CN108872584A - 一种α-Gal抗原快速检测试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种α‑Gal抗原快速检测试剂盒及其使用方法和应用。本发明提供了一种α‑Gal抗原快速检测试剂盒,所述试剂盒中包括固相α‑Gal抗原包被孔板、α‑Gal抗原标准品、鼠抗‑Gal IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体、过氧化氢显色液、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、苯甲基磺酰氟、浓缩洗液、样品稀释液、Gal抗原阳性生物材料参考品、Gal抗原阴性生物材料参考品。本发明提供的试剂盒对α‑Gal抗原的检测特异性达100%;灵敏度可检测31.25ng/ml的Gal抗原标准品(最低检测限)。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种α-Gal抗原快速检测试剂盒及其使用方法和应用。
技术背景
异种器官移植作为解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一,得到了科学界的广泛关注。动物源性生物材料已被广泛应用于外科的组织修复、替代和创伤治疗。然而,直接影响着这类材料使用的安全性和有效性的主要壁垒是异源免疫学问题。
科学研究已经明确了α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle,α-Gal)是异种器官移植超急性免疫排斥反应的主要靶抗原。α-Gal抗原广泛存在于猪、牛、马等低等动物体内,而人体及类人猿、旧世纪猴则不表达α-Gal抗原。但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体(占总血清球蛋白的1~3%),因此异种器官移植到人体时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。动物源性生物材料制备时,其α-Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应风险的关键。近年来α-Gal抗原缺失猪的研究发展很快,研究者希望利用α-Gal抗原缺失猪的组织、器官来制备生物材料,可以消除或者大大降低α-Gal抗原相关的免疫排斥反应。由此,对于α-Gal抗原的检测就显得尤为重要。对Gal抗原含量的检测,最早使用免疫组化方法。该方法通过使用显色剂对抗体、凝集素(如西非单叶豆凝集素,GS-IB4)进行标记,从而确定细胞内抗原的数量。但GS-IB4对于Gal抗原的识别,并非完全特异性;另外该方法对每个细胞含有的抗原数低于5×104个很难检测出,无法客观反应组织中抗原数目多少,无法满足更高质量的α-Gal抗原检测需求。
发明内容
本发明的目的在于克服技术背景中的技术问题,提供一种α-Gal抗原快速检测试剂盒及其使用方法和应用。
本发明提供了一种α-Gal抗原快速检测试剂盒,所述试剂盒中包括固相α-Gal抗原包被孔板、α-Gal抗原标准品、鼠抗-Gal IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体、过氧化氢显色液、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、苯甲基磺酰氟、浓缩洗液、样品稀释液、Gal抗原阳性生物材料参考品、Gal抗原阴性生物材料参考品。
优选的,所述固相α-Gal抗原包被孔板的制备方法包括如下步骤:
①将α-Gal抗原溶液(Gal-BSA)加入孔板,20~37℃条件下震摇1~3小时后,2~6℃条件下过夜;
②次日用血清白蛋白封闭,然后在37±2℃条件下孵育1~2小时;
③用洗液洗板3~5次,20~30℃条件干燥,得到固相α-Gal抗原包被孔板,2~6℃密封保存。
优选的,所述鼠抗-Gal IgM抗体的工作浓度为质量比0.4%~0.6%;所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体的工作浓度为质量比0.02%~0.05%。
优选的,所述显色终止液为浓硫酸;所述浓硫酸的工作浓度为体积比8~12%;所述浓缩洗液为吐温-20;所述吐温-20的工作浓度为体积比0.04%~0.06%。
优选的,所述样品稀释液为pH值7.0~7.4的PBS缓冲液。
优选的,所述Gal抗原阳性生物材料参考品为含有α-Gal抗原的动物组织冻干粉;所述Gal抗原阴性生物材料参考品为不含有α-Gal抗原的人源组织冻干粉。
