CN112206323A - USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用 - Google Patents

USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112206323A
CN112206323A CN201910620293.6A CN201910620293A CN112206323A CN 112206323 A CN112206323 A CN 112206323A CN 201910620293 A CN201910620293 A CN 201910620293A CN 112206323 A CN112206323 A CN 112206323A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sox2
usp9x
cells
nga
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910620293.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112206323B (zh
Inventor
吴英理
顾文莉
陈香云
雷虎
徐含章
张星明
秦东军
杨物鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN201910620293.6A priority Critical patent/CN112206323B/zh
Publication of CN112206323A publication Critical patent/CN112206323A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112206323B publication Critical patent/CN112206323B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。通过发现在骨肉瘤中降低USP9x的表达或抑制其活性，可以有效的促进促增殖因子SOX2的降解，为临床上开发新的针对骨肉瘤的化疗药物提供了新的靶点，同时，我们研究也发现NGA可以有效的抑制USP9x的去泛素化酶活性，从而间接促进SOX2的泛素化降解，抑制肿瘤的发生与发展，这也就为临床发现新的药物提供的新的分子结构。

Description

USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，更具体地讲，涉及USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
背景技术
骨肉瘤(Osteosarcoma)与肉瘤一样，是来源于间充质的一种恶性肿瘤，因其可产生不成熟类骨质而得名。原发性骨肉瘤主要见于儿童，特别是骨骼快速生长期—青春期(10-14岁)，且男性多于女性。骨肉瘤好发于四肢长骨的干骺端，其它如骼骨、脊柱等部位也可发生，其进展快、恶性程度高，易出现远处转移，远期生存率低，特别是发生转移的患者，其5年生存率大概在11％-29％之间，同时临床上确诊为骨肉瘤的患者中有10％-25％发生肿瘤转移，其中90％的患者转移至肺。骨肉瘤的危险因素主要包括身高、出生体重以及生殖系统遗传变异等，青春期激素水平以及其他与骨骼生长相关的因素也是骨肉瘤的病因。在20世纪七十年代，骨肉瘤的主要治疗手段是外科截肢，但5年生存率仅为20％，后来随着化疗辅助治疗的引进，局限性肿瘤患者(主要是儿童和青少年)的5年生存率达到了50％-70％；目前骨肉瘤患者的标准治疗手段为术前辅助化疗，手术和术后辅助化疗。但对于骨肉瘤转移患者，经过上述治疗之后的5年生存率也仅有25％。究其原因，是我们对骨肉瘤的发生机制缺乏准确的认识，因此，彻底阐明骨肉瘤的发生机制，并筛选特异、高效的靶向药物已迫在眉睫。
新藤黄酸(Neogambogic acid,NGA)是藤黄中的活性成分之一，在多种癌症中具有显著的抗肿瘤潜能。但目前对藤黄提取物NGA的临床应用报道较少。近年来研究发现，NGA通过抑制HMGB1和MCPIP1，可以阻止硅诱导的巨噬细胞活化、凋亡和肺纤维化。此外，NGA可以降低乳腺癌中癌细胞的增殖能力。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供新藤黄酸在制备USP9x抑制剂中的应用。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
作为一个优选方案，所述抑制剂是新藤黄酸和WP1130。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：新藤黄酸在制备USP9x抑制剂中的应用。
