,已示出根据如本文中所描述化合物的各化合物(例如氯硝柳胺及其衍生物)可有效地杀伤p53缺失细胞。化合物在杀伤和/或治疗某个疾病(例如癌症)的功效可以通过比较所述化合物对病变细胞的作用与所述化合物对无病变细胞的作用而确定。病变细胞可从患有该疾病的患者或受试者获得,但也可以是细胞培养中的特定(病变)细胞系。在例如显微分析中可以基于其表型将病变细胞区别于非病变细胞;同时还能够用不同标志物来标记不同类型的细胞,然后将这些标志物使用于对用被测试化合物处理之后得到的细胞群体的差异分析中。因此,一种细胞类型的标记信号相对于其他细胞类型的增强和/或减弱指示被分析化合物在功效方面的强度(当在所需的时间和剂量下观察时)以及致死性。因此,在本文的一个实施例中公开的是进行筛选以鉴定选择性地靶向第一细胞类型或第二细胞类型的化合物的方法,其中该第一细胞类型是p53缺失细胞或其中p53是无功能的细胞,并且其中该第二细胞类型是p53阳性细胞,并且其中用第一可检测标志物标记该第一细胞类型并且其中用第二可检测标志物标记该第二细胞类型;该方法包括:(a)使该第一细胞类型和第二细胞类型与该化合物接触;和(b)确定该第一可检测标志物和第二可检测标志物的相对量;其中该第一可检测标志物和第二可检测标志物可独立地被检测,并且其中与该第二标志物的量相比该第一标志物的量的相对增加表征选择性地靶向p53阳性细胞的化合物,并且其中该第二标志物的量的相对增加表征选择性地靶向p53缺失细胞或其中p53是无功能的细胞的化合物。在一个实施例中,该可检测标志物是但不限于:荧光化合物、放射性同位素化合物、非放射性同位素化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂化合物、发色化合物、X射线照相化合物和酶。在另一实施例中,荧光化合物是但不限于:绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。在另一实施例中,用红色荧光蛋白(RFP)标记第一细胞类型进行标记并且用绿色荧光蛋白(GFP)标记第二细胞类型。在另一实施例中,各细胞类型在体外、离体或体内与该化合物接触。在另一实施例中,使用荧光激活细胞分选(FACS)或定量显微镜成像确定第一标志物和第二标志物的相对量。
在本领域中p53已知为肿瘤抑制基因,这意味着该基因及其所编码的蛋白质的活性阻止宿主中的肿瘤形成。已将细胞机制(如转录调控、DNA修复的激活、细胞周期的阻滞和在不可修复的细胞中启动凋亡)归因于p53基因的抗癌特性。
例如,发现化合物氯硝柳胺可激活p53缺失细胞中的凋亡达到比在p53野生型细胞中所观察的凋亡更大的程度。这提供氯硝柳胺作为药物在靶向p53缺失细胞中的功能。值得注意的是,在大于50%的所有肿瘤中发现p53缺失,从而表明氯硝柳胺靶向各细胞途径,这些细胞途径当被抑制时对于p53缺失细胞是综合性致死的。因此,在一个实施例中,本文中请求保护的化合物可被用于对p53缺失细胞的选择性杀伤。在另一个实施例中,本文中所公开的是单个化合物于抗癌治疗中在靶向p53缺失肿瘤细胞中的用途。在另一实施例中,该化合物是氯硝柳胺或其衍生物。在又一实施例中,公开了使用如本文所描述的化合物治疗癌症的方法,其中该癌症包含p53缺失细胞或其中p53是无功能的细胞。在另一实施例中,公开了使用如本文中所定义的2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物治疗癌症的方法,其中该癌症包含p53缺失细胞或其中p53是无功能的细胞。在另一实施例中,公开了如本文所公开的化合物或其衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的用途,其中该癌症包含p53缺失细胞或其中p53是无功能的细胞。在本文公开的任何实施例中,该化合物是2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物。
本文中还公开了确定受试者对使用靶向p53缺失细胞的药物的治疗的易感性的方法。这是通过,例如,对在从患病受试者获得的样品中的特定基因的存在或不存在进行比较,以及对所述被分析基因的水平与在取自未患有该疾病的受试者(亦即,该受试者被认为是健康的)的样品中确定的相同基因的水平进行比较而完成。也可以对所述靶基因的翻译产物和/或转录产物(例如但不限于mRNA转录本、RNA转录物、蛋白质、其异构体和变体)进行该确定。在另一实施例中,该基因可以是在与p53相同的途径中起作用的基因。在一个实施例中,该基因是p53。在另一实施例中,对p53的转录产物进行该确定,该转录产物是由p53编码的蛋白质。因此,在一个实施例中,本文中公开了一种鉴定癌症患者是否有可能或不大可能响应于治疗的方法,其中该治疗包括如本文所公开的化合物或者如本文所定义的其衍生物的施用,其中该方法包括确定来自患者的细胞或组织样品是否包含a)p53阳性或p53缺失细胞或者b)无功能的p53,其中将该细胞或组织样品鉴定为p53缺失或者含有为无功能的p53的细胞或组织样本而将该患者鉴定为有可能对治疗有反应,其中将所述样品鉴定为p53阳性则将患者鉴定为不大可能对治疗有反应。在一个实施例中,该化合物是2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物。
已知p53基因的突变或缺失会引起各种疾病,例如癌症。在一个实施例中,癌症可以是但不限于:乳腺癌、脑癌、头颈部癌、肺癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、血细胞癌(例如白血病)、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肠癌、皮肤癌、上皮癌、骨癌、胰腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、直肠癌、肉瘤、睾丸癌、子宫癌和软骨癌。在另一实施例中,癌症是但不限于:黑色素瘤、骨髓瘤、癌(carcinomas)、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤和生殖细胞肿瘤。在又一实施例中,癌症是但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、皮肤癌(如基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)或黑色素瘤)、乳腺癌、头颈部癌(如脑癌)、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、肝癌、和与人乳头瘤病毒(HPV)相关的癌症(如宫颈癌)。
在一个实施例中,本文公开了使用式I中所定义的化合物或其衍生物来治疗癌症的方法:
其中
D是N或CR9;E是N或CR10;F是N或CR11;
R1是H、卤素、OR12、SR13、NR14、R15,
R2是H、OH或OR12;
R3是H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;或者R2与R3结合而形成六元环,其中位置1经由
连接到位置4;
R4和R8各自独立地选自H、卤素、CF3、OR28、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R5、R6和R7各自独立地选自H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基、卤素、NO2、CO2H、SO3H、CF3、CN、OR29、SR30,
X1、X2、X3和X4各自独立地是O、S;或NR38;
Y是CR25R26、O、S或NR27;
Z是O、S或CR50R51;
各Q独立地是O、S或NR52;
R9、R10和R11各自独立地是H、OH、OR12、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C1-7杂烷基、卤素或NO2;
R12和R13各自独立地是酰基、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;
R17、R22、R35、R36、R37、R38和R52各自独立地是C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;