优选的,所述Gal抗原阳性生物材料参考品和所述Gal抗原阴性生物材料参考品的制备方法独立包括如下步骤:
1)去除新鲜动物组织或人源组织中的脂肪及杂质,冻干;
2)将所述冻干的物料粉碎,过200~300目筛,-90℃到-70℃温度条件下保存。
本发明提供了上述检测试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
a)试验样品制备:将待测样品、Gal抗原阳性生物材料参考品和Gal抗原阴性生物材料参考品分别加入组织裂解液中裂解;将所述裂解得到的料液分别离心,取上清液;
b)取裂解液处理后的Gal抗原阴性生物材料参考品上清,对α-Gal抗原标准品进行倍比稀释,得各梯度浓度稀释液;
c)样品抗原-抗体反应:取同体积的待测样品上清液、抗原阳性参考品上清液和步骤b)所述各梯度浓度稀释液,分别与鼠抗-Gal IgM抗体溶液混合,37℃温育1~3小时后,2~6℃条件下过夜;第二天离心后取上清液备用;
d)竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取步骤c)所述第二天离心后的上清液,分别加入到α-Gal抗原包被孔板内,37℃温育0.5~1.5小时;用浓缩洗液稀释后洗板3~5次;
e)二次抗体反应和显色:向孔内加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体,37℃温育20~40分钟;用浓缩洗液稀释后洗板3~5次,甩干;加入过氧化氢显色液和TMB显色液,避光显色20~40分钟后加入显色终止液,利用酶标仪在450nm测定吸光度值A450nm;
f)根据待测样品的的吸光度值与预定的标准曲线,得到待测样品中α-Gal抗原的浓度。
本发明提供了上述检测试剂盒在动物源生物材料的α-Gal抗原清除率的工艺验证中的应用;所述动物源生物材料包括动物的组织、器官、细胞或所述动物组织、器官、细胞的衍生物。
本发明还提供了上述检测试剂盒在α-Gal抗原缺失模式动物的α-Gal抗原缺失程度验证中的应用;所述α-Gal抗原缺失模式动物包括利用基因敲除技术获得的不表达α-Gal抗原的模式动物。
有益效果:
本发明提供的试剂盒可定量检测各种动物源性生物材料、动物器官、组织、细胞及其衍生物、纯化物样品中的α-Gal抗原。经实验验证,本发明提供的试剂盒对α-Gal抗原的检测特异性达100%;灵敏度可检测31.25ng/ml的Gal抗原标准品(最低检测限)。本发明提供的试剂盒在检测α-Gal抗原过程中,各样品的检测回收率在80%~120%。标准品样品对数拟合或者四参数方程拟合,与预期浓度相关系数R值≥0.95。
附图说明
图1为本发明实施例1~2所述试剂盒的制备过程;
图2为本发明实施例3~4所述的α-Gal抗原标准品标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种α-Gal抗原快速检测试剂盒,所述试剂盒中包括固相α-Gal抗原包被孔板、α-Gal抗原标准品、鼠抗-Gal IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体、过氧化氢显色液、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、苯甲基磺酰氟、浓缩洗液、样品稀释液、Gal抗原阳性生物材料参考品、Gal抗原阴性生物材料参考品。
在本发明中,所述固相α-Gal抗原包被孔板中的α-Gal抗原包被的浓度优选为0.5~2μg/ml,更优选为1μg/ml;所述固相α-Gal抗原包被孔板的制备方法包括如下步骤:
①将α-Gal抗原溶液加入孔板,20~37条件下震摇1~3小时后,2~6℃条件下过夜;
②次日用血清白蛋白封闭,然后在37±2℃条件下孵育1~2小时;
③用洗液洗板3~5次,20~30℃条件干燥、2~6℃密封保存。
在本发明中,步骤①所述α-Gal抗原溶液优选使用碳酸盐缓冲液配制,所述碳酸盐缓冲液的pH值优选为9~10,更优选为9.5;所述α-Gal抗原溶液的浓度优选为0.5~2μg/ml,更优选为1μg/ml;所述α-Gal抗原溶液在孔板中的添加量优选为每孔95~105μl,更优选为100μl。本发明将α-Gal抗原溶液加入孔板,本发明对所述孔板的孔数没有特别要求,在本发明的实施例中,所述孔板为96-孔板。本发明将α-Gal抗原溶液加入孔板后,室温震荡温育,所述震荡的频率优选为50~150rpm,更优选为100rpm;所述震荡的时间优选为1~3h,更优选为2h。震荡温育后,本发明将α-Gal抗原溶液静置过夜,所述静置过夜的温度优选为2~6℃,更优选为4℃。