本发明的优点在于：通过研究发现在骨肉瘤中降低USP9x的表达或抑制其活性，可以有效的促进促增殖因子SOX2的降解，这为临床上开发新的针对骨肉瘤的化疗药物提供了新的靶点，同时，我们研究也发现NGA可以有效的抑制USP9x的去泛素化酶活性，从而间接促进SOX2的泛素化降解，抑制肿瘤的发生与发展，这为发展USP9x抑制剂提供了新的分子结构。新藤黄酸作为植物中药藤黄的有效提取物，具有一定的临床治疗背景，避免了应用于临床时所带来的不可预知的不良反应，在前期的实验研究中NGA可以有效的抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡，在动物实验中，同样验证了其体内效应，发现NGA可明显抑制体内骨肉瘤的增殖与进展，但其毒副反应并不明显，这也就证明了NGA具有临床应用价值。
附图说明
图1.NGA显著抑制骨肉瘤细胞的增殖。A.NGA的化学结构式。B,C,D.分别用不同浓度的NGA处理U2OS，MG63，143B细胞24h或48h后，用CCK8试剂检测NGA对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。
图2.NGA诱导骨肉瘤细胞凋亡，抑制细胞克隆形成。A.分别用0.25，0.5，1.0，1.5，2.0μM的NGA处理U2OS细胞24h，Western Blot检测PARP与C-PARP，Caspase 3与C-Caspase 3(A左)；用1.5μM的NGA处理U2OS细胞0，6，9，12，18，24，36h后检测PARP与C-PARP，Caspase 3与C-Caspase3(A右)。B.143B细胞中重复上述实验。C.AnnexinⅤ-APC和PI双染结合流式细胞技术分析不同浓度NGA处理U2OS和143B细胞24h后所致的凋亡情况，*p<0.05。D.用0.5或1μM的NGA预处理骨肉瘤细胞24h后进行克隆形成实验，在六孔板中接种2×103个细胞，培养10天左右，结晶紫染色计数克隆。
图3.NGA有效促进SOX2通过蛋白酶体的降解，从而发挥抗肿瘤效应。
A.分别用0，0.25，0.5，1，1.5，2.0μM的NGA处理U2OS，143B细胞12h后收细胞提取蛋白后检测细胞中SOX2的水平，发现SOX2表达明显降低(A左)；用1μM的NGA处理U2OS细胞0，3，6，9，12，24h后收细胞，提取蛋白后检测SOX2的水平，发现SOX2在12h就出现明显下降(A右)。B.用1μM的NGA处理U2OS细胞12h，在收细胞前5h用5μg/mL的MG132处理，提取蛋白后检测SOX2的表达，发现NGA所致的SOX2蛋白水平下降可被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。C.用1μM的NGA处理U2OS细胞12h后收细胞，提取RNA后，检测SOX2的mRNA水平，发现NGA并不能降低SOX2的mRNA水平。D.在2组融合率为60％-80％的HEK 293T细胞中外源性转入SOX2-HA质粒His-Ub质粒。瞬转48h后收细胞，在收细胞前12h用1μM的NGA处理细胞，用RIPA裂解细胞后，用HA-Beads进行IP实验，Weaternblot检测与SOX2结合的Ub以及K48-Ub的蛋白水平。E-F.在U2OS以及143B细胞中过表达SOX2之后，分别用1.5，2.0μM的NGA处理24h之后，检测细胞的生存率，进行统计。
图4.体内实验证明NGA抑制骨肉瘤生长的，同时抑制SOX2的表达。A.用骨肉瘤细胞143B进行裸鼠的移植瘤实验，用2*106个细胞重悬于100μL PBS中进行皮下成瘤，待移植瘤生长至一定程度时，进行NGA的处理，NGA溶解在含有7.5％聚乙二醇，以及7.5％石油醚的生理盐水中，进行腹腔注射，剂量为6mg/kg，每隔一天打一次，一共处理15天同时进行移植瘤大小的测量，之后进行移植瘤的剥离，进行拍照，称重。A.处理过程中移植瘤大小变化。B.即为剥离的移植瘤的直观图。C.最后移植瘤剥离之后称重两组的重量比较。D.免疫组化检测两组移植瘤中增殖(Ki-67)，凋亡(TUNEL)，以及SOX2的表达变化。E.处理过程中小鼠的体重变化。
