CN108866015A - 一种不使用化学药品低温制备肾脏细胞提取物的新技术 - Google Patents

Abstract

一种不使用化学药品低温制备肾脏细胞提取物的新技术，只采用机械和天然的提取方法从肾脏细胞中提取最大数量酶和多肽，可提取出细胞器内部的酶和多肽，且提取的提取物绝无细菌、病毒、真菌或毒素。提取过程严格按照最新的GMP标准和补充要求执行，忠于患者的安全和疗效。

Description

一种不使用化学药品低温制备肾脏细胞提取物的新技术

技术领域

本发明的技术领域为生物分子制造产业。

背景技术

从活细胞中提取蛋白质，不管是从动物来源还是细菌，都是所有的科学家所面临的一大挑战。理论上讲，似乎提取蛋白质是很简单的事情，实际上也确实如此。然而，如果保证所提取出的蛋白质的数量和价值依然是一大难点。

简单来说，将细胞置于低渗溶液中将导致活细胞膨胀，从而导致细胞膜破裂，释放出细胞质及蛋白质。

发明内容

目前分离细胞蛋白质仍然采用传统途径，所有从组织中提取蛋白质的方案都含有缓冲液或使细胞溶解的化学药品。那些没有用到化学药品的方案很难提取出大量的蛋白质。如果样品为组织样品而不是采自单独的或培养细胞就必须用到蛋白酶。某些方案提到使用声波解降法打破细胞膜和细胞器。声波解降法看来是个完美的方案，但是组织以及采用样品的性质却在声波解降法实施过程中给预期的完美效果制造了不便。大组织样品对声波解降法反应不大，且会遗留组织块残片。

总的来说，从器官内提取蛋白质的存在以下五大难点：

1.时间因素

2.器官的性质

3.添加的化学药品难以清理

4.蛋白质的数量和质量

5.蛋白质的特定性

时间因素：

这是最主要的一个难点。此时间特指从动物被屠宰到提取最终步骤完成之间的时间。提取多肽的质量差异会很大。器官如果立即摘取或-85度冷冻，酶的活性才得以保存而不至被细菌破坏。通常如果摘取不当，器官至多存活6小时。6小时时间看来不短，但一旦关系到组织的处理就显得很短了。冷冻是保持器官存活以及细胞酶和多肽活性的唯一方案。冷冻或保存在特定温度限制以下又是另外一大难题，特别是实验室的管理流程可导致大幅度升温。

器官的性质：

从动物身上摘取器官过程复杂，需保持器官和重要解剖结构的完整性。例如摘取大脑就异常复杂。大脑是个重要的器官，脆弱且结构不分明。它位于颅骨中间，通过脑干连接脊髓，并通过视神经连接眼睛。摘取和保存的过程需同步进行。如此复杂的结构容易在摘取过程中导致大脑的部分活性结构被损坏。同时，摘取过程中大脑组织的脆弱性也是亟需解决的一大难题。

添加的化学药品难以清除：

从细胞中提取蛋白质的环节必须使用化学药品的两个原因：清除器官上的血液以及切断细胞间的结缔组织链。任何器官内都含有一定的血液。不同器官的含血量也各有不同，肝脏，心脏，脾脏中含血量较多，大脑和胸腺含血量相对较少。蛋白质提取环节中无论血液含量多少都需要将它从组织中清除。大多数常用方案使用化学试剂作为裂解缓冲液清除红细胞含量，离心机清除血红蛋白的含量。无论该方案如何精确，裂解缓冲液在溶液中始终留有残余。

切断细胞链促使细胞破裂的裂解缓冲液也有同样的化学药品残留问题。

蛋白质的数量和质量：

大多数人对数量和质量都难以取舍。提取的主要目的就是获得大量的活性蛋白。那么难题又来了，实验室过程的本性会让溶液的温度升高，从而破坏酶或导致蛋白质本性被破坏。因此，所有的操作应在低于10度的环境下进行，否则蛋白质的质量将大打折扣。