R14、R15、R16、R18、R19、R20、R21、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34各自独立地是H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50和R51各自独立地是H、卤素、CN、NO2、CF3、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基,其中该癌症包含p53缺失细胞或其中p53是无功能的细胞。在一个实施例中,X1是氧原子,R2是OH并且R3是H。在另一实施例中,D、E和F各自独立地是CH。在另一实施例中,R1是H或卤素。在另一实施例中,R1是Cl。在一个实施例中,R4和R8独立地是H、卤素或CF3。在另一实施例中,R4是Cl。在另一实施例中,R8是H。在一个实施例中,R5、R6和R7独立地是H、卤素、NO2、CO2H、SO3H、CF3或CN。在一个实施例中,R5是H。在另一实施例中,R6是NO2。在又一实施例中,R7是H。在一个实施例中,X1是氧原子,R1是Cl,R2是OH,R3是H,R4是Cl,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。
在一个实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl、F、Br、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R2是OH,R3是H,R4是Cl,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在另一实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl,R2是OH,R3是H,R4是Cl、F、Br、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在又一实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl、Br、F、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R2是OH,R3是H,R4是Cl、Br、F、I、H、OR12、SR13、NR14、或R15中的任一个,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在一个实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl,R2是H、OH或OR12,R3是H,R4是Cl,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在又一实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl、Br、F、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R2是H、OH或OR12,R3是H,R4是Cl、Br、F、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在再一实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl,R2是H、OH或OR12,R3是H,R4是Cl、Br、F、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在又一实施例中,D、E和F各自独立地是CH;X1是氧原子,R1是Cl、Br、F、I、H、OR12、SR13、NR14或R15中的任一个,R2是H、OH或OR12,R3是H,R4是Cl,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。在另一实施例中,该化合物是氯硝柳胺。在另一实施例中,该化合物是根据以下结构
或其衍生物。
在另一个实施例中,本文中请求保护的化合物被用于抗癌疗法。在另一实施例中,本文中公开的是包含本文中公开的化合物或其衍生物和如本文所描述的另外的治疗剂的试剂盒。
在本发明的实施例中,上面所概述的化合物是以药学上可接受盐的形式存在。术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐。本发明化合物的合适的药学上可接受盐包括酸加成盐,该酸加成盐可通过例如将本发明化合物的溶液与药学上可接受的酸(如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、醋酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液混合而形成。此外,在本发明的化合物具有酸性部分的情况下,合适的其药学上可接受的盐可包括碱金属盐(例如,钠盐或钾盐);碱土金属盐(例如,钙盐或镁盐);和与合适的有机配体所形成的盐类(例如,铵、季铵以及胺阳离子,该胺阳离子是使用反阴离子(如卤素、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成)。药学上可接受的盐的说明性示例包括但不限于:醋酸盐、已二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四醋酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、樟脑磺酸、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二胺四醋酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷硫酸盐、乙磺酸盐(esylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate,)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡庚糖酸盐(glucoheptonate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、α-羟乙酰氨基苯胂酸、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、羟萘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物(triethiodide)、十一烷酸盐、戊酸盐等。本发明的某些特定化合物同时含有碱性和酸性官能团(functionalities),这允许将化合物转化成碱加成盐或酸加成盐。
这些化合物的中性形式可通过使盐与碱或酸接触并且以常规的方式分离亲体化合物而再生。该化合物的亲体形式在某些物理性质(如在极性溶剂中的溶解性)方面区别于各种盐形式,但为了本发明的目的这些盐等同于化合物的亲体形式。
除盐形式外,本发明还提供呈前药形式的化合物。本文中所描述化合物的前药是在生理条件下容易地地经历化学变化以提供如本文所描述化合物的那些化合物。前药是具有药理活性或无药理活性的化合物,在将其施用至患者后通过体内生理作用(如水解、代谢等)被化学改性成为本发明的化合物。此外,可在离体环境中通过化学方法或生物化学方法将前体药物转化成为本发明的化合物。例如,当被置于具合适酶的透皮贴剂储库中时,前药可以被缓慢地转化为本发明的化合物。在制造和使用前药中相关的适合性和技术对于本领域技术人员而言是熟知的。被掩蔽的酸性阴离子的例子包括多种酯类,如烷基(例如,甲基、乙基)酯、环烷基(例如,环己基)酯、芳烷基(例如,苄基、对甲氧基苄基)酯、和烷基羰基氧烷基(例如,特戊酰氧甲基(pivaloyloxymethyl))酯。胺类已被掩蔽为芳基羰基氧甲基取代的衍生物,这些衍生物在体内被酯酶切割,释放游离的药物和甲醛。另外,含有酸性NH基团(如咪唑、酰亚胺、吲哚等)的药物已被N-酰氧甲基基团所掩蔽。羟基基团已被掩蔽而为酯类和醚类。另外,具有一种立体化学(例如,(R))的化合物可以常常使用熟知的方法(例如通过翻转)形成具有相反立体化学(即,(S))的化合物。