图5.USP9x可以稳定SOX2的表达。A.在293T细胞中瞬时过表达一系列USP家族的成员，48小时后收集细胞裂解液，进行Western blot检测细胞内SOX2的表达情况。B.在293T细胞中分别梯度增加地转入USP9x质粒，同时共转入SOX2质粒，瞬转完48h收取蛋白，Westernblot检测USP9x的过表达情况以及SOX2的表达变化。C.在293T细胞中共同过表达USP9x以及SOX2之后，用10μg/mL的CHX分别处理3，6，9，12h后收集细胞，Western blot检测SOX2的变化(左)，检测SOX2的表达相对于内参的变化，统计图如右，*,P<0.05。D.在U2OS以及143B骨肉瘤细胞中利用shRNA敲低USP9x的表达后，Western blot检测发现SOX2的表达水平降低。E.在U2OS以及143B细胞中敲低USP9x之后，再用5μg/mL的MG132处理5h，收取蛋白，Weaternblot方法检测SOX2表达的恢复情况，结果发现敲低USP9x所致的SOX2表达降低可被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。F.用3μM的WP1130处理U2OS以及143B细胞12h，在收蛋白前5h用5μg/mL的MG132处理，然后检测细胞中SOX2的表达情况。
图6.USP9x与SOX2可发生相互作用，同时去泛素化SOX2。A.在HEK293T细胞中外源性转SOX2过表达质粒，用USP9x的抗体或Flag-M2进行IP实验，检测SOX2与USP9x的相互作用。B.在HEK 293T细胞中分别转入质粒Flag-USP9x和SOX2-HA质粒，瞬转结束后，用Flag抗体或者HA抗体进行IP实验，检测与USP9x与SOX2的相互作用。C.在U2OS以及143B细胞中进行免疫荧光染色，显示SOX2(红光)与USP9x(绿光)的共定位情况，DAPI指示细胞核；D.在HEK293T细胞转入shUSP9x，Flag-SOX2以及HA-Ub，在收集细胞前5h用5μg/mL的MG132处理，瞬转48h后收集1×107个细胞，用RIPA裂解后用Flag-Beads进行IP实验，将SOX2IP下来之后检测HA，即与SOX2蛋白连接的泛素量的变化。E.在HEK 293T细胞中分别瞬时转入质粒SOX2-HAHis-Ub与质粒Flag-USP9x，在收集细胞前5h用5μg/mL的MG132处理，瞬转48h后收集1×107个细胞，用RIPA裂解后用HA-Beads进行IP实验，将SOX2IP下来之后分别检测His-Ub/K48-Ub/K63-Ub，即与SOX2蛋白连接的泛素量的变化。
图7.NGA与USP9x而不是SOX2发生相互作用。A-B.CETSA实验，NGA在温度变化(A)与浓度变化(B)下对USP9x的热稳定性的影响。C.U2OS与143B细胞用NGA处理之后，Westernblot检测USP9x的表达量变化。
图8.敲低USP9x可抑制骨肉瘤细胞增殖。A.Western blot方法验证U2OS与143B细胞中USP9x的敲除情况。B-E.U2OS/143B细胞敲低USP9x之后，进行胎盼蓝染色实验(B)，显微镜下拍摄细胞形态(C)，流式检测细胞周期分布变化(D)，结晶紫染色检测细胞克隆形成能力的变化。E.在143B细胞中稳定敲低USP9x之后，再次稳定过表达或者不过表达SOX2，Western blot检测USP9x的敲除效率以及SOX2的过表达水平，结晶紫染色检测细胞克隆形成能力变化。
图9.敲低USP9x降低骨肉瘤细胞的致瘤性。A.Western blot实验验证143B细胞中USP9x的敲除的效率。B-E.用骨肉瘤细胞143B(pGIPz，shUSP9x-1#，shUSP9x-5#)进行裸鼠的移植瘤实验，用2×106个细胞重悬100μLPB中进行皮下成瘤，待移植瘤生长至100mm3时，每隔一天进行移植瘤的测量(B)，待成瘤27天之后，进行裸鼠的处理，进行移植瘤的剥离，统计以及称重(C)，D为移植瘤的直观图。E.移植瘤免疫组化结果，检测移植瘤的增殖(Ki-67)与凋亡情况(TUNEl)，同时检测肿瘤中SOX2的表达变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
细胞处理
人骨肉瘤细胞U2OS，MG63，143B细胞均在含有10％热灭活胎牛血清(FBS,GibcoBRL,Gaithersburg,ML)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM培养基(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)中培养，放置于37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中。在实验中，细胞均在细胞密度为70-80％时用相应浓度的药物NGA处理。NGA溶于DMSO，其储存浓度为50mM。细胞活率用台盼蓝排斥测试法检测。
蛋白印迹分析
