CN108853054A - 一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法 - Google Patents

一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，在一个示例中，其包括活性组分、添加剂和去离子水；所述活性组分包括藤黄酸；所述添加剂包括脂质、环肽、表面活性剂、等渗调节剂和pH调节剂。本发明还公开了环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体的制备方法，该方法制备的载体不但粒径较小且均一，包封率高，而且肿瘤靶向性强，肿瘤组织穿透性强，抗肿瘤效果好。

Description

一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，尤其涉及一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法。
背景技术
藤黄(Gamboge)为藤黄科植物藤黄树Garcinia hanbaryi Hook.f.分泌的干燥树脂。藤黄性寒，味酸、辛、涩，有毒，具破血散结、解毒、止血、杀虫之功效，自古以来就被用于治疗瘰疬、痈疸、疖肿等顽疾。藤黄酸(gambogic acid，GA)是藤黄的有效成分之一，现代药理研究报道GA对多种肿瘤细胞有潜在抑制作用，包括从白血病病人中提取的肿瘤细胞，及子宫颈癌、胆管癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胶质母细胞瘤和骨肉瘤细胞。然而，由于藤黄酸水溶性极差(小于1μg/mL)，刺激性强、体内消除半衰期短，限制了其在临床上的应用。目前临床使用的藤黄酸常以注射剂为主，在藤黄酸原料药中加入L-精氨酸、葡甲胺、赖氨酸等助溶剂或者聚氧乙烯蓖麻油、聚山梨酯等增溶剂可显著改善其溶解度和稳定性，适用于各种剂型的开发。但是长期使用这些助溶剂、增溶剂，可能引起过敏、心血管毒性、肾毒性、神经毒性等一系列不良反应。因此，藤黄酸新剂型的研究是开发藤黄酸类抗癌药所面临的新课题。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有制剂肿瘤靶向性和肿瘤组织渗透性差的问题，提供了一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法。该方法制备的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体具有肿瘤靶向性强，肿瘤组织穿透性好，抗肿瘤效果好的优势。
为实现发明目的，本发明所采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，
包括活性组分、添加剂和去离子水；
所述活性组分包括藤黄酸；
所述添加剂包括脂质、环肽、表面活性剂、等渗调节剂和pH调节剂。
优选地，藤黄酸的含量为0.001wt％-2wt％、脂质的含量为0.01wt％-5wt％、环肽的含量为0.001wt％-2wt％、表面活性剂的含量为0.1wt％-20wt％、等渗调节剂的含量为0.1wt％-10wt％、pH调节剂的含量为0.1wt％-10wt％、去离子水的含量为80wt％-90wt％。
优选地，所述脂质为硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、中链甘油三酯、山嵛酸甘油酯和胆固醇中的一种或多种。
优选地，所述环肽为cRGDfK和/或E-[c(RGDfK)2]。
优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卖泽52、吐温80和司盘80中的一种或多种。
优选地，所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇和山梨醇中的一种或多种。
优选地，所述pH调节剂为磷酸盐缓冲液和/或枸橼酸钠。
第二方面，本发明提供了一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体的制备方法，用于制备如第一方面所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，包括以下步骤：
将表面活性剂和等渗调节剂加入去离子水中，得到水相；
将藤黄酸、脂质溶于有机溶剂，得到有机相；
将所述水相和所述有机相混合，加热去掉有机溶剂，于4℃下冷却，得到藤黄酸纳米结构脂质载体GA-NLC溶液；
将N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺溶解在pH调节剂中，并加入到所述GA-NLC溶液中；
添加环肽，超滤离心后，得到环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体。
优选地，所述有机溶剂为无水乙醇和/或氯仿。
优选地，调节GA-NLC溶液的pH值为5-9。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明的制得的藤黄酸纳米结构脂质载体粒径较小且均一，包封率高，肿瘤靶向性强，肿瘤组织穿透性强，抗肿瘤效果好。
附图说明
下面通过附图和实施例，对本发明实施例的技术方案做进一步详细描述。
图1为本发明提供的藤黄酸纳米结构脂质载体的制备方法流程示意图；
图2(a)为实施例2制备的GA-NLC的粒径分布图；
图2(b)为实施例2制备的cRGDfK-GA-NLC的粒径分布图；