在本发明中,步骤②所述血清白蛋白优选包括人或牛血清白蛋白;所述血清白蛋白的浓度优选为质量比0.5~2%,更优选为质量比1%。所述血清白蛋白进行封闭后孵育,所述孵育的温度优选为37±2℃,所述孵育的时间优选为1~2h,更优选为1.5h。本发明所述孵育优选在震摇的条件下进行,所述震摇的频率优选为50~150rpm,更优选为100rpm。
在本发明中,步骤③所述浓缩洗液的有效成分为吐温-20,所述吐温-20的工作浓度优选为体积比0.04%~0.06%,更优选为体积比0.05%。本发明用浓缩洗液稀释至工作浓度后,对步骤②所述孵育后的孔板进行洗板3~7次;所述洗板后进行干燥、密封保存。所述干燥的温度优选为20~30℃,更优选为28±2℃。
本发明对所述α-Gal抗原标准品的来源没有特别限定,本领域常规市售产品即可。在本发明的实施例中,所述α-Gal抗原标准品购买自市售品“Dextra,NPG0203,Galal-3Gal-BSA”;
在本发明中,所述鼠抗-Gal IgM抗体的工作浓度优选为质量比0.4%~0.6%,更优选为0.5%;所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体的工作浓度为质量比0.02%~0.05%,更优选为0.033%。在本发明的实施例中,所述鼠抗-Gal IgM抗体购买自“M86,Enzo,ALX-801-090-1,EnzoLifescience”;所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体购买自“Santa Cruz Biotechnology,SC-2064”。
本发明所述过氧化氢显色液为含有过氧化氢的缓冲溶液,其中过氧化氢的质量体积浓度优选为0.015~0.02%,更优选为0.018%。以500ml过氧化氢显色液为1个单位,在本发明的实施例中,所述过氧化氢显色液由醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3ml,加蒸馏水定容至500ml配制获得。
本发明所述TMB显色液为含有TMB的缓冲液,其中TMB的质量体积浓度优选为0.02~0.04%,更优选为0.03%。以500mlTMB显色液为1个单位,在本发明的实施例中,所述TMB显色液由乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50ml,TMB 0.15g,DMSO 3ml,加蒸馏水定容至500ml配制获得。
本发明所述显色终止液为浓硫酸;所述浓硫酸的工作浓度为体积比8~12%;更优选为体积比10%。
本发明所述过氧化氢显色液和所述TMB显色液在工作时须混合后使用,所述混合的体积比优选为0.8~1.2:1,更优选为1:1;所述显色的条件优选为避光;所述显色反应的时间优选为20~40min,更优选为30min;本发明向显色反应混合液中加入显色终止液,显色反应停止。
本发明对所述组织裂解液和苯甲基磺酰氟的来源没有特别限定,本领域常规市售产品即可。在本发明的实施例中,所述组织裂解液为市售品“碧云天,P0013B RIPA裂解液(强)”,所述苯甲基磺酰氟(PMSF)为市售品“碧云天,ST506 PMSF”。本发明所述组织裂解液须配合苯甲基磺酰氟同时使用,苯甲基磺酰氟的添加量优选为0.5~3%,更优选为1%。
在本发明中,所述浓缩洗液优选为吐温-20,所述吐温-20的工作浓度优选为体积比0.04%~0.06%,更优选为体积比0.05%。所述样品稀释液优选为PBS缓冲液,所述PBS缓冲液的pH值优选为7.0~7.4,更优选为7.2。
在本发明中,所述Gal抗原阳性生物材料参考品优选为含有α-Gal抗原的动物组织冻干粉;所述Gal抗原阴性生物材料参考品优选为不含有α-Gal抗原的人源组织冻干粉。在本发明更具体的实施方式中,所述Gal抗原阳性生物材料参考品和所述Gal抗原阴性生物材料参考品的制备方法包括如下步骤:
1)取新鲜组织,去除脂肪及杂质,低温真空干燥;
2)将所述冻干的物料经过灭菌、粉碎,过200~300目筛,-80℃到-10℃温度条件下保存。
步骤1)所述杂质包括血管、血液以及其他无关组织等;优选的,本发明步骤1)所述去除杂质的方法包括:将新鲜组织切成薄片后漂洗,所述漂洗优选使用生理盐水进行,所述生理盐水的漂洗温度优选为0~4℃,所述漂洗的目的在于去除新鲜组织中的杂质。本发明步骤1)所述低温真空干燥优选在-80℃冻干36小时,测水分小于3%为合格。
本发明将步骤1)所述冻干的物料粉碎;本发明对具体的粉碎方法没有特别限定,使用机械粉碎机或者气流粉碎机均可;本发明优选在2~6℃条件下对冻干物料进行粉碎,所述粉碎的粒径优选为过200~300目筛,更优选过300目筛;筛下物即为参考品。本发明将过筛后的物料低温保存,所述保存的温度优选为-80℃到-10℃,更优选为-20℃。
