CN108853520B

CN108853520B - 一种声敏型脂质纳米粒、应用及其制备方法

Info

Publication number: CN108853520B
Application number: CN201810974886.8A
Authority: CN
Inventors: 冉海涛; 郭丹; 汪星月
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2038-08-24
Also published as: CN108853520A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种声敏型脂质纳米粒，由脂质载体、血卟啉单甲醚、全氟溴辛烷及阿霉素组成，其中血卟啉单甲醚、阿霉素所占的重量百分比分别为2.86‑3.69wt％、1.28‑2.05wt％。本发明成功制备了载HMME包裹PFOB及DOX的声敏型脂质纳米粒，实现了LIFU控制释药，联合声动力及化疗增强抑制HepG2细胞生长以及体外CT成像，为后期体内成像与治疗提供了基础。

Description

一种声敏型脂质纳米粒、应用及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种声敏型脂质纳米粒、应用及其制备方法。

背景技术

脂质体作为一种运用广泛的药物载体，具有良好的生物相容性，其双分子层之间可容纳疏水性物质，内部可装载亲水性物质。而脂质纳米粒主要以室温下为固态脂质或少量液态油脂为载体，药物分散或包裹于脂质核中，制成粒径约为10～1000nm的固体胶粒给药体系，形成脂质纳米给药系统。脂质纳米粒具有良好的生物相容性，同时可提高不稳定药物的稳定性，具有缓控释、长效作用。可采用一定比例的液态油或混合脂质为组成部分，克服固体脂质材料结晶度高、载药量低等缺点，实现多种药物的有效包封。脂质纳米粒表面亦可进行不同修饰，如聚乙二醇、靶向多肽等，改善动物体内分布，起到肿瘤靶向及增强药效的作用。

靶向载体可提高药物的靶向特异性，减少常规化疗药物由于对癌细胞没有选择性而导致的副作用。一些小分子多肽具备高特异性、高亲和力等优点，能够靶向并作用于特定的受体，因而可被用作靶头修饰药物载体，如脂质纳米粒、聚合物胶束等，将非特异性的药物靶向输送至特定部位，提高抗癌效果并减少毒副作用。

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，治疗方式以手术治疗为主，但其早期症状无特异性，80％的患者在确诊时已失去手术机会，只能采用非手术治疗。化疗作为一种常用的非手术治疗方式，其毒副作用明显，患者生活质量及医从性均较低。因此，可通过联合化疗和其他非手术治疗方式，减少单一治疗的毒副作用，提高肝癌治疗效果。

声动力治疗(sonodynamic therapy，SDT)是现今研究较为热门的一种治疗方式，指在一定的环境下，超声波与声敏剂相互作用产生活性氧，从而对组织造成损伤。超声波具有高度聚焦、强穿透能力的性质，使其在深部肿瘤治疗中拥有广阔的应用前景。大量研究表明声动力治疗中产生的生物学效应与其频率和强度密切相关，但相关机制仍不明确，需进一步探究。另外，低强度聚焦超声(low intensity focused ultrasound，LIFU)不同于高强度聚焦超声(HIFU)的高温热消融作用，其对于人体几乎无毒副作用，因此低强度聚焦超声与声敏剂结合，可作为一种深部肿瘤治疗的新策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种声敏型脂质纳米粒，以及该纳米粒的制备方法和在生物学上的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种声敏型脂质纳米粒，由脂质载体、血卟啉单甲醚、全氟溴辛烷及阿霉素组成，其中血卟啉单甲醚、阿霉素所占的重量百分比分别为2.86-3.69wt％、1.28-2.05wt％。

本发明技术方案的声敏型脂质纳米粒，血卟啉单甲醚缩写为HMME，全氟溴辛烷缩写为PFOB，阿霉素缩写为DOX，载血卟啉单甲醚包裹全氟溴辛烷及阿霉素的声敏型脂质纳米粒缩写为SNL。本发明以声敏型脂质体为载体，同时将DOX包载在声敏型脂质纳米粒的亲水层，利用低强度聚焦超声(LIFU)作用于声敏剂可产生活性氧，以及活性氧易使不饱和磷脂发生过氧化反应这两个特点，构建了一种活性氧响应型的药物转运系统，成功实现了LIFU促进声敏型脂质纳米粒的药物释放。经研究发现，随着LIFU强度的增强，SNL的释药速度加快，进一步说明了LIFU与声敏剂相互作用产生的活性氧加快了药物释放，实现了LIFU控制释药；通过SNL与LIFU的联合化疗及声动力治疗增强了对HepG2细胞生长的抑制效果，同时研究还发现SNL在体外具有良好的CT成像效果，为后期体内成像与癌症治疗提供了基础。