图2(c)为实施例2制备的E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC的粒径分布图；
图3(a)为实施例2制备的GA-NLC的电位分布图；
图3(b)为实施例2制备的cRGDfK-GA-NLC的电位分布图；
图3(c)为实施例2制备的E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC的电位分布图；
图4为各组Cou-6制剂在4T1细胞内的荧光值；
图5为Cou-6制剂在4T1细胞内的摄入情况(×20倍)；
图6为细胞接种后(第0-10天)和治疗过程(第10-20天)的肿瘤体积变化；
图7为肽修饰的GA-NLC在荷瘤小鼠中的生物分布研究；
图8(a)为不同制剂组的器官和肿瘤的IVIS图像；
图8(b)为24h时肿瘤和肝脏中的荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明，但并不意于限制本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，包括活性组分、添加剂和去离子水；所述活性组分包括藤黄酸；所述添加剂包括脂质、环肽、表面活性剂、等渗调节剂和pH调节剂。
在一个示例中，其各组分的含量，具体为：
藤黄酸的含量为0.001wt％-2wt％、脂质的含量为0.01wt％-5wt％、环肽的含量为0.001wt％-2wt％、表面活性剂的含量为0.1wt％-20wt％、等渗调节剂的含量为0.1wt％-10wt％、pH调节剂的含量为0.1wt％-10wt％、去离子水的含量为80wt％-90wt％。
优选地，所述pH调节剂为磷酸盐缓冲液和/或枸橼酸钠。
针对该藤黄酸纳米结构脂质载体提供了其制备方法，如图1所示，所述制备方法包括：
S100,将表面活性剂和等渗调节剂加入去离子水中，得到水相。
优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卖泽52、吐温80和司盘80中的一种或多种。
优选地，所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇和山梨醇中的一种或多种。
S110，将藤黄酸、脂质溶于有机溶剂，得到有机相。
优选地，所述脂质为硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、中链甘油三酯、山嵛酸甘油酯和胆固醇中的一种或多种。
S120，将所述水相和所述有机相混合，加热去掉有机溶剂，于4℃下冷却，得到藤黄酸纳米结构脂质载体(GA-NLC)溶液。
优选地，所述有机溶剂为无水乙醇和/或氯仿。
S130，将N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺溶解在pH调节剂中，并加入到所述GA-NLC溶液中。
优选地，调节GA-NLC溶液的pH值为5-9。
S140，添加环肽，超滤离心后，得到环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体。
优选地，所述环肽为cRGDfK和/或E-[c(RGDfK)2]。
下面实施例2-4依据实施例1提供的制备方法，进行制备环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体过程的详细说明。
实施例2
将6g的卖泽52，溶于100mL去离子水中，74℃-75℃水浴中磁力搅拌溶解，作为水相；将1g大豆卵磷脂、0.1g藤黄酸溶于2mL无水乙醇中，1g山嵛酸甘油酯和0.5g中链甘油三酯溶于20mL氯仿中，同时将1g二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基溶于1mL氯仿中，将乙醇溶液在74℃-75℃水浴中与氯仿溶液混合均匀，作为有机相。74℃-75℃水浴中将有机相快速加入到水相中，磁力搅拌，挥发有机溶剂及部分水，4℃冷却2h，即得GA-NLC溶液。
将10mg的N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺溶解在10mL的磷酸盐缓冲液中，并加入到30mL的GA-NLC中，搅拌0.5-2h。分别将10mL的肽(cRGDfK和E-[c(RGDfK)2])加入到GA-NLC中，同时缓慢搅拌10-20h，超滤离心后，得到环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体。
由图2(a)-图2(c)和图3(a)-图3(c)可以看出，本发明的制得的藤黄酸纳米结构脂质载体粒径较小且均一，包封率高。
实施例3：
将6g的卖泽52，溶于100mL去离子水中，74℃-75℃水浴中磁力搅拌溶解，作为水相；将2g大豆卵磷脂、0.1g藤黄酸溶于2mL无水乙醇中，1g山嵛酸甘油酯和0.5g中链甘油三酯溶于20mL氯仿中，同时将1g二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基溶于1mL氯仿中，将乙醇溶液在74℃-75℃水浴中与氯仿溶液混合均匀，作为有机相。74℃-75℃水浴中将有机相快速加入到水相中，磁力搅拌，挥发有机溶剂及部分水，4℃冷却2h，即得GA-NLC溶液。
