CN108872352A - 联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法 - Google Patents

联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法，采用循环伏安（CV）法和电化学发光（ECL）法，结合盐酸丁螺环酮对联吡啶钌增敏作用，利用盐酸丁螺环酮与联吡啶钌（Ru(bpy)3 2+）体系的电化学行为和电化学发光（ECL）行为，建立了一种新型测定盐酸丁螺环酮的方法。在最佳条件下，电致化学发光强度值与盐酸丁螺环酮在1.00×10‑6 mol·L‑1～8.00×10‑4mol·L‑1范围内呈良好线性关系（R 2=0.9946，n=15），方法检出限为6.2×10‑8 mol·L‑1(S/N=3)。该方法具有良好的灵敏度与较高的选择性，样品处理简单快速，用于检测药物中的盐酸丁螺环酮，效果良好。

Description

联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法
技术领域
本发明涉及一种测定药物中盐酸丁螺环酮含量的方法，特别涉及一种联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法。
背景技术
焦虑症作为现代社会常见精神疾病，其发病率呈逐渐上升趋势，焦虑、紧张情绪已严重威胁人们身心健康。在抗焦虑药物中，盐酸丁螺环酮（buspirone hydrochloride）作为一种新型抗焦虑药物，可通过激活脑内无羟色胺（5-HT）1A受体而改变焦虑情绪，临床治疗中无镇静作用和催眠副作用，且不产生耐受性和依赖性，临床疗效显著。为实现对盐酸丁螺环酮准确、定量测定，目前已建立了高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、高效液相-电化学法（HPLC-ECD）、离子对反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等，与HPLC相比，后者联用技术虽然解决了HPLC检测线性范围窄、检出限高等不足，但这些方法操作相对繁琐，且仪器设备贵重，不利于实现对盐酸丁螺环酮进行快速、准确、高效分析的普及与应用。
盐酸丁螺环酮结构式为：
电致化学发光法（Electrogenerated chemiluminescence，ECL）是化学发光、电化学相结合的一种新型分析技术，利用测定物质与发光试剂在容器中发生化学反应，通过光信号分析进行检测的一种新型分析方法。发光试剂联吡啶钌[Ru(bpy)3 2+]具有稳定性强、水溶性好，发光效率高等优点，且其氧化-还原可逆，可重复利用，所以以联吡啶钌为反应体系的电致化学发光技术在生物、医药、环境等应用中具有独特优势。
目前，国内外未见有关电致化学发光法检测盐酸丁螺环酮的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法，该方法采用循环伏安（CV）法和电化学发光（ECL）法，结合盐酸丁螺环酮对联吡啶钌增敏作用，利用盐酸丁螺环酮与联吡啶钌（Ru(bpy)3 2+）体系的电化学行为和电化学发光（ECL）行为，建立了一种新型测定盐酸丁螺环酮的方法，该方法具有仪器便捷、操作简单、灵敏度高、重现性好、检测线性范围宽等优势。
解决上述技术问题的技术方案是：一种联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法，其特征在于：使用金电极为工作电极，以MPI-E型电致化学发光工作站为试验平台，采用电致化学发光三电极系统，在扫描电压0.2 V~1.25 V、扫描速率0.1V/s、光电倍增管负高压800 V~900 V、pH值5.5~7.0磷酸盐缓冲溶液为支持电解质条件下，由MPI-E型电致化学发光工作站记录Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮发光强度，并于室温下采用循环伏安法对盐酸丁螺环酮进行定量测定，并依据盐酸丁螺环酮发光强度与浓度间的对应关系，绘制盐酸丁螺环酮发光强度与浓度的校正曲线，并通过线性回归分析，得出一定合理区间内的线性回归方程，同时利用校正曲线，对盐酸丁螺环酮进行含量测定。
本发明工作电极的预处理方法为：将金电极用超纯水冲洗干净，用金相砂纸小心打磨，再用0.3mm的Al2O3抛光粉将金电极在鹿皮上打磨抛光至镜面，用水将表面的残留物冲洗干净，将金电极小心装入离心管中用水超声5min后拿出晾干备用；在检测之前再用0.10mol·L-1的硫酸连续测样20次，用于除去电极或检测器中可能残留的杂质。
本发明基于盐酸丁螺环酮对联吡啶钌增敏作用，建立了一种新型测定盐酸丁螺环酮的方法。结果表明，在最佳条件下，电致化学发光强度值与盐酸丁螺环酮在1.00×10-6mol·L-1～8.00×10-4mol·L-1范围内呈良好线性关系（R 2=0.9946，n=15），方法检出限为6.2×10-8 mol·L-1 (S/N=3)。对样品进行回收率试验，回收率在95~101%之间，RSD为2.14%。该方法具有仪器便捷、操作简单、灵敏度高、重现性好、检测线性范围宽等优势，为盐酸丁螺环酮在临床中更加科学应用提供技术支持。