进一步，其外形呈球状，其粒径为(282.53±6.95)nm，电位为(-45.46±1.22)mV。

进一步，其血卟啉单甲醚、阿霉素的包封率分别为(80.15±15.11)％、(46.47±4.82)％。

进一步，在350-425nm波长范围存在一个吸收波峰。

以上均为本发明声敏型脂质纳米粒的性质及确认。

进一步，所述脂质载体为二月桂酰基卵磷脂。

本发明的另一个技术方案，声敏型脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

A、精密称取1份二月桂酰基卵磷脂，4份二棕榈酸磷脂酰胆碱，2份二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油，1.5份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，1.5份胆固醇和1份血卟啉单甲醚于圆底烧瓶中，避光条件下，加入三氯甲烷与甲醇充分溶解；

B、将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪上减压蒸发，形成一均匀的暗红色薄膜；

C、精密称取1份盐酸阿霉素溶解于4份磷酸盐缓冲液中，待充分溶解后加入到上述圆底烧瓶中；

D、将圆底烧瓶置于水浴锅中缓慢摇晃，直至暗红色薄膜完全洗脱成暗红色悬液；

E、将悬液移至10mL EP管中，再加入0.2份全氟辛烷基溴化物后，用高速均质机乳化5min，采用12000r/min的转速，间隔5s，得暗红色乳液；

F、离心乳液，弃上清液，用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，清洗3次后制得载血卟啉单甲醚包裹全氟溴辛烷及阿霉素的声敏型脂质纳米粒。

进一步，所述步骤D中，水浴锅的温度为40℃。

进一步，所述步骤F中，离心转速为5000r/min，离心时间为5min。

本发明声敏型脂质纳米粒的制备方法，以二月桂酰基卵磷脂作为原料，采用薄膜水化法，制备载有血卟啉单甲醚包裹全氟溴辛烷及阿霉素的声敏型脂质纳米粒(SNL)。采用普通光学显微镜、透射电子显微镜、透射电子显微镜、马尔文激光粒径仪、紫外分光光度计等仪器对SNL的粒径、电位、表面形态等进行检测；通过高效液相色谱法检测SNL中HMME和DOX的包封率；成功制备出球形、形态规则，大小均匀，性质稳定的声敏型脂质纳米粒(SNL)。该纳米粒载药量较高，联合低强度聚焦超声(LIFU)，能够控制产生活性氧、释放药物，具有良好的抑制HepG2细胞生长的能力，同时具有良好的CT成像效果。

本发明的另一个技术方案是提供所述声敏型脂质纳米粒(SNL)在生物学上的应用。通过声敏型脂质纳米粒(SNL)联合低强度聚焦超声(LIFU)，探究其对HepG2细胞增殖的影响，以及探究SNL在体外CT成像的效果。经研究发现，SNL与LIFU联合达到了增强对HepG2细胞生长抑制的效果；同时还发现SNL在体外具有良好的CT成像效果，可用CT监测SNL在肝脏癌灶的聚集情况，实现诊疗一体化。

附图说明

图1为本发明实施例中声敏型脂质纳米粒(SNL)的显微镜图、紫外吸光光谱图、粒径分布图及电位分布图；

图2为本发明实施例中不同HMME浓度的SNL体外活性氧检测(n＝3)；

图3为本发明实施例中SNL体外释放药物生成曲线(n＝3)；

图4为本发明实施例中SNL细胞内活性氧激光共聚焦及流式检测结果图；

图5为本发明实施例中不同HMME浓度的SNL细胞内活性氧激光共聚焦及流式检测结果图；

图6为本发明实施例中NL细胞毒性检测(n＝5)；

图7为本发明实施例中SNL细胞毒性检测(n＝4)；

图8为本发明实施例中SNL体外CT成像观察图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例基本如附图1至图8所示：

一、本发明的声敏型脂质纳米粒的制备方法，具体步骤如下：

A、精密称取1mg二月桂酰基卵磷脂，4mg二棕榈酸磷脂酰胆碱，2mg二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油，1.5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，1.5mg胆固醇和1mg血卟啉单甲醚(HMME)于圆底烧瓶中，避光条件下，加入适量三氯甲烷与甲醇充分溶解；