本发明的某些化合物可以以未溶剂化的形式以及溶剂化的形式(包括水合形式)存在。一般来说,溶剂化的形式等同于未溶剂化的形式,并且意图包含在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多种结晶形式或无定形的形式存在。一般来说,所有物理形态对于本发明所预期的用途是等效的,并且意图在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(旋光中心)或双键。这些外消旋体、对映异构体、非对映异构体、几何异构物和单独的异构体都意图包含在本发明的范围内。因此,本发明的化合物包括立体异构体的混合物,特别是对映异构体的混合物,以及纯化的立体异构体,特别是纯化的对映异构体,或者富集立体异构体的混合物,特别是富集对映异构体的混合物。也包含在本发明范围内的是如本文中所公开化合物的单独异构体,以及其任何完全地或部分地平衡的混合物。本发明也涵盖由本文中所公开化学式所代表的化合物的各单独的异构体,作为与其异构体的混合物,其中一个或更多个手性中心被翻转。另外,应理解如本文所公开化合物的所有互变异构体及互变异构体的混合物均包含在本文所公开化合物的范围内。
可以通过本身为已知的方法以机械或化学的方式将所获得的外消旋体拆分为各异构体。非对映异构体优选地是通过与光学活性拆分剂的反应而由外消旋混合物形成。
合适的拆分剂的示例是光学活性酸类,如D构型和L构型的酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸、或者各种光学活性樟脑磺酸类(如樟脑磺酸)。也有利的是借助于以光学活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)填充的柱将对映异构体进行拆分;合适的洗脱剂的示例是己烷/异丙醇/乙腈混合物。
非对映异构体的拆分也可以通过标准纯化工艺(例如层析或分步结晶)而实现。
在组合物内的化合物或者根据本发明可使用的化合物可以以盐或酯的形式而存在,例如药学上可接受的盐或酯。本发明化合物的药学上可接受的盐包括其合适的酸加成盐或其碱盐。盐是由例如以下形成:使用强无机酸类如无机酸(例如硫酸、磷酸或氢卤酸);使用强有机羧酸类,如未被取代或被取代(例如,被卤素取代)的1至4个碳原子的链烷羧酸类,如醋酸;使用饱和或不饱和的二羧酸类,例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸(tetraphthalic acid);使用羟基羧酸类,例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸;使用氨基酸类,例如天冬氨酸或谷氨酸;用苯甲酸;或者使用有机磺酸类,如未被取代或被取代(例如,被卤素取代)的(C1-C4)-烷基或芳基磺酸类,如甲烷磺酸或对甲苯磺酸而形成。
基于被酯化的官能团,利用有机酸类或者醇类/氢氧化物形成酯类。有机酸类包括羧酸类,如未被取代或被取代(例如,被卤素取代)的1至12个碳原子的链烷羧酸,如醋酸;饱和或不饱和的二羧酸,例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸;羟基羧酸类,例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸;氨基酸类,例如天冬氨酸或谷氨酸;苯甲酸;或者有机磺酸类,如未被取代或被取代(例如,被卤素取代)的(C1-C4)-烷基或芳基磺酸类,如甲烷磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物,如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇类包括可以是未被取代或被取代(例如被卤素取代)的1至12个碳原子的烷醇类。
本发明的化合物也可含有在构成这种化合物的一个或更多个原子处的非自然比例的原子同位素。本发明的药剂或其药学上可接受的盐的同位素变体被定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但具有不同于通常在自然界中所发现的原子质量的原子质量的原子所替代的变体。可并入该药剂及其药学上可接受的盐中的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素,例如分别是3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。该药剂及其药学上可接受的盐的某些同位素变体,例如其中掺入放射性同位素(如3H或14C)的同位素变体可用于药物和/或底物组织分布研究。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素由于它们制备容易和检测而被使用。此外,用同位素(如氘即2H)置换可提供由于更高代谢稳定性(例如增加的体内半衰期或减小的剂量要求)所带来的某些治疗优势,因此在一些情况下会是优选的。本发明的药剂及其药学上可接受的盐的同位素变体通常可以通过常规步骤使用合适试剂的适当同位素变体而制备。
本发明的化合物和组合物的所有同位素变体,无论是否有放射性,意图是包含在本发明的范围内。
本发明也包括在组合物之中的化合物或根据本发明可使用的本文中所公开的化合物的溶剂化物形式。在权利要求中所使用的术语包含这些形式。
此外,本发明涉及在本发明组合物之中的化合物或者根据本发明可使用的本文中所公开的化合物,该化合物呈它们的各种晶型、多态性和无水或含水形式的。在制药工业中公认的是,通过稍微改变纯化的方法和/或在这种化合物的合成制备中所使用的溶剂的分离形式,化合物可以任何这样的形式被分离。
本申请所涉及的“药物组合物”包含至少一个本发明的化合物和至少一种药学上可接受的载体。就由本发明的化合物来制备药物组合物而言,药学上可接受的载体可以是固体或者液体。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散性粒剂。固体载体可以是一种或更多中物质,这些物质也可用作稀释剂、矫味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。
在粉剂中,载体是与细粉活性组分混合的细粉固体。在片剂中,以合适的比例将活性组分与具有必需结合性质的载体混合,并且以所期望的形状和尺寸而成形。
粉剂和片剂可以含有5%至80%或20%至70%的一个或多个活性化合物。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”意图包括具作为载体的包封材料的活性化合物的剂型,从而提供其中含有或不含有其他载体的活性组分被载体所包围(因此载体与活性组分缔合)的胶囊剂。类似地,包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适合于口服施用的固体制剂。
为了制备栓剂,首先使低熔点蜡(如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物)熔化并且使活性组分均匀地分散于其中,例如通过搅拌。然后,将该熔化的均匀混合物倒入便于使用的尺寸的模具中,使其冷却,并由此固化。液体形式制剂包括溶液剂、悬浮液和乳剂,例如水溶液或者水/丙二醇溶液。液体形式对于眼睛的局部用药是尤其优选的。针对胃肠外注射,液体制剂可以以在聚乙二醇水溶液中的溶液形式配制。
适合于口服使用的水溶液可以通过将活性组分溶解于水并且根据需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂而制备。适合于口服使用的水悬浮液可以通过使细粉的活性组分分散于具粘性材料(如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其他公知的助悬剂)的水中而制备。
也包括固体形式制剂,这些固体形式制剂是意图在即将使用前被转化成液体形式制剂,用于口服施用。这种液体形式包括溶液剂、悬浮液和乳剂。除了活性组分外,这些制剂还可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
该药物制剂可以呈单位剂型的形式。在这样的剂型中,该制剂被再分为含有适当量的活性组分的单位剂量。该单位剂型可以是包装制剂,该包装中容纳离散数量的制剂,如压紧的片剂、胶囊剂、和在小玻璃瓶或安瓿中的粉剂。另外,单位剂型可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂、或锭剂本身,或者它可以是适当数量的呈包装形式的任何这些剂型。