本发明还提供了上述检测试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
a)试验样品制备:将待测试验样品、Gal抗原阳性生物材料参考品和Gal抗原阴性生物材料参考品分别加入组织裂解液中裂解;离心,取上清液;
b)标准曲线样品制备:取裂解液处理后的Gal抗原阴性生物材料参考品上清,对α-Gal抗原标准品进行倍比稀释,得各梯度浓度稀释液;
c)样品抗原-抗体反应:取同体积的试验样品上清液、抗原阳性参考品上清液和步骤b)所述各梯度浓度稀释液,分别与鼠抗-Gal IgM抗体溶液混合,37℃温育1~3小时后,2~6℃条件下过夜;第二天离心后取上清备用;
d)竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取上述反应上清液,分别加入到α-Gal抗原包被孔板内,使反应上清液中的剩余抗-Gal抗体与孔板内的固相抗原充分反应,37℃温育0.5~1.5小时;用浓缩洗液稀释后洗板3~5次;
e)二次抗体反应和显色:向孔内加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体,37℃温育20~40分钟;用浓缩洗液稀释后洗板3~5次,甩干;加入过氧化氢显色液和TMB显色液,避光显色20~40分钟后加入显色终止液,利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm;
f)利用标准曲线样品及测定结果绘制标准曲线,将待测试验样品的测定结果代入标准曲线中,计算检测结果。
在本发明中,步骤a)所述组织裂解液的浓度优选为1~3mg/ml,更优选为2mg/ml;所述裂解的温度优选为10~30℃,更优选为20℃,所述裂解的时间优选为2~4h,更优选为3h;所述裂解处理能充分暴露生物材料中的抗原。本发明在裂解后进行离心,取上清液。所述离心的速率优选为3000~5000rpm,更优选为4000rpm;所述离心的时间优选为8~12min,更优选为10min。
在本发明中,步骤b)所述α-Gal抗原标准品的浓度优选为3~5μg/ml,更优选为4μg/ml;本发明采用步骤a)制备的Gal抗原阴性参考品裂解液对所述α-Gal抗原标准品进行倍比稀释,优选设置5~10个浓度梯度,在本发明更具体的实施方式中,所述浓度梯度依次设置为:4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml和0.03125μg/ml;稀释混匀后,得各梯度浓度稀释液,备用。
在本发明中,步骤c)取同体积的试验样品上清液、抗原阳性参考品上清液和步骤b)所述各梯度浓度稀释液,分别与鼠抗-Gal IgM抗体溶液混合,然后在37℃温度条件下孵育;所述孵育的时间优选为1~4小时,更优选为2h;孵育结束后,静置过夜,所述静置过夜的温度优选为2~6℃,更优选为4℃。静置过夜后,本发明将反应液进行离心处理,所述离心的温度优选为2~6℃,更优选为4℃;所述离心的转速优选为12000×g~16000×g,更优选为14000×g;离心后,本发明取上清液备用;
在本发明中,步骤d)取上述反应上清液,分别加入到α-Gal抗原包被孔板内,使反应上清液中的剩余抗-Gal抗体与孔板内的固相抗原充分反应,37℃温育反应;所述温育反应的时间优选为0.5~1.5小时,更优选为1小时。所述温育结束后,本发明用浓缩洗液稀释后洗板3~7次,甩干。
在本发明中,步骤e)进行二次抗体反应和显色操作。所述二次抗体反应的操作具体为:向孔内加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体,每孔加入量优选为80~120μl,更优选为100μl;37℃温育反应;所述温育反应的时间优选为20~40min,更优选为30min。所述温育结束后,用浓缩洗液稀释后洗板3~7次,甩干。所述显色的操作具体为:将过氧化氢显色液和TMB显色液混合,每孔加入混合后的显色液,避光显色反应;所述混合的体积比例优选为过氧化氢显色液:TMB显色液0.8~1.2:1,更优选为1:1;所述显色反应的时间优选为20~40min,更优选为30min;所述混合后的显色液加入量优选为80~120μl,更优选为100μl;本发明向显色反应混合液中加入显色终止液,显色反应停止;所述显色终止液的加入体积量占所述混合显色液体积量的1/3~2/3,更优选为1/2。显色反应终止后,本发明利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm。