B、将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪上减压蒸发1h，形成一均匀的暗红色薄膜；

C、精密称取1mg盐酸阿霉素(DOX)溶解于4mg磷酸盐缓冲液(PBS)中，待充分溶解后加入到上述圆底烧瓶中；

D、将圆底烧瓶置于40℃水浴锅中缓慢摇晃，直至暗红色薄膜完全洗脱成暗红色悬液；

E、将悬液移至10mL EP管中，再加入0.2mg全氟辛烷基溴化物(PFOB)后，用高速均质机乳化5min，采用12000r/min的转速，间隔5s，得暗红色乳液；

F、离心乳液(5000r/min，5min)，弃上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀，清洗3次后制得载血卟啉单甲醚包裹全氟溴辛烷及阿霉素的声敏型脂质纳米粒(SNL)。

用上述相同的方法制备只包裹DOX或HMME以及两者均未包裹的载PFOB的脂质纳米粒(DNL，HNL，NL)和包裹DOX及HMME未载PFOB的脂质纳米粒。将上述所有制备的纳米粒置于4℃储存备用。

二、声敏型脂质纳米粒(SNL)的一般特性、血卟啉单甲醚与阿霉素的包封率、产生活性氧的能力及体外释药。

1、声敏型脂质纳米粒(SNL)的一般特性：

(1)采用普通光学显微镜和透射电子显微镜观察SNL的形貌，透射电子显微镜观察LIFU处理后SNL的形貌；

(2)马尔文激光粒径仪检测SNL的粒径和电位；

(3)紫外分光光度计检测DOX、HMME、NL、SNL和snl(snl为SNL破裂离心后的上清液)的吸光光谱。

检测结果为：

(1)如图1A1所示，光学显微镜下，SNL呈点状，大小均匀，分散无粘连；如图1A2所示，透射电子显微镜显示SNL呈球形；LIFU处理后透射电子显微镜观察到SNL仍为球形，但密度变浅，可能与SNL中包载的物质释放出来有关。

(2)如图1C、图1D所示，马尔文激光粒径仪测得SNL的粒径为(282.53±6.95)nm，电位为(-45.46±1.22)mV。

(3)如图1B所示，紫外吸光图谱中，NL呈一平滑曲线，未见明显吸收峰，DOX在480nm处见一较小吸收峰，HMME和SNL均在390nm处见明显的吸收峰，可证明SNL中包裹了HMME。snl中在480nm处及其附近出现光密度值轻微增高。

2、声敏型脂质纳米粒(SNL)中血卟啉单甲醚与阿霉素的包封率：

采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)检测声敏型脂质纳米粒(SNL)中血卟啉单甲醚(HMME)与阿霉素(DOX)的包封率，并通过用以下公式计算包封率：

HMME包封率＝C_Hm/C_Ht×100％；DOX包封率＝C_Dm/C_Dt×100％；

C_Hm、C_Dm分别表示包载于脂质纳米粒中的HMME和DOX的含量，C_Ht、C_Dt分别表示HMME和DOX的总量。

检测结果为：

SNL中DOX和HMME的包封率分别为(80.15±15.11)％、(46.47±4.82)％，两者的包封率均较高。

3、声敏型脂质纳米粒(SNL)产生活性氧的能力：

(1)声敏型脂质纳米粒(SNL)产生活性氧

将SNL稀释为不同HMME浓度(1.25、2.5、5、10、20、40μg/mL)的悬液，各浓度分别取1mL与10μL DPBF(100μg/mL)混合均匀，用LIFU(0.2W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)处理该混合溶液。另取1mL HMME浓度为10μg/mL的SNL悬液与10μL DPBF混合均匀，用LIFU(0.4W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)处理。以DNL与DPBF的混合溶液作对照组，每组设3个平行组，荧光分光光度计检测每组剩余DPBF的荧光强度。用以下公式计算产生活性氧的相对量：

产生活性氧的相对量＝(FIc-FIi)/FIc×100％；FIc为对照组的荧光强度，FIi为各实验组的荧光强度。

检测结果为：

如图2所示，SNL在LIFU(650KHz，0.2w/cm²，脉冲：2s，1min)处理后，产生活性氧的相对量随HMME浓度增加而增加，且各浓度组间两两比较，产生活性氧的相对量差异有统计学意义(F＝172.558，P<0.05)，可见SNL产生活性氧呈HMME浓度依赖性。LIFU强度为0.4W/cm²时，产生活性氧的相对量为(63.93±1.83)％，较LIFU为0.2W/cm²时的(55.56±2.32)％高，差异有统计学意义(P<0.05)，可见SNL产生活性氧也呈LIFU强度依赖性。