在根据本文中所公开方法的一个实施例中,该化合物是在以下浓度(或剂量)被施用:在0.01mg/kg和5000mg/kg之间、在0.01mg/kg和0.5mg/kg之间、在0.05mg/kg和10mg/kg之间、在0.1mg/kg和100mg/kg之间、在0.1mg/kg和1000mg/kg之间、在0.1mg/kg和1500mg/kg之间、在0.1mg/kg和5mg/kg之间、在1mg/kg至2.5mg/kg之间、在2.5mg/kg至5mg/kg之间、在5mg/kg和10mg/kg之间、在10mg/kg和15mg/kg之间、在15mg/kg和20mg/kg之间、在17.5mg/kg和20mg/kg之间、在5mg/kg和7.5mg/kg之间、在7.5mg/kg和10mg/kg之间、至少约1mg/kg、至少约1.5mg/kg、至少约1.8mg/kg、至少约2mg/kg、至少约2.5mg/kg、至少约2.8mg/kg、至少约3mg/kg、至少约3.2mg/kg、至少约3.5mg/kg、至少约4mg/kg、至少约4.5mg/kg、至少约5mg/kg、至少约5.5mg/kg、至少约6mg/kg、至少约6.5mg/kg、至少约7mg/kg、至少约7.5mg/kg、至少约8mg/kg、至少约8.5mg/kg、至少约9mg/kg、至少约9.5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约12.5mg/kg、至少约15mg/kg、至少约17.5mg/kg、至少约19mg/kg、至少约20mg/kg、至少约50mg/kg、至少约100mg/kg、至少约150mg/kg、至少约200mg/kg、至少约250mg/kg、至少约300mg/kg、至少约350mg/kg、至少约400mg/kg、至少约450mg/kg、至少约500mg/kg、至少约550mg/kg、至少约600mg/kg、至少约650mg/kg、至少约700mg/kg、至少约750mg/kg、至少约800mg/kg、至少约850mg/kg、至少约900mg/kg、至少约950mg/kg、至少约1000mg/kg、至少约1100mg/kg、至少约1200mg/kg、至少约1300mg/kg、至少约1400mg/kg、至少约1500mg/kg、至少约1600mg/kg、至少约1700mg/kg、至少约1800mg/kg、至少约1900mg/kg、至少约2000mg/kg、至少约2100mg/kg、至少约2200mg/kg、至少约2300mg/kg、至少约2400mg/kg、至少约2500mg/kg、至少约2600mg/kg、至少约2700mg/kg、至少约2800mg/kg、至少约2900mg/kg、或至少约300mg/kg。在一个实施例中,该化合物是在约0.1mg/kg和约20mg/kg之间的浓度下被施用。在另一实施例中,该化合物是2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物。
组合中各组分的施用剂量、频率和方式可以被独立地控制。例如,一个化合物(例如氯硝柳胺)是每天口服施用一次,而第二化合物(例如抗增殖剂或治疗剂)是每天静脉施用二次。可在包括休息期的开/关(on-and-off)循环中提供治疗,以便患者的身体有机会从任何尚未预见的副作用中恢复。也可将这些化合物配制在一起,使得一次施用递送这两种化合物。因此,具有本文中所公开任何化学式的化合物可以被同时地施用,或者在施用例如用于例如本文中所列出任何疾病(如癌症)的治疗的本文中所公开的一个或更多个治疗剂的14天内施用。
本发明的具体方法还包括另外的治疗剂(即,除本发明的化合物以外的治疗剂)的施用。在一个实施例中,如本文中所公开的化合物可以额外地包括至少一种另外的治疗剂。在另一实施例中,将2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物与另外的治疗剂一起施用。各类型治疗剂的示例是但不限于:能够靶向细胞生长、抑制细胞生长或细胞毒性的化合物、存活、血管生成、黏附、迁移、入侵、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的化学治疗剂、抗癌药;能够靶向细胞生长、存活、血管生成、黏附、迁移、入侵、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的小分子药物;用于转移性骨癌治疗的双膦酸盐类药物;烷化剂、抗代谢物、抗生素、埃博霉素、核受体激动药和拮抗剂、抗雄激素剂、抗雌激素剂、铂化合物、激素类和抗激素剂、干扰素类和细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)的抑制剂、环氧化酶和/或脂加氧酶的抑制剂、生物来源的脂肪酸类和脂肪酸衍生物(包括前列腺素类和白三烯类)、蛋白激酶类的抑制剂、蛋白磷酸酶的抑制剂、脂质激酶的抑制剂、铂配位复合物、乙烯亚胺类、甲基三聚氰胺类、三嗪类、长春花碱类、嘧啶类似物、嘌呤类似物、烷基磺酸酯类、叶酸类似物、蒽二酮类(anthracendiones)、取代脲、甲基肼、肽衍生物治疗剂及其组合。
治疗剂的示例是但不限于:10-羟基喜树碱、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、醋地砜(acediasulfone)、阿克拉霉素(aclarubicine)、盐酸aklavine、安巴腙、安吖啶、氨鲁米特、阿那曲唑、盐酸安西他滨、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、白消安、亚叶酸钙、卡铂、卡培他滨、卡莫司汀、赛来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、氨苯砜、柔红霉素、双溴丙脒、己烯雌酚、多西紫杉醇、阿霉素、吐根碱、烯二炔类、表阿霉素、埃博霉素B、埃博霉素D、磷酸雌莫司汀、雌激素、炔雌醇、依托泊苷、盐酸表阿霉素、氟维司群(faslodex)、黄酮吡醇(flavopiridol)、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺、磷雌酚、呋喃唑酮、藤黄酸酰胺、藤黄酸、吉西他滨、促性腺激素释放激素类似物、赫赛汀、六甲密胺、羟基脲、羟甲基呋喃妥因、己酸羟孕酮、羟基脲、去甲氧柔红霉素(伊达比星)、碘苷、异环磷酰胺、干扰素γ、伊立替康、伊马替尼、伊立替康、来曲唑、亮丙瑞林、洛莫司汀、勒托替康、硫酸磺胺米隆、氮芥、醋酸甲羟基孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、米帕林(mepacrine)、巯嘌呤、氨甲蝶呤、甲硝唑、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、米托肼、米托坦、米托蒽醌、光辉霉素、萘啶酸、硝呋拉太、硝呋齐特、呋喃拉嗪、硝呋莫司、尼莫司汀、ninorazole、呋喃妥因、氮芥类、oleomucin、噁喹酸、奥沙利铂、毒毛旋花苷G、戊烷脒、喷司他丁、非那吡啶、酞磺胺噻唑、醋酸苯汞、苦鬼臼毒素、哌泊溴烷、泼尼莫司汀(prednimustine)、泼尼松、preussin、扁蒴藤素、甲基苄肼、乙胺嘧啶、盐酸阿的平、雷替曲塞、雷帕霉素、鱼藤酮、罗非考昔、罗格列酮、雷洛昔芬、柳氮磺胺吡啶、scriflavinium chloride、司莫司汀、链脲霉素、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺噻唑、磺胺异噁唑、磺胺胍、磺胺胍诺、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、复方新诺明、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲基噁唑、磺胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、星孢菌素、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺、替尼泊苷、tertiposide、睾内酯、丙酸睾酮、硫柳汞、硫鸟嘌呤、噻替派、咪唑、拓扑替康、曲妥珠单抗、三亚胺醌、曲奥舒凡(treosulfan)、甲氧苄啶、曲磷胺、UCN-01、长春花碱、硫酸长春碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、和佐柔比星,或者它们各自的衍生物或类似物。在一个实施例中,该化学治疗剂是但不限于:顺铂、依托泊苷、白蛋白结合型紫杉醇、曲妥珠单抗、吉西他滨、伊马替尼、伊立替康、奥沙利铂、硼替佐米、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、达卡巴嗪、环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、长春新碱、多西紫杉醇、长春瑞滨或埃博霉素B。