将10mg的N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺溶解在10mL的磷酸盐缓冲液中，并加入到30mL的GA-NLC中，搅拌0.5-2h。分别将10mL的肽(cRGDfk和E-[c(RGDfK)2])加入到GA-NLC中，同时缓慢搅拌10-20h，超滤离心后，得到环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体。
实施例4：
将6g的卖泽52，溶于100mL去离子水中，74℃-75℃水浴中磁力搅拌溶解，作为水相；将4g大豆卵磷脂、0.1g藤黄酸溶于2mL无水乙醇中，1g山嵛酸甘油酯和0.5g中链甘油三酯溶于20mL氯仿中，同时将1g二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基溶于1mL氯仿中，将乙醇溶液在74℃-75℃水浴中与氯仿溶液混合均匀，作为有机相。74℃-75℃水浴中将有机相快速加入到水相中，磁力搅拌，挥发有机溶剂及部分水，4℃冷却2h，即得GA-NLC溶液。
将10mg的N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺溶解在10mL的磷酸盐缓冲液中，并加入到30mL的GA-NLC中，搅拌0.5-2h。分别将10mL的肽(cRGDfk和E-[c(RGDfK)2])加入到GA-NLC中，同时缓慢搅拌10-20h，超滤离心后，得到环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体。
为了进一步了解药物，发明人还对本发明药物多肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体(实施例2制备的样品)进行了细胞摄入试验、抗肿瘤活性及肿瘤靶向性研究，方法和结果如下：
1.细胞摄入试验
本试验用4T1细胞为试验对象，测定香豆素-6纳米粒在细胞内的荧光强度。
将香豆素-6溶液(Cou-6-Sol)、Cou-6-NLC、cRGDfK-Cou-6-NLC、E-[c(RGDfK)2]-Cou-6-NLC稀释至最大无毒剂量后，加药于4T1细胞，每孔100μL，n＝3。分别于加药孵育1h、2h、4h、12h后，每孔加入100μL冰PBS液终止摄取，再用磷酸缓冲盐溶液清洗2-3次。加入4％多聚甲醛固定20min，再用PBS每隔5min清洗1次，清洗2-3次。每孔加入0.20μg/mL的DAPI稀释液20μL，10min后用PBS液清洗2-3次，最后在每孔中加入150μL PBS液，整个过程避光操作。利用高内涵成像系统(GE InCell Analyzer 2000)对细胞摄取进行定性定量的分析。
表1多肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体细胞摄入
结果表明：根据香豆素-6标记的各组制剂及溶液对4T1细胞的细胞毒性作用以及香豆素-6在细胞内的荧光强度，选择0.002μg/mL的浓度作为细胞摄入的给药浓度。图4为香豆素-6标记的制剂和溶液在4T1细胞中的摄入情况。由图4可知，在4T1细胞中，随着孵育时间的延长，各组细胞内的香豆素-6的荧光强度逐渐增强，并在12h达到了最大值。在1h、2h、4h、12h，两组多肽修饰的纳米粒的摄入量均大于未修饰的纳米粒和溶液，其中，E-[c(RGDfK)2]-Cou-6-NLC组的荧光强度强于cRGDfK-Cou-6-NLC组，即4T1细胞摄入：E-[c(RGDfK)2]-Cou-6-NLC>cRGDfK-Cou-6-NLC>Cou-6-NLC>Cou-6-Sol。在图5中，蓝色部分为DAPI染色的细胞核，绿色荧光部分为进入细胞后香豆素-6分布的细胞质，肉眼即可清楚地看到，随着孵育时间的延长，各组细胞内的香豆素-6的荧光强度逐渐增强，具有时间依赖性。
2.抗肿瘤活性研究
收集指数生长期小鼠乳腺腺癌4T1-Luc细胞并重悬于DMEM培养基中，离心并洗涤3次以除去血清。用DMEM将细胞浓度调节至2×106个细胞/mL。用酒精棉擦拭裸鼠的右侧腋下，并使用1mL注射器接种细胞悬液(0.1mL/小鼠)。当肿瘤体积增长到100mm3(肿瘤体积V＝ab2/2；a：肿瘤长度，b：肿瘤宽度)时，将小鼠随机分组。
将裸鼠随机分为模型组、阳性药物组(顺铂)、GA溶液组、GA-NLC组、cRGDfK-GA-NLC组和E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC组。每组6只，共36只。模型组每天尾静脉注射生理盐水100μL。阳性药物组尾静脉注射顺铂(1mg/kg)，其余组尾静脉注射GA溶液，GA-NLC，cRGDfK-GA-NLC和E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC(GA：1.35mg/kg)。100μL/只，每2天一次，共7次。
当肿瘤长至体积为100mm3时，以150mg/kg注射荧光素酶底物并计时。立即给予4％水合氯醛以麻醉动物并进行体内成像。注射荧光素酶底物后，实时成像时间为10±1min。在第二天开始给药。期间观察裸鼠饮食、活动情况、精神状态和死亡情况等一般情况，并使用游标卡尺测量肿瘤大小，使用电子秤称量裸鼠体重。在完成最后一次给药的24h后，注射萤光素酶底物(150mg/kg，4％水合氯醛)并在麻醉后进行体内成像实验。
在接种4T1-Luc细胞的BALB/c-nu裸鼠中评估体内抗肿瘤活性研究。通过测量给药后肿瘤体积的变化来确定肿瘤抑制潜力。如图6所示，与对照组相比，阳性对照组(顺铂)，GA-NLC和肽修饰的GA-NLC组中的肿瘤体积生长受到明显抑制(p<0.05)，且E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC组显示出最强的抗肿瘤作用。