不同浓度的NGA处理细胞特定的或者不同的时间后，将U2OS，143B，MG63细胞通过离心收集起来并裂解提取蛋白。将蛋白等量上样至6-12％SDS-PAGE胶，进行电泳，并转移印迹至NC膜上(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)。用5％脱脂牛奶封闭膜之后，4℃孵育一抗USP9x(Santa Cruz Biotech,sc-365353),SOX2(Abcam,ab97959),Caspase 3(CST,#9662),PARP(CST,#9532),Flag(Sigma),HA(Sigma),IκBα(CST,#9242),USP2(Abcam,ab66556),USP7(Santa Cruz Biotech,sc-133204),USP14(Santa Cruz Biotech,sc-398009),USP24(Abcam,ab129064)。接着孵育辣根过氧化物酶连接的二抗(CellSignaling,Beverly,MA)。并采用化学底物发光(Cell Signaling Technology)检测。β-actin抗体(Merck,Darmstadt,Germany)用于检测蛋白的上样量。
RNA抽提分析
收集处理好的细胞2×106个，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次后，2500rpm，4℃离心5min后用1mL TRIzol重悬细胞，在震荡仪上剧烈震荡30s使细胞充分混匀然后在室温静置5min；在每毫升TRIzol中加入200μL氯仿，反复混匀，至液体沿管壁顺利流下，且液体不凝滞后，室温静置10min；12000g，4℃离心15min后将分离得到的上清(约500μL)移至另一无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，震荡5s或者上下颠倒混匀后在室温静置5min，12000g，4℃离心10min后RNA沉淀在管底，弃上清，加入1mL 75％乙醇(由DEPC水现配)颠倒重悬RNA沉淀后7500g，4℃离心5min，弃上清，可重复此操作以保证将沉淀洗涤干净；在超净台中将其吹干后(至RNA沉淀呈现半透明)用DEPC水溶解，然后再将抽提的RNA定量、用于逆转录，如暂时不需使用可放于-80℃中保存。
逆转录：
利用全式金反转录试剂盒进行RNA的逆转录
Figure BDA0002125322610000061
轻轻混匀后，42℃孵15min；85℃加热5s失活TransScript RT/RI gRNA Remover。反转录结束后，得到的cDNA可放置于-20℃保存。将上述得到的cDNA进行荧光定量PCR，每个处理组均为三复孔，每复孔10μL体系：5μL SYBR Green PCR Master Mix，正反向引物各0.1μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.8μL，加于96孔板后用封口膜封好后，于常温，2000rpm离心2min，使得孔壁上的样品流至底部。在7300Real time PCR System仪器中进行RT-PCR，Ct值为达到设定的阈值所需要的循环次数，应用“ΔΔCt法”，GAPDH作为内参基因计算mRNA水平。检测的GAPDH，USP9x和SOX2基因的引物如下表所示。
Figure BDA0002125322610000071
骨肉瘤细胞内USP9x的敲除实验
在骨肉瘤细胞内进行USP9x的敲除实验，首先进行慢病毒的包装，在六孔板中进行，当六孔板中HEK 293T细胞融合率达到60–80％时，进行病毒的包装，每孔的体系为：两个EP管每一个EP管中加入100μL opti-MEM培养液，其中一管中加入包装质粒psPAX2 0.75μg，pMD2G 0.5μg，与目的质粒pGIPz/pGIPz-shUSP9x-1#/5#0.75μg后混匀，另一管中加入100μLopti-MEM培养液后按PEI:质粒总量比例为6:1加入PEI转染试剂12μL，混匀后将转染试剂混合物加入到质粒混合物中，混匀后静置10min，逐滴加入到293T细胞中，混匀后培养6h后换新鲜的培养液，每孔2.5mL。48h后用0.45μm的滤头过滤病毒，病毒上清感染骨肉瘤细胞，同时加入polybren至终浓度为8μg/mL，6h后换液，48h后进行筛选，puromycin筛选浓度均为1μg/mL。筛选结束后得到敲除USP9x的稳转株。敲除USP9x靶向片段为1#：5’-CTTAAATCCTCATTGCAA A-3’；5#：5’-GATGTATTCTCAATCGTAT-3’。
统计分析
用于统计的数据均来自于每次3个样本共3次试验的结果，Student’s t-test用于评价两组之间的差异，p<0.05被认为具有显著性统计学差异。
实施例1.NGA可抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞发生凋亡。
通过一系列的CCK8实验与凋亡检测筛选我们发现NGA可引起骨肉瘤细胞U2OS和143B细胞发生明显的增殖抑制以及凋亡，并且呈现时间依赖的方式。同时可以有效地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。