我们的中德合作团队在研究从肾脏细胞提取蛋白质的生产中决定正面出击解决所有的难题。以我们的产品“CMDA OE肾脏细胞萃取”为例，研究方向从以下几个因素出发：

1.不使用任何化学药品。

2.蛋白质提取过程中只采用机械或天然的提取方法。

3.以细胞器内的蛋白质和酶为研究目标从而提取最好质量的酶和最大数量的催化剂。

4.严格按照最新的GMP标准和补充要求执行。

5.德国方面严格按照欧盟相关的法律法规执行。

6.我们忠于患者的安全和疗效。

附图说明：

图1：“CMDA OE肾脏细胞萃取”色谱测试结果。

图2：“CMDA OE肾脏细胞萃取”色谱测试结果的数值解释。

具体实施方式：

肾脏器官采自Bio农场，在绵羊幼崽被屠宰后一小时内完成(运输在24小时内进行)。无菌环境中绵羊幼崽被屠宰后，腹壁打开，腹膜在器官摘取过程中一直处于裸露的状态，轻轻地从周围组织中分辨出肾脏器官。初步检查如无明显可见的肿瘤，可分离出肾脏器官并保存在生理盐水中。

1. 30分钟内将肾脏器官送到实验室，开始以下清洗步骤：

a.过滤自来水不间断冲刷两分钟。

b.组织移除在严格消毒的无菌环境下的C房间进行。

c.在容器内用臭氧化的无菌蒸馏水清洗两分钟。

d.把肾脏器官放到100％纯酒精中浸泡5分钟。

e.把肾脏器官放到无菌蒸馏水容器内浸泡3分钟，然后再重复一次。

2.把肾脏器官放到无菌的不锈钢容器内再送入臭氧消毒柜，使组织接触5克/秒的臭氧流5分钟。

3.在无菌操作台把肾脏器官切成小块放入组织切片机的组织盒内。

4.组织切片机的切片盒在-85度冷藏两小时。

5.组织切片机把肾脏组织切成1μ的薄片，然后保存在盛放50cc 100％纯酒精的200ml容器内。

6.每采集到100g即放入生物滤池去除酒精。

7.过滤后的组织放入500ml的玻璃容器内并浸泡在400ml臭氧化的无菌蒸馏水里。

8.装有组织的容器在4℃的冰箱内放置1小时。

9.组织经过声波解降的参数如下：声波解降全程5-15分钟(开启声波解降器35秒后暂停45秒再重复)。容器周围和底部都放置干冰以确保温度在10℃以下。过程中配置恒温器，一旦温度达到10℃，立即中止声波解降。如果温度达到10度，容器移动到冰箱达到温度4℃，然后继续超声处理达到目标时间。

10.声波解降液在4℃热离心机以6000RPM分离45分钟。

11.采集上清液并在300K道尔顿的超滤器中过滤。

12.色谱分析：

i.酸性水解作用后测试蛋白原束缚的氨基酸。

ii.测试蛋白原束缚的氨基酸的过程如下：将1000μl独立样品溶液倒入水解试管，脱水，混入1200μl 6N HCl，在真空(＜20mbar)中熔化，在110℃环境中水解24小时。

iii.水解后样品在真空离心机中脱水，样品稀释缓冲液会带走残渣，然后进行色谱测量。如果仍有少部分残渣，可重复稀释。

13.氨基酸检测：

a.检测仪：氨基酸检测仪LC3000。

b.检测过程：通过阳离子聚合物交换柱分离样品混合物，颗粒大小为4μm(125x4mm ID)，加热水合茚三酮到125℃产生支柱衍生，同时一级氨基酸和亚氨基酸分别在570nm和440nm进行光度检测。

c.样品的体积为20μl(样品环)。数据使用的色谱软件chromstar 6.0记录。

14.检测结果详见图1图2。

Claims (3)

1.使用该技术可从肾脏细胞中提取的最大数量酶和多肽。

2.使用该技术可提取出细胞器内部的酶和多肽。

3.使用该技术提取的提取物绝无细菌、病毒、真菌或毒素。