本公开也描述了联合疗法和组合物,也就是说如本文中所描述的化合物可与另外的治疗剂同时地、顺序地或单独地(或者其组合)施用。因此,在一个实施例中,施用是同时的,也就是说本文中所公开化合物(例如氯硝柳胺)和另外的治疗剂二者是在相同的时间施用。在另一实施例中,本文中所公开的化合物(例如氯硝柳胺)和另外的治疗剂是单独地施用。在又一实施例中,重组皮连蛋白和另外的治疗剂是顺序地施用,也就是说,例如可以首先施用氯硝柳胺,接着是另外的治疗化合物的施用。可替代地,在另一实施例中,可以首先施用另外的治疗剂,接着是例如氯硝柳胺的施用。在又一实施例中,施用第一治疗剂,其后施用如本文中所公开的化合物(例如氯硝柳胺),接着是第二治疗剂的施用。在再一个实施例中,施用一种治疗剂,接着是与第二治疗剂同时地重组皮连蛋白的后继施用。在一个实施例中,另外的治疗剂是在与如本文中所定义的化合物的施用同时地、顺序地或随后地被施用。在另一实施例中,另外的治疗剂是在与2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)的施用同时地、顺序地或者随后地被施用。
根据本发明的化合物可以经由各种公知的途径施用,包括口服、直肠、灌胃、颅内及胃肠外施用,例如静脉、肌内、鼻内、皮内、皮下、积存注射及类似的施用途径。取决于施用途径,需要不同的药物制剂并且部分的这些制剂会要求将保护涂层涂覆到该药物制剂上以防止本发明化合物在例如消化道中的降解。在一个实施例中,治疗的方法可以包括一个或更多个施用途径,该施用途径可以是但不限于:口服、脂肪内(intraadiposally)、动脉内、关节内、颅内、皮内、病灶内、肌内、鼻内、眼内、心包内、腹腔内、胸腔内、前列腺内、直肠内、鞘内、气管内、瘤内、脐带内、阴道内、静脉内、囊泡内、玻璃体内、脂质体包裹、局部、黏膜、口服、胃肠外、直肠、结膜下、皮下、舌下、局部、经口含化、经皮、阴道、霜剂、在脂质组合物中、经由导管、经由灌胃、通过连续输注、通过输注、通过吸入、通过注射、通过局部递送、通过局部灌注、直接地浸泡靶细胞、或者其任意组合。在一个实施例中,本文中所公开的化合物是口服施用的。在另一实施例中,本文中所公开的化合物是经皮或局部施用的。
根据如上所述的施用途径,可将本发明的化合物配制成糖浆剂、输注或注射溶液、片剂、胶囊剂、囊片、锭剂、脂质体、栓剂、硬膏剂、创可贴、延迟释放胶囊、粉剂、或缓释制剂。在一个实施例中,化合物2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物是根据但不限于下列中的任一剂型而配制:片剂、囊片、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、软弹性明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、扁囊剂、锭剂、含片、分散剂、栓剂、软膏剂、巴布膏剂、泥敷剂、糊剂、粉剂、敷料、乳膏剂、硬膏剂、溶液剂、贴剂、气雾剂、鼻喷雾剂、吸入剂、凝胶剂、混悬剂、水性混悬剂、非水性混悬剂、水包油乳剂、油包水液体乳剂、溶液剂、无菌固体制剂、结晶固体制剂、非晶态固体制剂、用于重构的固体制剂或其组合。
所请求保护的化合物的剂量取决于若干因素,包括但不限于施用方法、要被治疗的疾病、疾病的严重程度、要治疗还是预防疾病、及要被治疗的患者的年龄、体重和健康状态。
如上所述,本文中所描述的化合物可以各种剂型被施用,例如但不限于:以片剂、胶囊剂、酏剂或糖浆剂形式的口服,或者以栓剂形式的直肠施用。化合物的胃肠外施用合适地是以例如生理盐水溶液的形式或者将化合物并入脂质体中进行。在其中本身并非充分地可溶的化合物要被溶解的情况下,可加入增溶剂(如乙醇)。在以下的段落中,为了示例和说明的目的,对氯硝柳胺的剂量进行了描述。本领域技术人员将理解的是,如果可选的化合物替代了氯硝柳胺,通过检查在细胞增殖测定中该化合物的功效以及其在哺乳动物(例如人类)中的毒性可以确定正确的剂量。就局部施用而言,氯硝柳胺是以1-250g/L的溶液剂、乳膏剂、或凝胶剂中提供。就胃肠外或肠内施用而言,氯硝柳胺是以约0.1-50mg/kg/日的剂量。就口服施用而言,氯硝柳胺是以约10-3000mg/日的剂量。
就口服施用而言,本文中所公开的化合物(例如氯硝柳胺)的剂量为约0.001mg至3000mg每剂施用。在一个实施例中,口服剂量为约0.05mg至2000mg。在另一个实施例中,口服剂量为约0.5mg至1000mg。在另一实施例中,该口服剂量是每天施用1至10次。在另一实施例中,该口服剂量是每天施用1至5次。在另一个实施例中,该口服剂量是每天施用1至3次。这些剂量可周期性地施用,因而存在本文中所公开化合物(例如氯硝柳胺)不被施用的时间段。在一个实施例中,该时间段可以是但不限于例如下列的任何时间段:约1天、1周、1个月、或1年或以上。
针对用于预防感染的适应于直肠用途的组合物,稍微较高量的化合物通常是优选的。因此,在一个实施例中,本文中所公开化合物的直肠施用剂量,例如氯硝柳胺的剂量为约0.5mg至2500mg每剂。在另一实施例中,直肠施用剂量为约0.5mg至1500mg。在另一实施例中,直肠施用剂量是每天施用1至4次。治疗时间段是如以上针对口服施用所述。
就本文中所公开化合物(例如氯硝柳胺)的静脉施用或肌内施用而言,推荐例如约0.01mg/kg至约50mg/kg体重/日的剂量。在另一实施例中,推荐剂量为约0.05mg/kg至约15mg/kg。在又一实施例中,推荐剂量为约0.1mg/kg至约5mg/kg。
化合物可以每天施用达约6至12个月或以上。理想的是,化合物在1至3小时的时间段中施用。在一个实施例中,可将该时间段延长到持续24小时或以上。
就吸入而言,本文中所公开的化合物(例如氯硝柳胺)是以约0.001mg至5000mg/日的剂量施用。在一个实施例中,吸入剂量为约0.5mg至2000mg/日。
就本文中所公开化合物(例如氯硝柳胺)的局部/经皮施用而言,将约1mg至约5mg的剂量每天施用1至10次达1周至12个月的时间跨度。
用于本发明化合物的施用的药物形式是适合于注射使用的形式,并且包括无菌水溶液或分散液、及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下,最终的溶液或分散液形式必须是无菌且流动的。通常,这种溶液或分散液将包含溶剂或分散介质,包含例如水缓冲剂的水溶液,例如生物相容性的缓冲剂(buffers)、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇)、其合适的混合物、表面活性剂或植物油。也可以将本发明的化合物配制入脂质体中,特别地用于胃肠外施用。脂质体提供所公开药物在循环中半衰期增加的优点(如果与游离药物相比)、以及延长的且更均匀的释放。
输注或注射液的灭菌可以由任何数量的本领域已认可的技术来实现,包括但不限于防腐剂的添加,如抗细菌剂或抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞。此外,可将等渗剂,如糖类或盐类(特别地地氯化钠)加入输注或注射液中。含有一个或若干个本发明化合物的无菌注射液的生产是通过根据需要将各个化合物以所需量加入到具有上面所列举的各种成分的适当溶剂中接着进行灭菌而实现。为了获得无菌粉剂,必要时对上述溶液进行真空干燥或冷冻干燥。本发明的稀释剂是但不限于:水、生理上可接受的缓冲液、生理上可接受的缓冲盐溶液或盐溶液。载体是但不限于:可可脂和vitebesole。除上面已提到的赋形剂外,也可以选择但不限于以下赋形剂,与本发明的化合物的各种药物形式一起使用赋形剂:
(a)粘合剂,如乳糖、甘露醇、结晶山梨醇、磷酸氢盐(dibasic phosphates)、磷酸钙、蔗糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等;
(b)润滑剂,如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰醇富马酸钠;
(c)崩解剂,如淀粉类、交联羧甲纤维素、甲基纤维素钠、琼脂、硅皂土、海藻酸、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其他合适的辅料可以根据本领域中已知的知识而确定。应当理解的是,取决于疾病的严重程度及可用本发明化合物中的一个化合物治疗的具体疾病类型、以及要被治疗的各个患者(例如患者的一般健康状况等),需要不同剂量的各个化合物以获得治疗或预防效果。适当剂量的确定是在于主治医师的裁量。如本领域中已知的,给定组合物的药学有效量还将取决于施用途径。一般来说,如果施用是经过胃肠道(例如通过栓剂、直肠、或者利用胃内探头)则所需量将较高,如果施用途径是胃肠外(例如静脉)则所需量将较低。