实验过程：分别用不同浓度的NGA处理U2OS，143B以及MG63细胞24h或者48h之后，CCK8实验检测细胞的增殖情况发现，NGA可以明显抑制细胞的增殖(见图1)。而后我们分别用0.25，0.5，1.0，1.5，2.0μM的NGA处理U2OS细胞24h，Western Blot检测发现NGA可明显诱导细胞发生凋亡，出现PARP与Caspase3的活化(见图2A-B)，进一步用AnnexinⅤ-APC和PI双染技术，流式细胞分析发现NGA确实可以明显诱导细胞发生凋亡(见图2C)，而在NGA处理细胞后，用结晶紫染色发现，其同样可以明显抑制细胞的克隆形成能力，抑制细胞的增殖(见图2D)。
实施例2.NGA有效促进SOX2的降解，从而发挥抗肿瘤效应。
由于有文献报道过SOX2的高表达有效地促进了肿瘤细胞的增殖，肿瘤的快速进展，但是根据文献报道SOX2可被泛素结合酶Ube2s泛素化，而后通过蛋白酶体途径降解，这也就预示着我们可以通过调控SOX2的降解这一过程，来调控肿瘤大的进程。在这里我们检测发现NGA可以有效的，呈时间与浓度依赖性地促进SOX2通过蛋白酶体途径降解，同时并不改变其mRNA水平，而蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转这一现象。进一步通过免疫沉淀检测SOX2的泛素化水平以及类型发现，SOX2在NGA的影响下，泛素化水平显著增高，而且是与蛋白酶体降解相关的K48-Ub的明显上升。为了进一步检测SOX2的降解是否参与了NGA的抗肿瘤效应，我们在细胞中过表达SOX2之后，发现这一处理可以明显减弱NGA抑制骨肉瘤细胞增殖的影响，这也就说明SOX2的泛素化降解参与了NGA所诱导的抗肿瘤过程。
实验过程：首先我们分别用0，0.25，0.5，1，1.5，2.0μM的NGA处理U2OS，143B细胞12h后收细胞提取蛋白后检测细胞中SOX2的水平，发现SOX2表达明显降低(见图3A左)；用1μM的NGA处理U2OS细胞0，3，6，9，12，24h后收细胞，提取蛋白后检测SOX2的水平，发现SOX2在12h就出现明显下降(A右)，可见NGA可成时间与浓度依赖性的降低SOX2的表达。为了进一步验证泛素-蛋白酶体系统在SOX2的表达下降中的作用，我们用1μM的NGA处理U2OS细胞12h，在收细胞前5h用5μg/mL的MG132处理，提取蛋白后检测SOX2的表达，发现NGA所致的SOX2蛋白水平下降可被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转，可见SOX2的降解是通过蛋白酶体系统的(见图3B)。而这一结果同样在转录水平得到验证，我们用1μM的NGA处理U2OS细胞12h后收细胞，提取RNA后，检测SOX2的mRNA水平，发现NGA并不能降低SOX2的mRNA水平(见图3C)。既然NGA是通过泛素-蛋白酶体系统讲解SOX2，那么其应可以改变SOX2的泛素化水平，在两组融合率为60％-80％的HEK 293T细胞中外源性转入SOX2-HA质粒His-Ub质粒。瞬转48h后收细胞，在收细胞前12h用1μM的NGA处理细胞，用RIPA裂解细胞后，用HA-Beads进行IP实验，Weaternblot检测与SOX2结合的Ub以及K48-Ub的蛋白水平，发现NGA可以明显增加SOX2的泛素化水平，特别是K48-Ub(见图3D)。所以当我们在U2OS以及143B细胞中过表达SOX2之后，分别用1.5，2.0μM的NGA处理24h之后，检测细胞的生存率发现，细胞中过表达的SOX2可以部分逆转NGA所产生的细胞增殖抑制的效应(见图3E-F)，这也就进一步验证了NGA可以通过降低SOX2的水平，从而产生细胞抑制的作用。
实施例3.体内实验证明NGA抑制骨肉瘤生长的，同时抑制SOX2的表达。
经过裸鼠移植瘤模型，用143B细胞在裸鼠皮下进行成瘤实验，待移植瘤生长至一定程度时，用6mg/kg的NGA进行腹腔注射，处理15天之后，与对照组进行比较发现，NGA组小鼠所成移植瘤的大小明显小于对照组，同时组化结果显示处理之后移植瘤中增殖相关指标Ki-67表达明显降低，而凋亡指标TUNEL阳性的细胞明显增加，同时伴随着SOX2的表达的下降。这也就验证了NGA在体内可以有效的抑制骨肉瘤的进程，同时降低促进肿瘤发展的SOX2的表达。