在本发明中,步骤f)利用标准曲线样品及测定结果绘制标准曲线,将待测试验样品的测定结果代入标准曲线中,计算检测结果。具体的,本发明优选以α-Gal抗原标准品浓度(μg/ml)为横坐标,各样品相应的抗-Gal抗体的结合抑制率(%)为纵坐标绘制标准曲线图。在本发明中,不同试验样品所含Gal抗原的抗-Gal抗体结合抑制率%=[(100%反应对照孔OD值均值-试验样品与抗-Gal抗体反应OD值均值)/(100%反应对照孔OD值均值–空白对照孔OD值均值)×100]%。
在本发明优选的实施方案中,所述标准曲线为:y=18.28ln(x)+62.03,R2=0.991。
本发明的试剂盒中预先制备好了抗原包被板,还组合了配制好的其他样品及后续ELISA检测的所有试剂,从而可使反应体系系统化和一体化,快速方便。同时,本试剂盒包含了Gal抗原阳性生物材料参考品和Gal抗原阴性生物材料参考品,参考品的组成与待检测生物材料相似,可直接监测试验体系是否成立,能够判断与排除假阳性和假阴性,确保检测的可靠性。本发明的试剂盒可以定量性地检测样品中的抗原量,可以检测待测样品中微量的残留α-Gal抗原,具有很高的灵敏度和特异性。本发明试剂盒性能:特异性达100%;灵敏度为可以检测31.25ng/ml Gal抗原标准品(最低检测限);标准曲线各样品的检测回收率在80%~120%。标准品样品对数拟合或者四参数方程拟合,与预期浓度相关系数R值为≥0.95。
本发明提供了上述检测试剂盒和检测试剂盒的使用方法在动物源生物材料的α-Gal抗原清除率的工艺验证中的应用;所述动物源生物材料包括动物的组织、器官、细胞或所述动物组织、器官、细胞的衍生物。
本发明还提供了上述检测试剂盒和检测试剂盒的使用方法在Gal抗原缺失模式动物的Gal抗原缺失程度(是完全缺失,还是部分缺失,或者降低了多少)验证中的应用;所述Gal抗原缺失模式动物包括利用基因敲除技术获得的不表达Gal抗原的模式动物,如:Gal抗原缺失的猪。
下面结合实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种α-Gal抗原快速检测试剂盒,包括如下组分:
1)固相α-Gal抗原包被的96-孔板:包被α-Gal抗原,包被缓冲液为0.2M、pH 9.5碳酸盐缓冲液,包被量为:浓度为1~2μg/ml的α-Gal抗原溶液,每孔100μl;
2)抗-Gal抗体:鼠抗-Gal IgM抗体
3)二次抗体酶结合物:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体;
4)显色液A液:醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3ml,蒸馏水加至500ml;
5)显色液B液:乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50ml,取0.15g TMB溶于3ml DMSO中,蒸馏水加至500ml;
6)显色终止液:10%浓硫酸(体积比);
7)组织裂解液:直接使用市售产品,碧云天“P0013B RIPA裂解液(强)”;
8)浓缩洗液:1%的吐温-20(使用时稀释20倍);
9)样品稀释液:pH值7.2的PBS缓冲液;
10)α-Gal抗原标准品:直接使用市售产品,Dextra,NPG0203,Gala1-3Gal-BSA;
11)苯甲基磺酰氟:直接使用市售产品;
12)阳性参考品:α-Gal抗原阳性生物材料参考品;
13)阴性参考品:α-Gal抗原阴性生物材料参考品。
实施例2
一种α-Gal抗原快速检测试剂盒,其制备方法包括:
1)α-Gal抗原包被酶标板的制备:配制α-Gal抗原溶液,1~2μg/ml,缓冲液为pH9.5碳酸盐缓冲液(0.2M);取100μl加入到96-孔板(Nunc.Rochester,NY),室温震荡温育2小时候转4℃过夜;用1%的人/牛血清白蛋白进行封闭(37℃、2小时),之后用0.05%的吐温-20/PBS洗液进行洗板3~5次,加洗液200μl/孔,浸泡30s,用微孔板振荡器震摇清洗3~5次,第一次5min,后两次3min;去除洗液后将包被板放置在生物安全柜内通风暴露2min使其风干,与干燥剂一起密封包装,4℃保存。
2)其他溶液配制:
样品稀释液:pH 7.2的磷酸盐缓冲液;
浓缩洗液:用PBS配制1%的吐温-20浓缩洗液;
显色液A液:醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3ml,蒸馏水加至500ml;