在本发明的含义内,各取代基或变量的组合是容许的,只要这种组合形成稳定的或化学上可行的化合物。稳定的化合物或化学上可行的化合物是指在不存在湿气或其他化学反应性条件的情况下被保持在40℃或更低的温度至少1周时,未有显著改变的化合物。本发明也包括本文中所公开化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。水或油溶性或分散性产品可通过这样季铵化而获得。
可以将这些化合物配制成用于口服、静脉、鞘内或脑实质内施用。如本文中所公开的化合物及其衍生物可以口服施用,因此可以将这些化合物配制成用于口服施用。在这种情况下,可以容易地将适当量的化合物或其衍生物加以组合用于同时施用,以便在疾病(例如肿瘤)的部位同时地获得最有效浓度。
本文中说明性地描述的发明可合适地在本文中未具体公开的任何的一个或多个要素、一个或多个限制不存在的情况下实施。因此,例如术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“含有(containing)”等应可扩展地理解并且没有限制。此外,本文中所使用的术语和表述已被用作描述的术语而不具限制性,并且这种术语和词语的使用并非意图排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分,但一般认为在请求保护的本发明的范围内各种修改是可行的。因此,应当理解的是,尽管已通过实施例和任选的特征具体地公开了本发明,但本领域技术人员可实施本文中所公开的其中体现的本发明的修改和变型,并且这种修改和变型被认为是在本发明的范围内。
本文中已宽泛地且一般性地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括具有从该种属中排除任何主题名称的附带条件或负面限制的本发明的一般性描述,无论本文中是否具体地记载了该排除的材料。
其他实施方案是在所附权利要求和非限制性例的范围内。另外,在用马库什组的措辞描述本发明的各特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到也藉此由马库什组的任何单独成员或成员亚组来描述本发明。
试验章节
氯硝柳胺使p53缺失细胞变敏感
已证明本文中所公开的化合物(例如氯硝柳胺或其衍生物)诱导p53缺失细胞的优先敏化作用。氯硝柳胺导致HCT116 p53敲除细胞和其中使用p53特异性shRNAs敲减p53基因的正常人成纤维细胞的凋亡的增加,相比于HCT116细胞和内含野生型p53的正常人成纤维细胞。无野生型p53功能的细胞的存活率的损失被转化为裸小鼠中球状体(spheroid)生长的减小和肿瘤生长的减少。
使用p53+/+和p53-/-细胞筛选药物化合物
在共培养中使稳定表达H2B-GFP-HCT的p53+/+细胞(野生型p53细胞)和H2B-RFP-HCT的p53-/-细胞(缺乏p53的细胞)生长,以便筛选使野生型p53细胞或p53阴性细胞变敏感的药物化合物。简言之,以400细胞/孔的最终细胞密度、以80μl/孔的最终体积,将HCT116p53+/+和HCT116 p53-/-的各200个细胞覆盖在预涂药物的384孔板上。在将细胞覆盖入各个孔中之后,将各板孵育达6天。在药物孵育的6天后,通过进行多通道读取而使各板在Incell Analyzer 200机器中成像,亦即应用FITC染色以对GFP阳性细胞计数并且应用德州红染色以对RFP阳性细胞计数。在成像后,利用Incell-Investigator软件对原始数据进行处理,以对GFP阳性细胞和RFP阳性细胞的数量计数。图1中所给出的数据是来自大尺度成像的原始数据。
使用HCT116 p53的共培养的化学生物学筛选,将氯硝柳胺鉴定为选择性地靶向HCT116 p53-/-细胞。将表达H2B-GFP的野生型HCT116细胞与表达H2B-RFP的HCT115p53-/-细胞进行共培养。将细胞用氯硝柳胺进行处理,孵育48小时,然后使细胞在无药物培养基中恢复7天。使用INCELL Analyzer 2000对存活的细胞进行成像,以确定GFP(HCT116野生型)和RFP(HCT116 p53-/-)细胞的相对百分比。
二次筛选以验证潜在的药物化合物
以共培养的形式,使H2B-GFP-HCT116 p53+/+和H2B-RFP-HCT116 p53-/-的各2000个细胞在96孔板中以100μl的总体积生长。第二天,这些细胞被以DMSO处理或者以7种不同浓度的氯硝柳胺处理(如图2B中所示)。在药物孵育的48小时后,更换细胞培养基以开始恢复。在恢复6天后,在Incell Analyzer 2000机器中使细胞成像,确定活细胞的百分比并且将该百分比相对于试验中所使用的药物浓度绘图。
在等基因细胞系中的氯硝柳胺敏感性分析
在另一试验中,使用阴性对照加扰的shRNA(Addgene质粒#1864)、靶向p53的pLKO-p53-shRNA-941(Addgene质粒#25637)和靶向p53的shp53pLKO.1puro(Addgene质粒#19119)产生不同的慢病毒,各慢病毒含有前面所列出的各shRNA构建体中的一个。使用HCT116P53+/+细胞系,用含有阴性对照加扰的shRNA的对照病毒或者用靶向p53基因的两种不同病毒来感染细胞。在有些情况下,用两个独立的shRNA感染HCT116细胞系,各shRNA分别地靶向p53表达。因此,将这些独立的靶向p53表达的shRNA命名为shRNA(I)和shRNA(II)。在海美溴铵(聚凝胺)介导的病毒转导中的2(MOI2)的复合感染中使用一种或更多种病毒。在感染的18小时后,更换培养基。在感染2天后,给细胞添加含有嘌呤霉素(1μg/ml)的细胞培养基。在2周后,将新形成的耐抗生素克隆胰蛋白酶化并且转移到含有嘌呤霉素的新细胞培养皿中。通过蛋白质印迹法分析来检测这些细胞的p53缺失。利用免疫印迹法检测到高达90%的p53敲低。
HCT116-p53+/+NTshRNA、HCT116-sh p53(I)和HCT116-sh p53(II)还被用于通过集落形成测定对氯硝柳胺处理后的细胞存活率进行分析。简言之,将10,000个细胞覆盖到含有2ml细胞培养基的6孔细胞培养板中。第二天,用DMSO处理细胞作为阴性对照,或者用5种不同浓度(0.5μM、1μM、1.5μM、2μM和3μM)之一的氯硝柳胺处理细胞。在药物孵育48小时后,用新的细胞培养基替换含有药物的培养基并且使细胞生长达另外7天。在恢复的第8天,将细胞用结晶紫和戊二醛溶液染色达2小时并且在普通水中脱色。
这表明氯硝柳胺处理导致在药物处理的48小时后HCT116 p53-/-细胞的存活率比HCT116 p53野生型细胞更大程度的降低,而DMSO处理的对照显示HCT116野生型细胞和HCT116 p53-/-细胞的相等的细胞存活率。这在细胞存活率测定(图2a)和集落形成测定(图2b)中得到证实。显示在药物处理48小时后氯硝柳胺处理导致HCT116 p53-/-细胞活力比HCT116 p53野生型细胞更大程度降低,而DMSO处理的对照显示HCT116等效细胞活力野生型和HCT116 p53-/-细胞。氯硝柳胺使p53缺失人皮肤成纤维细胞变得敏感
用对照shRNA慢病毒或者靶向p53的shRNA病毒(如在前面的章节中所描述的)感染人皮肤成纤维细胞(TOBA细胞)。在稳定的p53敲低(利用puro选择)发生之后,针对响应于不同剂量的氯硝柳胺的细胞存活率对细胞进行分析。简言之,将野生型Toba细胞和p53耗尽细胞以20,000的细胞密度覆盖于6孔板中。第二天,用DMSO处理细胞或者用不同剂量的氯硝柳胺处理细胞。在药物孵育48小时后,用新的细胞培养基替换含有药物的培养基以起始恢复。在恢复的8天后,细胞在10倍物镜的光学显微镜下成像。
如上所述,通过Annexin V染色,针对凋亡性细胞死亡的存在,对DMSO处理的细胞和氯硝柳胺处理的细胞进行分析。通过胰蛋白酶化仔细地收集孔中的所有细胞,该细胞包括圆形漂浮的细胞(亦即,死亡或正在死亡的细胞)和贴壁细胞(亦即,活细胞)两者,并且以400g离心达5分钟。使细胞团块重悬浮于200μl的孵育缓冲液中,并且在重悬浮后以如上所述的相同的转速离心以收集经清洗的样品团块。然后,使用与孵育缓冲液预混合的AnnexinV溶液(在990μl的孵育缓冲液中混合的10μl Annexin V)于室温下在暗处孵育这些细胞团块达20分钟。在孵育后,将250μl的孵育缓冲液添加到各细胞团块,并进行FACS分析以测量死亡细胞的量。