下面结合附图和实施例对本发明之联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法的技术特征作进一步的说明。
附图说明
图1：电化学发光检测池示意图。
图2：盐酸丁螺环酮的电化学发光曲线图。
图3：联吡啶钌与联吡啶钌-盐酸丁螺环酮循环伏安曲线图。
图4：联吡啶钌与联吡啶钌-盐酸丁螺环酮的电化学发光曲线图。
图5：不同缓冲溶液pH值对电化学发光强度的影响曲线图。
图6：光电倍增管高压对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮ECL强度的影响曲线图。
图7：扫描速率对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮ECL强度的影响曲线图。
图8： Ru(bpy)3 2+浓度对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮ECL强度的影响曲线图。
图9：不同浓度盐酸丁螺环酮的电致化学发光曲线（A）及校正曲线（B）图；其中(a)1.00×10-6 mol·L-1, (b) 2.00×10-6 mol·L-1, (c) 4.00×10-6 mol·L-1, (d) 6.00×10-6 mol·L-1, (e) 8.00×10-6 mol·L-1, (f) 1.00×10-5 mol·L-1, (g) 2.00×10-5mol·L-1, (h) 4.00×10-5 mol·L-1, (i) 6.00×10-5 mol·L-1, (j) 8.00×10-5 mol·L-1, (k) 1.00×10-4 mol·L-1, (l) 2.00×10-4 mol·L-1, (m) 4.00×10-4 mol·L-1,(n) 6.00×10-4 mol·L-1, (o) 8.00×10-4 mol·L-1。
图10：连续测定7次的重现性及稳定性示意图。
图1中：1.工作电极；2. PMT(光电倍增管)；3.对电极；4.试剂及样品进口；5.参比电极；6.封口膜。
具体实施方式
实施例和研发过程中采用的仪器与试剂：
MPI-E型电致化学发光分析系统多功能化学发光检测仪（西安瑞迈电子科技有限公司）；DL-60D型超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；旋涡混合器，XW-80A型（上海精科实业有限公司）；微量移液器（德国eppendorf生产）；EF20 pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。电致化学发光三电极系统：金电极为工作电极，Pt丝电极为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl溶液）为参比电极。
1.0×10-3mol·L-1盐酸丁螺环酮标准储备液：准确称取0.0105 g盐酸丁螺环酮（中国药品生物制品检定所），定溶于25 mL棕色容量瓶中，超声波除气后冷藏于4 ℃冰箱中备用。1.0×10-3 mol·L-1 Ru(bpy)3 2+（Aldrich公司）储备液；盐酸丁螺环酮，规格：5mg/片（北大医药股份有限公司）；0.3mmAl2O3抛光粉（天津艾达恒晟科技发展有限公司）；其它试剂为分析纯或化学纯，实验用水均为二次石英亚沸水。
实施例1：一种联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法，使用金电极为工作电极，以MPI-E型电致化学发光分析系统多功能化学发光检测仪为测试平台（如图1所示），采用电致化学发光三电极系统，在pH=6.0磷酸盐缓冲溶液中，扫描电压0.2 V~1.25V、扫描速率0.1V/s、光电倍增管负高压850V、支持电解质条件下，由MPI-E型电致化学发光工作站记录Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮发光强度，并于室温下采用循环伏安法对盐酸丁螺环酮进行定量测定，并依据盐酸丁螺环酮发光强度与浓度间的对应关系，绘制其发光强度与浓度的校正曲线，并通过线性回归分析，得出一定合理区间内的线性回归方程，同时利用校正曲线，对盐酸丁螺环酮进行含量测定。
本实施例中，工作电极的预处理方法为：将金电极用超纯水冲洗干净，用金相砂纸小心打磨，再用0.3mm的Al2O3抛光粉将金电极在鹿皮上打磨抛光至镜面，用水将表面的残留物冲洗干净，将金电极小心装入离心管中用水超声5min后拿出晾干备用；在检测之前再用0.10mol·L-1的硫酸连续测样20次，用于除去电极或检测器中可能残留的杂质。
在实施例1所述的最佳条件下，电致化学发光强度值与盐酸丁螺环酮在1.00×10-6mol·L-1～8.00×10-4mol·L-1范围内呈良好线性关系（R 2=0.9946，n=15），其线性回归方程为：I（counts）=21.185×106 C+519.83，方法检出限为6.2×10-8 mol·L-1 (S/N=3)。对样品进行回收率试验，回收率在95~101%之间，RSD为2.14%。本发明方法具有良好的灵敏度与较高的选择性，样品处理简单快速，用于检测药物中的盐酸丁螺环酮，效果良好。