实验过程：裸鼠移植瘤模型验证NGA的抑制骨肉瘤增殖的能力，我们用骨肉瘤细胞143B进行裸鼠的移植瘤实验，用2*106个细胞重悬于100μL PBS中进行皮下成瘤，待移植瘤生长至一定程度时，进行NGA的处理，NGA溶解在含有7.5％聚乙二醇，以及7.5％石油醚的生理盐水中，进行腹腔注射，剂量为6mg/kg，每隔一天打一次，一共处理15天同时进行移植瘤大小的测量，之后进行移植瘤的剥离，进行拍照，称重。处理过程中我们发现移植瘤在NGA的作用下明显减小(见图4A-B)，重量也明显减轻(见图4C)。最后我们用免疫组化检测两组移植瘤中增殖(Ki-67)，凋亡(TUNEL)，以及SOX2的表达变化，发现NGA明显抑制肿瘤的增殖，促进细胞的凋亡，同时肿瘤中的SOX2的表达水平下降(见图4D)。而在NGA处理过程中NGA对小鼠体重的影响不是很大(见图4E)。
实施例4.USP9x可以稳定SOX2的表达。
通过以上实验我们验证了NGA可以通过改变DUBs的活性来调控SOX2的表达，而USP家族是DUBs中成员最多的家族，我们通过检测在过表达USPs家族成员的293T细胞中SOX2的表达情况发现，USP9x可以明显稳定SOX2的表达。同时我们利用不同的去泛素化酶抑制剂也验证了这一现象，如b-AP15(USP14和UCHL5的抑制剂),P5091(USP7和USP47的抑制剂)和ML364(USP2的抑制剂),WP1130(USP9x的抑制剂)，发现只有WP1130可以有效的促进SOX2的下调。所以我们在骨肉瘤细胞中进行USP9x的敲除实验发现，降低USP9x的表达水平同样可以下调SOX2的表达(不改变SOX2的mRNA水平)，而这种SOX2的下调可以被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。
实验过程：首先我我们在293T细胞中瞬时过表达一系列USP家族的成员，48小时后收集细胞裂解液，进行Western blot检测细胞内SOX2的表达情况，发现USP9x过表达之后可以明显上调SOX2的表达水平(见图5A)。所以进一步地我们在293T细胞中分别梯度增加地转入USP9x质粒，同时共转入SOX2质粒，瞬转完48h收取蛋白，Western blot检测USP9x的过表达情况以及SOX2的表达变化，发现随着USP9x的表达量的增加，SOX2的表达也得到逐步的稳定(如图5B)。所以既然USP9x可以稳定SOX2的表达，那么USP9x是否是通过改变SOX2的半衰期来实现的呢？所以我们在293T细胞中共同过表达USP9x以及SOX2之后，用10μg/mL的CHX分别处理3，6，9，12h后收集细胞，Western blot检测SOX2的变化发现，过表达USP9x之后，SOX2的半衰期得到明显的延长(见图5C左)，检测SOX2的表达相对于内参的变化，统计图如图5C右，*,P<0.05。接着我们在U2OS以及143B骨肉瘤细胞中利用shRNA敲低USP9x的表达后，Western blot检测发现SOX2的表达水平降低(见图5D)。而在U2OS以及143B细胞中敲低USP9x之后，再用5μg/mL的MG132处理5h，收取蛋白，Weatern blot方法检测SOX2表达的恢复情况，结果发现敲低USP9x所致的SOX2表达降低可被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转(见图5E)。为了验证这一结果，我们同样利用了USP9x的抑制剂WP1130来验证这一结果，我们用3μM的WP1130处理U2OS以及143B细胞12h，在收蛋白前5h用5μg/mL的MG132处理，然后检测细胞中SOX2的表达情况，同样发现WP1130可以降低SOX2的表达，而其这一降低可被蛋白酶体抑制剂所逆转(见图5F)。
实施例5.USP9x与SOX2可发生相互作用，同时去泛素化SOX2
既然USP9x可以稳定SOX2的表达，降低USP9x的表达可以下调SOX2的水平，而这一现象可被蛋白酶体抑制剂所逆转，那么SOX2是否就是USP9x的经典底物之一呢？首先我们通过免疫共沉淀实验证明了两者之间的相互作用，同时通过改变细胞内USP9x的表达，检测SOX2的泛素化状态时发现，USP9x的低表达使得SOX2的泛素化水平明显增高，而高表达时，SOX2的泛素化水平下降，而主要改变的泛素类型是K48-Ub，可见SOX2是USP9x的底物之一，USP9x可以与SOX2发生相互作用，是的SOX2发生去泛素化，而避免其通过蛋白酶体途径降解。
实验过程：我们在HEK 293T细胞中外源性转SOX2过表达质粒，用USP9x的抗体或Flag-M2进行IP实验，检测SOX2与USP9x的相互作用，发现USP9x与SOX2存在明显的相互作用(见图6A)。反向地，在HEK 293T细胞中分别转入质粒Flag-USP9x和SOX2-HA质粒，瞬转结束后，用Flag抗体或者HA抗体进行IP实验，同样检测出这一相互作用(见图6B)。