显色液B液:乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50ml,取0.15g TMB溶于3ml DMSO中,蒸馏水加至500ml;
显色终止液:取10ml浓度为95%的浓硫酸,加蒸馏水至100ml即可;
组织裂解液:可直接使用市售品,碧云天“P0013B RIPA裂解液(强)”;
苯甲基磺酰氟:可直接使用市售品;
抗-Gal抗体:用PBS稀释,稀释比例为:1:200;
二次抗体酶结合物:用PBS稀释,稀释比例为:1:3000;
Gal抗原标准品:可使用市售品“Dextra,NPG0203,Gala1-3Gal-BSA”,配制成40μ/ml;
其他样品:α-Gal抗原阳性生物材料参考品和α-Gal抗原阳性生物材料参考品的的制备方法为:1)首先将新鲜组织去除脂肪及杂质,切成薄片状,经0~4℃生理盐水充分漂洗后去除多余水分;2)在0~4℃条件下进行搅碎后将其进行冻干;3)将冻干品进行粉碎成粉末状,过筛(200~300目)后分装保存在-80℃。α-Gal抗原阳性生物材料参考品的分装量为:10mg/瓶;α-Gal抗原阴性生物材料参考品分装量为:15mg/瓶。
采用本实施例的方法可制备得到实施例1中所述的试剂盒。
实施例3
试剂盒性能评价:
用实施例1的试剂盒分别检测α-Gal抗原阴性生物材料参考品和α-Gal抗原,评价其特异性、灵敏度和检测回收率。具体试验步骤如下:
1.样品的准备:取α-Gal抗原阴性生物材料参考品和α-Gal抗原阳性生物材料参考品,配制2mg/ml组织裂解液(使用前加1%苯甲基磺酰氟),室温放置3小时使组织充分裂解,暴露抗原;于4000rpm离心10min后取上清备用;
2.标准曲线样品准备:取Gal抗原标准品4μg/ml,采用上述制备的α-Gal抗原阴性生物材料参考品(2mg/ml)裂解液进行倍比稀释,浓度梯度依次设置为:4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml和0.03125μg/ml,稀释混匀后备用;
3.样品抗原-抗体反应:取上述配制样品的上清液各200μL放入1.5ml离心管中,分别加入200μL实施例1所述试剂盒中的抗-Gal抗体溶液,混匀后于37℃轻度震荡温育2小时,之后转4℃过夜,次日在4℃、14000×g条件下离心30分钟后取上清备用;
4.竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取上述反应上清液各100μL加入到α-Gal抗原包被酶标板内(每个样品做2~3个复孔),使反应上清液中的剩余抗体与包被酶标板内的固相抗原充分反应,37℃伴随轻轻摇动,反应1小时;洗液洗板3~5次,甩干;
5.二次抗体反应和显色:每孔加二次抗体酶结合物100μL,置37℃温育0.5小时;洗液洗板5次,甩干;将显色液A液和显色液B液按照1:1混合,每孔加入混合的显色液100μL,避光显色0.5小时,加入显色终止液,每孔50μL。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm。
6.检测结果如表1、表2和图2(标准曲线图)所示:
表1:Gal抗原阴性生物材料参考品和阳性生物材料参考品的抗体结合抑制率
表2:标准曲线样品检测回收率计算表
灵敏性:由图2可得到标准曲线方程:y=18.28ln(x)+62.03,R2=0.991,最低能够检测浓度为31.25ng/ml的Gal抗原标准品,R2>0.95,符合要求;
特异性:由表1可知,Gal抗原阴性生物材料参考品的检测OD值不低于对照组(裂解液/抗-Gal抗体),二者无显著性差异,即:未引起抗体的竞争,证实未检测到α-Gal抗原,特异性为100%;
检测回收率:将表2中的抗体结合抑制率带入标准曲线方程(y=18.28ln(x)+62.03),反推标准品检测终浓度,再用公式:检测终浓度/实际终浓度×100=回收率(%),得到各样品的回收率,标准品各稀释样品的回收率在80%~120%之内,符合要求。
α-Gal抗原阳性生物材料参考品的α-Gal抗原含量的检测结果:将α-Gal抗原阳性生物材料参考品的抗体结合抑制率“68.47”带入标准曲线方程的y(y=18.28ln(x)+62.03),计算得到所含α-Gal抗原含量相当于α-Gal抗原标准品1.422μg/mg质量单位。
实施例4:
采用实施例1的试剂盒进行检测的标准操作规程,详细操作规程如下:
1.参考品的准备:α-Gal抗原阳性生物材料参考品和α-Gal抗原阴性生物材料参考品(冻干粉)各配制2mg/ml组织裂解液(使用前加1%苯甲基磺酰氟),直接进行组织裂解3小时后,4000rpm,离心10分钟,取上清液备用。