结果证明,与正常野生型人成纤维细胞相比,氯硝柳胺导致p53缺失人成纤维细胞中更大程度的凋亡(图3),从而表明p53缺失细胞对氯硝柳胺的敏感性增加在不同的遗传背景中是一致的。
氯硝柳胺抑制在p53缺失的结直肠癌细胞中球状体的生长
在超低吸附的96孔细胞培养板中,以共培养的形式使H2B-GFP-HCT116 p53+/+细胞和H2B-RFP-p53-/-细胞生长,以促进球状体形成。简言之,为了形成三维多细胞球状体,以250个细胞/100μl培养基的密度将表达H2B-GFP的野生型(WT)p53细胞和表达H2B-RFP的p53阴性细胞各自接种于96孔圆底板中并且被快速离心(1000×g,5分钟)。将接种的细胞在5%CO2加湿气氛中于37℃下培养2天。在第3天,用DMSO处理细胞或者用不同剂量的氯硝柳胺处理细胞。在药物孵育48小时后,通过培养基更换将球状体稀释到无毒性的浓度。然后,将经处理的球状体再进一步培养6天。球状体在具有FITC和德州红通道的Incell Analyzer2000中成像。
已显示3D培养球状体测定起模拟体内肿瘤生长的作用,并且与二维培养相比可更准确地反映药物对肿瘤缩小的作用。已证明,当与正常野生型人球状体比较时,氯硝柳胺导致与野生型球状体相比3Dp53缺失HCT116球状体生长更大地减少(图4)。
氯硝柳胺强烈地诱导p53缺失和p53突变的癌细胞中的凋亡性细胞死亡
已示出,在体外细胞培养中,与具有功能性p53基因的癌细胞相比,氯硝柳胺对具有p53突变或p53缺失的癌细胞具有更强的凋亡作用。为此目的,根据各种癌症细胞系/类型的生长速率将其接种,以使其在相同时间汇合。将这些细胞系各自用不同的氯硝柳胺浓度处理达48小时。然后使这些细胞在它们各自的培养基中恢复达6天,其后进行凋亡细胞死亡测定。将在各样本中形成的凋亡细胞的百分比标绘于3D图形中(数据未示出)。已示出,p53缺失和p53突变的癌细胞二者以剂量依赖性的方式对氯硝柳胺的处理非常敏感,并且某些细胞类型显示对氯硝柳胺处理的速发型敏感性。也已证明氯硝柳胺差异性地降低某些细胞系中的剩余细胞的细胞存活率,表明在首次氯硝柳胺处理后存活的细胞示出对首次氯硝柳胺处理的延迟的治疗性响应(数据未揭示)。应注意的是,这些较低活力的细胞在处理后将会死亡,并且无需氯硝柳胺的进一步给药,从而表明氯硝柳胺的可能的二次杀伤作用的存在。
氯硝柳胺靶向小鼠中的p53缺失肿瘤
将内含p53K0突变的小鼠胚胎干细胞用DMSO处理或者用浓度为2μM的氯硝柳胺处理48小时。然后,将所形成的胰蛋白酶化细胞重悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中。对细胞进行计数并且重悬浮以形成1×106细胞/100μl的最终细胞浓度。在计数后立即将细胞转移至动物房进行裸小鼠注射。将100μl的DMSO处理的细胞注射入右腹股沟区,同时将100μl氯硝柳胺处理的细胞注射入各小鼠的左腹股沟区。在注射24天后,对肿瘤生长进行观察。通过手术的方式将所形成的畸胎瘤取出并进行分析,以观察氯硝柳胺抑制肿瘤生长的能力。
完成了试验以证明氯硝柳胺具有体内抗肿瘤作用。因此,利用了在裸小鼠中的体内肿瘤模型。作为对照,将小鼠胚胎干细胞(mES)注射入裸小鼠中并且监测小鼠中肿瘤生长(畸胎瘤)的存在。将用氯硝柳胺处理的mES细胞或DMSO处理的对照细胞注射入裸小鼠中并且在3周后监测肿瘤生长。结果表明是有效的抗癌剂,这是因为与仅用DMSO对照处理的小鼠中的畸胎瘤大小相比,氯硝柳胺导致畸胎瘤大小的显著减小(数据未显示)。
也使用患者来源的异种移植小鼠模型进行了试验。在这些试验中,将来源于患者的活检样本的卵巢癌肿瘤样本移植入小鼠的左侧部或者右侧部。使这些肿瘤在小鼠中移植生长并且在移植后每2天根据标准操作规程测量肿瘤体积。在达到约200mm3的最小阈值大小之后,用氯硝柳胺以150mg/kg的浓度对小鼠进行一次处理(静脉地)。在处理后进一步测量肿瘤体积的变化达30天。如在之前具有类似设定的体内试验中所示,已证明与已用PBS处理的阴性对照小鼠相比,用氯硝柳胺对荷瘤小鼠的处理导致肿瘤生长的减小。
所使用的细胞培养物和球状体培养基
Toba野生型细胞和sh p53耗尽的Toba细胞系
所使用的细胞培养基:补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素抗生素的DMEM高葡萄糖培养基;补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素抗生素的Mycos5A。
所利用的细胞系是HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-、HCT116 p53+/+H2B-GFP、HCT116p53-/-H2B-RFP。HCT116 p53-/-是由Bert Vogelstein试验室生产(Bunz,F.、Dutriaux,A.、Lengauer,C.、Waldman,T.、Zhou,S.、Brown,J.P.、Sedivy,J.M.、Kinzler,K.W.和Vogelstein,B.(1998)Science 282,1497-1501)。HCT116 p53-/-细胞系可免费地得到以用于学术研究并且广泛地流通。在HCT116背景中或基于HCT116背景的H2B-GFP和H2B-RFP细胞系是发明人内部制备。
在慢病毒转导2天后,嘌呤霉素被用于各个细胞培养基,以选择p53耗尽的TOBA细胞系和HCT116细胞系。
Claims (35)
1.一种使用如在式I中所定义的化合物或其衍生物来治疗癌症的方法:
其中
D是N或CR9;E是N或CR10;F是N或CR11;
R1是H、卤素、OR12、SR13、NR14、R15,
R2是H、OH或OR12;
R3是H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;或者R2与R3结合以形成六元环,其中位置1经由
连接到位置4;
R4和R8各自独立地选自H、卤素、CF3、OR28、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;
R5、R6和R7各自独立地选自H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基、卤素、NO2、CO2H、SO3H、CF3、CN、OR29、SR30,
X1、X2、X3和X4各自独立地是O、S;或NR38;
Y是CR25R26、O、S或NR27;
Z是O、S或CR50R51;
各Q独立地是O、S或NR52;
R9、R10和R11各自独立地是H、OH、OR12、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C1-7杂烷基、卤素或NO2;
R12和R13各自独立地是酰基、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;
R17、R22、R35、R36、R37、R38和R52各自独立地是C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;
R14、R15、R16、R18、R19、R20、R21、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34各自独立地是H、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基;R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50和R51各自独立地是H、卤素、CN、NO2、CF3、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、或C1-7杂烷基,其中所述癌症包含p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中X1是氧原子,R2是OH并且R3是H。
3.根据权利要求1所述的方法,其中R1是H或卤素。
4.根据权利要求3所述的方法,其中R1是Cl。
5.根据权利要求1所述的方法,其中R4和R8独立地是H、卤素或CF3。
6.根据权利要求5所述的方法,其中R4是Cl。