免疫荧光同样验证了这一点，在U2OS以及143B细胞中进行免疫荧光染色，显示SOX2(红光)与USP9x(绿光)的共定位情况，DAPI指示细胞核，在共聚焦显微镜下可以明显发现这一共定位情况(见图6C)，可见USP9x与SOX2的相互作用确实存在；所以我们接着检测USP9x对SOX2的泛素化水平的影响，首先在HEK 293T细胞转入shUSP9x，Flag-SOX2以及HA-Ub，在收集细胞前5h用5μg/mL的MG132处理，瞬转48h后收集1×107个细胞，用RIPA裂解后用Flag-Beads进行IP实验，将SOX2IP下来之后检测HA，即与SOX2蛋白连接的泛素量的变化，发现USP9x的表达降低之后,SOX2的泛素化水平明显上升(见图6D)。而在HEK 293T细胞中分别瞬时转入质粒SOX2-HA、His-Ub与质粒Flag-USP9x，在收集细胞前5h用5μg/mL的MG132处理，瞬转48h后收集1×107个细胞，用RIPA裂解后用HA-Beads进行IP实验，将SOX2IP下来之后分别检测泛素化类型的改变，发现过表达USP9x之后，SOX2的泛素化水平明显下降，而且是K48-Ub的变化，K63-Ub没有明显改变(见图6D)。
实施例6.NGA与USP9x发生相互作用
通过以上的实验我们发现NGA可以促进SOX2的泛素化降解，而SOX2又是USP9x的底物，所以我们猜想USP9x与NGA是否能发生相互作用。细胞热力学迁移实验(CETSA)是验证小分子化合物与其靶标相互作用的方法之一，通过CETSA实验我们发现NGA可以增强USP9x在不同温度下的热稳定性，且呈浓度依赖性，并且NGA与USP9x的这种相互作用并不影响其蛋白水平。
实验过程：首先我们通过CETSA实验来验证USP9x与NGA的相互关系，分别检测NGA在温度变化(见图7A)与浓度变化(见图7B)下对USP9x的热稳定性的影响，发现NGA可呈温度与时间梯度地稳定USP9x。而当我们用NGA处理U2OS与143B细胞后用NGA处理之后，Westernblot检测USP9x的表达量变化发现，NGA并不影响USP9x的蛋白水平的表达(见图7C)，这也就说明了NGA可作用于USP9x，但并不影响USP9x的蛋白水平的表达。
实施例7.敲低USP9x可诱导骨肉瘤细胞增殖能力下降
以上实验我们已经验证了NGA在骨肉瘤细胞中的肿瘤抑制作用，NGA可以通过与去泛素化酶USP9x的作用，从而促进促癌因子SOX2的泛素化降解，继而抑制肿瘤的增殖和进展，但是USP9x是否在骨肉瘤中是一个促癌因子的作用，还需进一步的验证，所以我们在接下去的实验中验证了在骨肉瘤中USP9x的作用。在骨肉瘤细胞中敲低USP9x的表达，可以有效地抑制细胞的增殖。通过克隆形成实验发现其又可明显抑制克隆形成能力，我们通过流式检测发现，敲低USP9x可明显的诱导细胞发生S期的阻滞。
实验过程：首先看我们在骨肉瘤细胞中降低USP9x的表达水平，来验证其对骨肉瘤细胞的影响，Western blot方法验证U2OS与143B细胞中USP9x的敲除情况(见图8A)。U2OS/143B细胞敲低USP9x之后，进行胎盼蓝染色实验(见图8B)，显微镜下拍摄细胞形态(见图8C)，流式检测细胞周期分布变化(见图8D)，结晶紫染色检测细胞克隆形成能力的变化(见图8E)，发现USP9x表达降低之后，细胞的增殖能力下降，同时周期发生阻滞，克隆形成能力明显下降。进一步地，以上我们验证了SOX2是USP9x的底物，所以当我们在143B细胞中稳定敲低USP9x之后，再次稳定过表达或者不过表达SOX2，来验证SOX2是否可以逆转USP9x表达降低所产生的生物学效应，首先Western blot检测USP9x的敲除效率以及SOX2的过表达水平(见图8E上)，再而通过结晶紫染色检测细胞克隆形成能力变化，发现SOX2的过表达可明显逆转USP9x表达降低所产生的增殖抑制效应。
实验例8.敲低USP9x在体内抑制骨肉瘤细胞增殖
进一步在裸鼠身上进行皮下成瘤实验发现，降低USP9x的表达，可明显降低骨肉瘤细胞的致瘤性，敲低USP9x之后，移植瘤的体积和重量明显减小，免疫组化同样发现在USP9x的表达降低的所成移植瘤中，细胞凋亡增加，增殖减慢，SOX2的表达同样下降。可见USP9x可在体内抑制骨肉瘤的发展，同时降低肿瘤中SOX2的表达。
实验过程：以上我们在细胞中验证了USP9x的效应，进一步地我们在动物水平进行验证，首先Western blot实验验证143B细胞中USP9x的敲除的效率(见图9A)。然后我们进行移植瘤实验，用骨肉瘤细胞143B(pGIPz，shUSP9x-1#，shUSP9x-5#)进行裸鼠的移植瘤实验，用2×106个细胞重悬100μLPBS中进行皮下成瘤，待移植瘤生长至100mm3时，每隔一天进行移植瘤的测量并记录(见图9B)，待成瘤27天之后，进行裸鼠的处理，进行移植瘤的剥离，统计以及称重(见图9C)，图9D为移植瘤的直观图，从统计结果来看NGA可明显抑制体内骨肉瘤地生长，进而通过移植瘤免疫组化结果，检测发现移植瘤的增殖能力下降(Ki-67表达减少)与凋亡增加(TUNEL表达增加)，同时检测肿瘤中SOX2发现SOX2的表达同样下降(见图9E)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0002125322670000011