2.标准曲线样品准备:取浓度为4μg/ml的Gal抗原标准品,使用步骤1中制备好的α-Gal抗原阴性生物材料参考品(2mg/ml)作为稀释液进行倍比稀释,共5~7个浓度梯度,稀释混匀后备用;
3.检测样品的制备:精确称取一定量的检测样品于离心管中,用眼科剪刀剪碎后加入一定量的组织裂解液(使用前加1%苯甲基磺酰氟)配制成一定浓度的样品,使用匀浆仪将样品匀浆至底部无肉眼可见颗粒物,之后室温静置3小时,使检测样品充分裂解,4000rpm,离心10分钟,取上清液备用。注:阳性参考品可直接加入裂解液进行裂解。
4.样品抗原-抗体反应:取上述制备好的参考品裂解液的上清液、裂解后样品上清液和标准品稀释液各200μL分别放入1.5ml离心管中,分别加入200μL实施例1所述试剂盒中的抗-Gal抗体溶液,混匀后37℃温育2小时,放置4℃过夜,次日在4℃,14000g条件下离心30分钟后取上清备用;
5.用阴性参考品裂解液与实施例1所述试剂盒中抗-Gal抗体溶液按照1:1的体积配制成“抗-Gal抗体与阴性参考品裂解液混合液”,作为100%抗-Gal抗体的结合反应对照(为了排除生物材料基质及组织裂解液对抗原-抗体反应和光学测定的干扰),同时以裂解液作为空白孔对照。
6.竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取上述反应上清液各100μL加入到α-Gal抗原包被酶标板内(3个复孔),使反应上清液中的剩余抗-Gal抗体与包被酶标板内的固相抗原充分反应,37℃温育1小时;洗液洗板5次,甩干;
7.二次抗体反应和显色:每孔加实施例1所述试剂盒中酶标抗体100μL,置37℃孵育0.5小时;洗液洗板5次,甩干;将显色液A液和显色液B液按照1:1混合,每孔加入混合的显色液100μL,避光显色0.5小时,加入显色终止液,每孔50μL。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm。
8.结果计算:
1)试验样品抗-Gal抗体的结合抑制率(%)计算方法
不同试验样品所含Gal抗原的抗-Gal抗体结合抑制率%=[(100%反应对照孔OD值均值-试验样品与抗-Gal抗体反应OD值均值)/(100%反应对照孔OD值均值–空白对照孔OD值均值)x100]%
2)标准曲线的绘制:
以α-Gal抗原标准品浓度(μg/ml)为横坐标,各样品相应的抗-Gal抗体的结合抑制率(%)为纵坐标绘制标准曲线图(见图2)。得到标准曲线方程如下:
y=18.28ln(x)+62.03,R2=0.991。
3)计算待测试验样品的相对Gal抗原含量及α-Gal抗原表位数
试验样品的抗体结合抑制率可通过1)中给出的公式计算得出,将其对应的抗体结合抑制率带入到2)中标准曲线方程式中,计算得到相当于α-Gal抗原标准品的浓度,再根据反应体积计算出单位质量待测试验样品中相当于α-Gal抗原标准品的α-Gal抗原含量。
根据所使用α-Gal抗原标准品中单位质量的Gal抗原数,如本批α-Gal抗原标准品的Gal抗原表位数为1.82×1014/μg(如果使用市售产品,可根据产品说明书中相关信息计算得到),由此可计算出待测试验样品中的α-Gal抗原表位数的含量。如:实施例3中检测的α-Gal抗原阳性生物材料参考品中所含α-Gal抗原含量相当于α-Gal抗原标准品1.422μg/mg质量单位,其α-Gal抗原表位数为:1.422μg/mg×(1.82×1014/μg)=2.588×1014/mg质量单位。
4)实验结果判定
A、能够检测到α-Gal抗原阳性生物材料参考品中的Gal抗原;浓度为2mg/ml Gal抗原阳性生物材料参考品中含Gal抗原量相当于α-Gal抗原标准品的浓度为1.422μg/mg,即:约含2.6×1014Gal抗原表位数/mg Gal抗原阳性生物材料参考品。
B、α-Gal抗原阴性生物材料参考品未检测到Gal抗原。
9.使用本试剂盒的检测结果
1)以Gal抗原标准品制备的标准曲线见图2,曲线的绘制和计算方法同上。
2)α-Gal抗原阳性生物材料参考品的抗体结合抑制率见表1。
3)α-Gal抗原阴性生物材料参考品的抗体结合抑制率见表1。
4)α-Gal抗原阳性生物材料参考品α-Gal抗原计算方法:参照步骤8所述的试验样品α-Gal抗原计算方法。
结果表明,α-Gal抗原阳性生物材料参考品的检测为阳性,其中α-Gal抗原含量约为2.6×1014/mg单位质量冻干粉;α-Gal抗原阴性生物材料参考品的抗体结合抑制率为0,证实阴性参考品不含有Gal抗原。