3.肿瘤靶向性研究
在本研究中，小动物活体成像系统(IVIS)用于评价肽修饰的NLC在携带4T1肿瘤的BALB/c-裸鼠中的体内生物分布和靶向效率。选择DiR作为荧光探针，因为它的NIR激发和发射波长可以有效降低动物自体荧光的干扰。相比之下，游离的DiR溶液在静脉内给药后由于快速清除和非特异性分布而在一段时间内在肿瘤部位没有药物累积(如图7所示)。游离DiR组中的荧光主要集中在整个成像周期。一般而言，所有NLC组的肿瘤部位都观察到强荧光强度，这归因于通过实体瘤的高通透性和滞留效应在肿瘤组织中累积的NLC。此外，肿瘤部位的荧光信号在24h时最高，并且多肽修饰组(cRGDfK-GA-NLC和E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC)的荧光强度明显强于NLC组(GA-NLC)。因此，有人提出，cRGDfK肽修饰的NLC可以促进抗肿瘤药物向肿瘤中的递送，并长期保留在肿瘤中，这会增强抗肿瘤效果，这可能是由于cRGDfK对αvβ3受体的高亲和力，它在大多数癌细胞表面过表达。
为了清楚地观察荧光信号，在注射后24h切除肿瘤和主要器官并收集。图8为解剖器官和肿瘤的离体荧光成像，显示了尾静脉注射DiR制剂后离体器官和肿瘤的成像。如图8所示，图8(a)为不同制剂组的器官和肿瘤的IVIS图像；图8(b)为24h时肿瘤和肝脏中的荧光强度，其中，A为DiR-Sol，B为DiR-NLC，C为cRGDfK-DiR-NLC，D为E-[c(RGDfK)2]-DiR-NLC，从图中可以看出，DiR-Sol组在肿瘤中没有荧光信号。然而，在NLC组中观察到肿瘤中的强信号。通过使用感兴趣区域(ROI)功能测量的肿瘤位点处的DiR的荧光强度显示，给药E-[c(RGDfK)2]-GA-NLC组中的肿瘤中DiR的积累高于cRGDfK-GA-NLC和GA-NLC。在心、肺、脾和肾脏中未观察到明显的荧光摄取。然而，DiR在所有组中均显著积聚在肝中。此外，NLC制剂中的相对荧光强度(肿瘤平均信号/肝脏平均信号)没有明显的差异。
本发明提供的方法制备的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体不但粒径较小且均一，包封率高，而且肿瘤靶向性强，肿瘤组织穿透性强，抗肿瘤效果好。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，包括活性组分、添加剂和去离子水；
所述活性组分包括藤黄酸；
所述添加剂包括脂质、环肽、表面活性剂、等渗调节剂和pH调节剂。
2.根据权利要求1所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，所述藤黄酸的含量为0.001wt％-2wt％、脂质的含量为0.01wt％-5wt％、环肽的含量为0.001wt％-2wt％、表面活性剂的含量为0.1wt％-20wt％、等渗调节剂的含量为0.1wt％-10wt％、pH调节剂的含量为0.1wt％-10wt％、去离子水的含量为80wt％-90wt％。
3.根据权利要求1所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，所述脂质为硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、中链甘油三酯、山嵛酸甘油酯和胆固醇中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，所述环肽为cRGDfK和/或E-[c(RGDfK)2]。
5.根据权利要求1所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，所述表面活性剂为泊洛沙姆、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、卖泽52、吐温80和司盘80中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇和山梨醇中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，其特征在于，所述pH调节剂为磷酸盐缓冲液和/或枸橼酸钠。
8.一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法用于制备如权利要求1-7任一权利要求所述的环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体，包括以下步骤：
将表面活性剂和等渗调节剂加入去离子水中，得到水相；
将藤黄酸、脂质溶于有机溶剂，得到有机相；
将所述水相和所述有机相混合，加热去掉有机溶剂，于4℃下冷却，得到藤黄酸纳米结构脂质载体GA-NLC溶液；
将N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳酰胺/羟基琥珀酰亚胺溶解在pH调节剂中，并加入到所述GA-NLC溶液中；
添加环肽，超滤离心后，得到环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水乙醇和/或氯仿。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，调节GA-NLC溶液的pH值为5-9。
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