(2)声敏型脂质纳米粒(SNL)细胞内活性氧检测

将细胞接种在激光共聚焦皿中，分为3组：①SNL组，②SNL+LIFU(0.2W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)组，③SNL+LIFU(0.4W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)组。以DCFH-DA为活性氧探针，将各组置于激光共聚焦显微镜下观察。再通过流式细胞计数仪检测不同组中绿色荧光的强度。用上述相似的方法观察不同HMME浓度的SNL产生活性氧的情况。

检测结果为：

活性氧探针DCFH-DA本身无荧光，可以穿过细胞膜，进入细胞内被酯酶水解产生水溶性DCFH，DCFH可被细胞内的活性氧氧化为DCF，而DCF能产生绿色荧光。实验结果显示，SNL组几乎未见绿色荧光，SNL+LIFU(0.2W/cm²)组绿色荧光较强，SNL+LIFU(0.4W/cm²)组绿色荧光强于前两组(如图4所示，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)，DCFH-DA标记活性氧(绿色荧光)，merged为复合图)。可见在无LIFU作用时，几乎无活性氧产生，当LIFU强度增强，产生的活性氧增多，该结果与之前的实验结果一致。同样，不同HMME浓度的SNL与HepG2细胞共孵育后，经LIFU处理，产生的绿色荧光随着HMME浓度增加而增加(如图5所示，DAPI标记细胞核(蓝色荧光)，DCFH-DA标记活性氧(绿色荧光)，merged为复合图)，进一步证明SNL产生活性氧呈LIFU强度及HMME浓度依赖性。流式细胞计数结果与激光共聚焦显微镜观察结果一致。

4、声敏型脂质纳米粒(SNL)体外释药：

将刚制备好的SNL稀释到一定浓度后分为等体积的A、B两组，再将两组置于37℃恒温摇床中，于1h后离心各取1mL上清液用高效液相色谱法检测其中DOX和HMME的含量(D1，H1)，取出1mL上清液后各组均补充1mL PBS重新混合均匀，再予以A组LIFU(0.2W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)处理，后将两组置于37℃恒温摇床中，相同方法于2h后取上清液检测其中DOX和HMME的含量(D2，H2)，2h后给予B组LIFU(0.4W/cm²，脉冲2s，1min)处理，再置于37℃恒温摇床中。以相同的方法于3、4、5、6、7、8h后取两组上清检测DOX和HMME的含量(D3、H3、D4、H4、D5、H5、D6、H6、D7、H7、D8、H8)。用以下公式计算DOX和HMME的累计释放量：

累积释放DOX百分比=

累积释放

Dn、Hn分别为各时间点测得的DOX和HMME的浓度，WD、WH分别表示为稀释后的SNL中DOX和HMME的总量。

检测结果为：

如图3所示，A组经LIFU处理2h时出现明显的释药，1h内释药量DOX达31.75％，HMME为24.82％；B组在未经过LIFU处理2h后，DOX的释药量未超过10％，HMME的释药量均未超过5％；而B组在经过较高强度LIFU(0.4W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)处理后，3h时可见B组DOX在1h内释药量为46.06％，HMME为32.13％，B组第3h的释药量较A组第2h的释药量多，说明较高强度的LIFU可加快释药。从之前SNL产生活性氧的实验中可知，较高强度的LIFU可使SNL产生更多活性氧，可能是因为更多的活性氧加快了磷脂过氧化，使磷脂膜更不稳定，加快了药物释放，可间接证明该药物递送体系的释药过程与SNL的声敏性相关。8h后A、B两组的DOX累积释药量分别达到(83.45±2.97)％、(79.42±4.36)％，HMME的释药量分别为(45.54±3.48)％、(47.37±5.60)％，可见在LIFU作用下，SNL可加快药物释放，但由于HMME的水溶性较差，使其释药量较DOX慢。

三、声敏型脂质纳米粒(SNL)在生物学上的应用

1、声敏型脂质纳米粒(SNL)在抑制HepG2细胞生长方面的应用

采用CCK-8实验检测不同分组中HepG2细胞的存活率，设为：①LIFU组，②DOX组，③DNL组，④HNL组，⑤HNL+LIFU组，⑥SNL组，⑦SNL+LIFU组，每组4个复孔。其中HMME浓度分别为20、10、5、2.5、1.25μg/mL，DOX浓度分别为20、10、5、2.5、1.25μg/mL，SNL中的HMME和DOX浓度相同，孵育6h后，LIFU(0.4W/cm²，650kHz，脉冲2s，1min)处理，再孵育18h，PBS清洗3次，每孔加入100μL 10％CCK-8，孵育一定时间后，用酶标仪测450nm处的光密度值。用以下公式计算细胞存活率，同时采用SPSS软件计算各组的IC50。