以上详细说明了本发明的实施方式,但这只是为了便于理解而举的实例,不应被视为是对本发明范围的限制。同样,任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述,做出各种可能的等同改变或替换,但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种α-Gal抗原快速检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括固相α-Gal抗原包被孔板、α-Gal抗原标准品、鼠抗-Gal IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体、过氧化氢显色液、TMB显色液、显色终止液、组织裂解液、苯甲基磺酰氟、浓缩洗液、样品稀释液、Gal抗原阳性生物材料参考品、Gal抗原阴性生物材料参考品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固相α-Gal抗原包被孔板的制备方法包括如下步骤:
①将α-Gal抗原溶液加入孔板,20~37℃条件下震摇1~3小时后,2~6℃条件下过夜;
②次日用血清白蛋白封闭,然后在37±2℃条件下孵育1~2小时;
③用洗液洗板3~5次,20~30℃条件干燥,得到固相α-Gal抗原包被孔板,2~6℃密封保存。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述鼠抗-Gal IgM抗体的工作浓度为质量比0.4%~0.6%;所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体的工作浓度为质量比0.02%~0.05%。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述显色终止液为浓硫酸;所述浓硫酸的工作浓度为体积比8~12%;所述浓缩洗液的有效成分为吐温-20;所述吐温-20的工作浓度为体积比0.04%~0.06%。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液为pH值7.0~7.4的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述Gal抗原阳性生物材料参考品为含有α-Gal抗原的动物组织冻干粉;所述Gal抗原阴性生物材料参考品为不含有α-Gal抗原的人源组织冻干粉。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述Gal抗原阳性生物材料参考品和所述Gal抗原阴性生物材料参考品的制备方法独立包括如下步骤:
1)去除新鲜动物组织或人源组织中的脂肪及杂质,冻干;
2)将所述冻干的物料粉碎,过200~300目筛,-90℃到-70℃温度条件下保存。
8.权利要求1~7任意一项所述检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)试验样品制备:将待测样品、Gal抗原阳性生物材料参考品和Gal抗原阴性生物材料参考品分别加入组织裂解液中裂解;将所述裂解得到的料液分别离心,取上清液;
b)取裂解液处理后的Gal抗原阴性生物材料参考品上清,对α-Gal抗原标准品进行倍比稀释,得各梯度浓度稀释液;
c)样品抗原-抗体反应:取同体积的待测样品上清液、抗原阳性参考品上清液和步骤b)所述各梯度浓度稀释液,分别与鼠抗-Gal IgM抗体溶液混合,37℃温育1~3小时后,2~6℃条件下过夜;第二天离心后取上清液备用;
d)竞争性剩余抗体-固相抗原反应:取步骤c)所述第二天离心后的上清液,分别加入到α-Gal抗原包被孔板内,37℃温育0.5~1.5小时;用浓缩洗液稀释后洗板3~5次;
e)二次抗体反应和显色:向孔内加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM抗体,37℃温育20~40分钟;用浓缩洗液稀释后洗板3~5次,甩干;加入过氧化氢显色液和TMB显色液,避光显色20~40分钟后加入显色终止液,利用酶标仪在450nm测定吸光度值A450nm;
f)根据待测样品的的吸光度值与预定的标准曲线,得到待测样品中α-Gal抗原的浓度。
9.权利要求1~7任意一项所述检测试剂盒在动物源生物材料的α-Gal抗原清除率的工艺验证中的应用;所述动物源生物材料包括动物的组织、器官、细胞或所述动物组织、器官、细胞的衍生物。
10.权利要求1~7任意一项所述检测试剂盒在α-Gal抗原缺失模式动物的α-Gal抗原缺失程度验证中的应用;所述α-Gal抗原缺失模式动物包括利用基因敲除技术获得的不表达α-Gal抗原的模式动物。
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