样品分析与回收率
采用本发明如实施例1所述方法进行样品分析：取10片盐酸丁螺环酮（北大医药股份有限公司），每片药品的有效成分为5mg，放入研钵中研磨粉碎混合均匀，称取相当于1片的量的样品溶于8mL超纯水中，离心过滤后用超纯水定容于25mL的容量瓶中，后依据所需测量浓度进行稀释，并进行样品测定（结果如表1）和标准品回收分析（结果如表2），其中回收率为96.0%～101.0%。结果表明该方法对盐酸丁螺环酮的测定效果良好，可用于对盐酸丁螺环酮的定量分析。
表1 药物盐酸丁螺环酮的测定结果
表2 样品回收率
本发明的研究过程如下：
实验方法：以MPI-E型电致化学发光分析系统多功能化学发光检测仪为测试平台（图1），采用电致化学发光三电极系统，在一定扫描电压、扫描速率、光电倍增管负高压、支持电解质条件下，由MPI-E型电致化学发光工作站分别记录Ru(bpy)3 2+发光强度和Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮发光强度，并于室温下采用循环伏安法（CV）对盐酸丁螺环酮进行定量测定，并依据盐酸丁螺环酮发光强度与浓度间的对应关系，绘制其发光强度与浓度的校正曲线，进而实现对盐酸丁螺环酮片的分析测定。
结果与讨论：
1、盐酸丁螺环酮的电化学行为
以金电极为工作电极，采用循环伏安法（CV）考察了1.0×10-5 mol·L-1的盐酸丁螺环酮在pH=7.5的0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4（PBS）中的电化学行为。在电极的电位从0.2V扫向1.25V时，CV曲线上未观察到氧化峰和还原峰；同时没有观察到化学发光，因此盐酸丁螺环酮在金电极上不产生化学发光信号，其发光信号如图2所示。
2、 联吡啶钌与联吡啶钌-盐酸丁螺环酮的电化学行为
在光电倍增管电压850V、扫描速率0.10V·s-1、pH=6.0磷酸盐缓冲溶液条件下，考察了Ru(bpy)3 2+体系和Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮共存体系的电化学行为。图3中分别为Ru(bpy)3 2+体系和Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮共存体系的CV曲线。从图3中曲线可以看出，4.00×10-4mol·L-1 Ru(bpy)3 2+在0.85V~ 1.1V左右出现一个氧化峰，在0.5V~0.75V之间出现一个还原峰；当在原有体系中加入1.00×10-5mol·L-1盐酸丁螺环酮后，形成了Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮共存体系，可以看出电流上升，但氧化峰电位无明显改变，仍在1.1V左右。该现象表明盐酸丁螺环酮对Ru(bpy)3 2+的电化学反应有明显的增敏作用。同时，实验还可以观察到共存体系中仅在0.85V~1.1V左右出现一个特征氧化峰，说明盐酸丁螺环酮和Ru(bpy)3 2+在发生电化学反应前未被氧化，1.1V左右的电流升高为Ru(bpy)3 2+的氧化所致。
3、联吡啶钌与联吡啶钌-盐酸丁螺环酮电化学发光行为
在研究体系电化学行为基础上，进一步考察了检测电位对Ru(bpy)3 2+和Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮共存体系的电化学发光行为的影响（如图4所示）。从图4可以看出，当在Ru(bpy)3 2+体系中加入盐酸丁螺环酮后，体系的电化学发光强度急剧增加，电致化学发光强度由133 a.u.增加至530 a.u.，可见在相同的条件下，盐酸丁螺环酮对Ru(bpy)3 2+的电化学发光具有显著的增强作用，所以可利用盐酸丁螺环酮对Ru(bpy)3 2+的增敏作用实现对盐酸丁螺环酮的准确、高效测定。
4、缓冲体系及pH值
作为电解质，缓冲体系及pH值对测定体系具有重要影响。在光电倍增管电压850V、扫描速率0.10V·s-1、4.00×10-4mol·L-1 Ru(bpy)3 2+、1.00×10-5mol·L-1盐酸丁螺环酮条件下，研究分别考察了硼酸盐缓冲溶液（BBS）和磷酸盐缓冲溶液（PBS）pH值为5.5~8.5时对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮体系的电化学发光的影响（如图5所示）。
由图5可知， 缓冲溶液pH值对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮ECL强度影响显著。其中磷酸盐缓冲溶液pH值为6.0时Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮体系发光强度最佳，而硼酸盐缓冲溶液对应的最佳pH值则为7.5。在参照ECL强度情况下，PBS较BBS对测定盐酸丁螺环酮效果较好，所以选择pH=6.0的磷酸盐缓冲体系。