7.根据权利要求5所述的方法,其中R8是H。
8.根据权利要求1所述的方法,其中R5、R6和R7独立地是H、卤素、NO2、CO2H、SO3H、CF3或CN。
9.根据权利要求8所述的方法,其中R5是H。
10.根据权利要求8所述的方法,其中R6是NO2。
11.根据权利要求8所述的方法,其中R7是H。
12.根据权利要求1所述的方法,其中X1是O,R1是Cl,R2是OH,R3是H,R4是Cl,R5是H,R6是NO2,R7是H并且R8是H。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述化合物是
或其衍生物。
14.一种使用根据权利要求1至13中任一项所述的化合物治疗癌症的方法,其中所述癌症包含p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述化合物是2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物。
16.一种鉴定患者是否有可能或不大可能响应于治疗的方法,其中所述治疗包括如在权利要求1至13任一项中所定义的化合物的施用,其中所述方法包括确定从患者获得的细胞或组织样品是否包含(a)p53阳性或p53缺失细胞或者(b)无功能的p53,其中将所述细胞或组织样品鉴定为p53缺失或含有为无功能的p53的细胞或组织样品鉴定有可能响应于所述治疗的患者,其中将所述样品鉴定为p53阳性鉴定不大可能响应于所述治疗的患者。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述化合物是2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述癌症选自由以下组成的组:白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、皮肤癌(如基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)或黑色素瘤)、乳腺癌、头颈部癌(如脑癌)、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、肝癌、和与人乳头瘤病毒(HPV)相关的癌症(如宫颈癌)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述癌症选自由以下组成的组:白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、皮肤癌(如基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)或黑色素瘤)、头颈部癌(如脑癌)、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、肝癌、和与人乳头瘤病毒(HPV)相关的癌症(如宫颈癌)。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中如在权利要求1至13中任一项中所定义的化合物与另外的治疗剂一起施用。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述另外的治疗剂选自由以下组成的组:能够靶向细胞生长、存活、血管生成、黏附、迁移、入侵、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的化学治疗剂、抗癌药物;能够靶向细胞生长、存活、血管生成、黏附、迁移、入侵、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的小分子药物;用于转移性骨癌治疗的双膦酸盐类药物;肽治疗剂及其组合。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述化学治疗剂选自由以下组成的组:阿霉素、顺铂、依托泊苷、白蛋白结合型紫杉醇、曲妥珠单抗、吉西他滨、伊马替尼、伊立替康、奥沙利铂、硼替佐米、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、达卡巴嗪、环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、长春新碱、多西紫杉醇、长春瑞滨和埃博霉素B。
23.根据权利要求20至22所述的方法,其中所述另外的治疗剂是在与根据权利要求1至13中任一项所述的化合物的施用同时地、顺序地或随后地被施用。
24.如权利要求1至13中任一项所定义的化合物或其衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的用途,其中所述癌症包含p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞。
25.根据权利要求24所述的用途,其中所述化合物是2’,5-二氯-4’-硝基水杨酰替苯胺(氯硝柳胺)或其衍生物。
26.一种进行筛选以鉴定选择性地靶向第一细胞类型或第二细胞类型的化合物的方法,其中所述第一细胞类型是p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞,并且其中所述第二细胞类型是p53阳性细胞,并且其中用第一可检测标志物标记所述第一细胞类型并且其中用第二可检测标志物标记所述第二细胞类型,所述方法包括:
A.使所述第一细胞类型和第二细胞类型与所述化合物接触;和
B.确定所述第一可检测标志物和第二可检测标志物的相对量;
其中所述第一可检测标志物和第二可检测标志物可独立地被检测,并且其中与所述第二标志物的量相比所述第一标志物的量的相对增加表征选择性地靶向p53阳性细胞的化合物,并且其中所述第二标志物的量的相对增加表征选择性地靶向p53缺失细胞或者其中p53是无功能的细胞的化合物。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述可检测标志物是选自由以下组成的组:荧光化合物、放射性同位素化合物、非放射性同位素化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂化合物、发色化合物、X射线照相化合物和酶。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述荧光化合物是选自由以下组成的组:绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
29.根据权利要求28所述的方法,其中用红色荧光蛋白(RFP)标记所述第一细胞类型并且用绿色荧光蛋白(GFP)标记所述第二细胞类型。
30.根据权利要求26所述的方法,其中以体外或离体的方式使所述两种细胞类型与根据权利要求1至13中任一项所述的化合物接触。
31.根据权利要求26所述的方法,其中所述第一标志物和第二标志物的相对量是使用荧光激活细胞分选(FACS)或定量显微镜成像确定。
32.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求1至13中任一项所述的化合物和另外的治疗剂。
33.根据权利要求32所述的试剂盒,其中所述另外的治疗剂是选自由以下组成的组:能够靶向细胞生长、存活、血管生成、黏附、迁移、入侵、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的化学治疗剂、抗癌药物;能够靶向细胞生长、存活、血管生成、黏附、迁移、入侵、转移、细胞周期进程和/或细胞分化的小分子药物;用于转移性骨癌治疗的双膦酸盐类药物;肽治疗剂及其组合。
34.根据权利要求33所述的试剂盒,其中所述化学治疗剂是选自由以下组成的组:阿霉素、顺铂、依托泊苷、白蛋白结合型紫杉醇、曲妥珠单抗、吉西他滨、伊马替尼、伊立替康、奥沙利铂、硼替佐米、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、达卡巴嗪、环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、长春新碱、多西紫杉醇、长春瑞滨和埃博霉素B。
35.根据权利要求32至34所述的试剂盒,其中所述另外的治疗剂是在与根据权利要求1至13中任一项所述的化合物的施用同时地、顺序地或随后地施用。
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