细胞存活率＝[D(450)加药-D(450)空白]/[D(450)对照组-D(450)空白]×100％

检测结果为：

将NL与HepG2细胞共孵育24h，发现磷脂浓度在0.52083～200μg/mL之间HepG2细胞的存活率均高于85％，差异无统计学意义(F＝0.719，P>0.05，如图6所示)，可见磷脂浓度从0.52083～200μg/mL的NL几乎无毒性。LIFU组HepG2细胞的存活率为(92.85±2.36)％，可认为LIFU对细胞生长几乎无影响；在相同HMME或DOX浓度条件下，DNL组较DOX组的细胞存活率高，差异有统计学意义(P<0.05)，该结果可能与脂质纳米粒可以减缓药物释放有关；HNL+LIFU组的存活率较HNL组低，差异有统计学意义(P<0.05)，可见单独的HNL对细胞生长几乎无影响，而在联合LIFU后，明显抑制了细胞的生长；同样，SNL+LIFU组较SNL组的细胞存活率低，差异有统计学意义(P<0.05)；SNL+LIFU组的细胞存活率较HNL+LIFU组、DNL和DOX组均低，差异有统计学意义(P<0.05)，各组的IC50分别为，DOX：0.624μg/mL，DNL：0.894μg/mL，HNL+LIFU：5.357μg/mL，SNL：2.32μg/mL，SNL+LIFU：0.571μg/mL，其中SNL+LIFU组的IC50最低，可见SNL+LIFU组联合声动力治疗和化疗明显增强了对HepG2细胞的生长抑制作用。而在不同浓度间，相同处理组中细胞存活率存在明显的浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05，如图7所示)。

2、声敏型脂质纳米粒(SNL)的体外CT成像

将SNL配成不同PFOB浓度(386，193，96.5，48.25，24.125，12.0625)mg/mL的悬液，以未包裹PFOB的SNL为对照组，其中磷脂的浓度与包裹PFOB浓度中最高的SNL的磷脂浓度一致，以PBS为空白组，行CT扫描。CT参数设置：16排，100kV，44mA，层厚0.29mm。

检测结果为：

如图8A所示的不同PFOB浓度的SNL体外成像图，其中：a：PFOB浓度为386mg/ml，b：PFOB浓度为193mg/ml，c：PFOB浓度为96.5mg/ml，d：PFOB浓度为48.25mg/ml，e：PFOB浓度为24.125mg/ml，f：PFOB浓度为12.0625mg/ml，g：对照组，h：空白组，由此可知，随着PFOB浓度的降低，CT成像密度逐渐降低，对照组及空白组的密度明显低于其他组。同时，通过PFOB浓度-CT值曲线可见SNL的CT值跟PFOB浓度具有良好的相关性如图8B所示的PFOB浓度-CT值曲线图，具体CT值见表1。

表1不同PFOB浓度SNL体外CT值

PFOB浓度(mg/ml)	CT值(Hu)
		386	523.1±26.45
193	252.65±24.68
		96.5	129.8±5.66
48.25	58.4±3.82
		24.125	26.1±3.68
12.0625	6.95±6.86
		对照组	-5.6±1.27
空白组	-10.1±2.67

注：采用方差分析进行统计分析，各组间两两比较均有统计学差异，F＝381.845，P<0.05。

Claims

1.一种声敏型脂质纳米粒，其特征在于：由脂质载体、血卟啉单甲醚、全氟溴辛烷及阿霉素组成，其中血卟啉单甲醚、阿霉素所占的重量百分比分别为2.86-3.69wt%、1.28-2.05wt%，纳米粒外形呈球状，其粒径为（282.53±6.95）nm，电位为（-45.46±1.22）mV；血卟啉单甲醚、阿霉素的包封率分别为（80.15±15.11）%、（46.47±4.82）%;

声敏型脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

E、将悬液移至10mL EP管中，再加入0.2份全氟溴辛烷后，用高速均质机乳化5min，采用12000r/min的转速，间隔5s，得暗红色乳液；所述份数为重量份数；

2.根据权利要求1所述的一种声敏型脂质纳米粒，其特征在于：在350-425nm波长范围存在一个吸收波峰。

3.根据权利要求2所述的一种声敏型脂质纳米粒，其特征在于：所述步骤D中，水浴锅的温度为40℃。

4.根据权利要求3所述的一种声敏型脂质纳米粒，其特征在于：所述步骤F中，离心转速为5000r/min，离心时间为5min。