5、光电倍增管高压的选择
在电致化学发光仪器中，光电倍增管高压是影响其线性范围和灵敏度的重要因素，为了得到更好的灵敏度和较低的噪音，研究分别考察了光电倍增管高压为650V、700V、750V、800V、850V、900V时对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮体系ECL强度的影响（如图6所示）。
由图6可知，当光电倍增管高压由650V增加至900V时，Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮体系ECL强度随着光电倍增管高压的增加而增强，但测定体系的噪音也相应增加，信噪比呈随光电倍增管高压增加先增大后减小趋势；同时，过高电压对仪器的损害较大，所以在参考最佳信噪比、高灵敏度条件下，选择光电倍增管高压为850V。
6、扫描速率的选择
研究分别考察了扫描速率0.01 V·s-1、0.05 V·s-1、0.10 V·s-1、0.15 V·s-1、0.20V·s-1时对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮体系ECL强度的影响。图7表明随着扫描速率的增加，体系对应的ECL强度逐渐增强，当速率达到0.10 V·s-1时，ECL强度较好，继续加快扫描速率对体系ECL强度影响不大，所以最佳扫描速率为0.10 V·s-1。
7、联吡啶钌浓度的选择
试验分别考察了Ru(bpy)3 2+浓度8.00×10-5 mol·L-1、1.00×10-4 mol·L-1、2.00×10-4 mol·L-1、4.00×10-4 mol·L-1、6.00×10-4 mol·L-1、8.00×10-4 mol·L-1、1.00×10-3mol·L-1 时对Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮ECL强度的影响。由图8可知，Ru(bpy)3 2+浓度越高，Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮ECL强度越强，但体系噪音也随之增大，且为节约Ru(bpy)3 2+用量、降低测试成本、减少环境污染和实现最佳信噪比，选择Ru(bpy)3 2+浓度为4.00×10-4 mol·L-1。
8、方法评价
在最佳测定条件下，通过电致化学发光工作站记录不同浓度的盐酸丁螺环酮标准溶液的ECL强度响应曲线，以相对峰高对浓度进行线性回归，结果表明盐酸丁螺环酮浓度在1.00×10-6 mol·L-1～8.00×10-4 mol·L-1范围内与ECL强度呈良好线性关系（R 2=0.9946，n=15），其线性回归方程为：I (counts)=21.185×106 C+519.83（如图9所示），方法检出限为6.2×10-8 mol·L-1 (S/N=3)，与现有测定盐酸丁螺环酮方法相比，电致化学发光法具有较宽的线性范围和较低的检出限。
9、重现性及稳定性
在最优测试条件下，对8.00×10-5 mol·L-1的盐酸钉螺环酮连续测定7次，其ECL强度值的RSD为3.04%（图10），表明电致化学发光测定盐酸丁螺环酮具有很好的重现性及稳定性。
10、共存物质的影响
固定盐酸丁螺环酮摩尔浓度为1.00×10-5 mol·L-1，在试验条件下以测量误差＜5％为标准，考察了共存物质对测定盐酸丁螺环酮的影响。结果表明：1000倍的Ca2+、Mg2+、NO3 -；500倍的 Na+、K+、NH4 +、CO3 2-；300倍的淀粉、果糖均不产生干扰。

Claims (2)

1.一种联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法，其特征在于：使用金电极为工作电极，以MPI-E型电致化学发光工作站为试验平台，采用电致化学发光三电极系统，在扫描电压0.2 V~1.25 V、扫描速率0.1V/s、光电倍增管负高压800 V~900 V、pH值5.5~7.0磷酸盐缓冲溶液为支持电解质条件下，由MPI-E型电致化学发光工作站记录Ru(bpy)3 2+-盐酸丁螺环酮发光强度，并于室温下采用循环伏安法对盐酸丁螺环酮进行定量测定，并依据盐酸丁螺环酮发光强度与浓度间的对应关系，绘制盐酸丁螺环酮发光强度与浓度的校正曲线，并通过线性回归分析，得出一定合理区间内的线性回归方程，同时利用校正曲线，对盐酸丁螺环酮进行含量测定。
2.根据权利要求1所述联吡啶钌体系电致化学发光法测定盐酸丁螺环酮的方法，其特征在于：工作电极的预处理方法为：将金电极用超纯水冲洗干净，用金相砂纸小心打磨，再用0.3mm的Al2O3抛光粉将金电极在鹿皮上打磨抛光至镜面，用水将表面的残留物冲洗干净，将金电极小心装入离心管中用水超声5min后拿出晾干备用；在检测之前再用0.10mol·L-1的硫酸连续测样20次，用于除去电极或检测器中可能残留的杂质。
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