Figure IDA0002125322670000021

Claims (4)

1.USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂是新藤黄酸。
3.根据权利要求1所述的USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂是WP1130。
4.新藤黄酸在制备USP9x抑制剂中的应用。
CN201910620293.6A 2019-07-10 2019-07-10 USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用 Active CN112206323B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910620293.6A CN112206323B (zh) 2019-07-10 2019-07-10 USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910620293.6A CN112206323B (zh) 2019-07-10 2019-07-10 USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112206323A true CN112206323A (zh) 2021-01-12
CN112206323B CN112206323B (zh) 2022-11-25

Family

ID=74048170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910620293.6A Active CN112206323B (zh) 2019-07-10 2019-07-10 USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112206323B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000044216A2 (en) * 1999-02-01 2000-08-03 Cytovia Inc Gambogic acid, analogs and derivatives as activators of caspases and inducers of apoptosis
US20070093456A1 (en) * 2003-12-18 2007-04-26 Cai Sui X Derivatives of gambogic acid and analogs as activators of caspases and inducers of apoptosis
US20160090351A1 (en) * 2013-04-18 2016-03-31 Brandeis University Inhibitors of deubiquitinating proteases
CN108853054A (zh) * 2018-06-29 2018-11-23 天津中医药大学 一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000044216A2 (en) * 1999-02-01 2000-08-03 Cytovia Inc Gambogic acid, analogs and derivatives as activators of caspases and inducers of apoptosis
US20070093456A1 (en) * 2003-12-18 2007-04-26 Cai Sui X Derivatives of gambogic acid and analogs as activators of caspases and inducers of apoptosis
US20160090351A1 (en) * 2013-04-18 2016-03-31 Brandeis University Inhibitors of deubiquitinating proteases
CN108853054A (zh) * 2018-06-29 2018-11-23 天津中医药大学 一种环肽修饰的藤黄酸纳米结构脂质载体及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TONG WANG 等: "Stabilization of PTGES by deubiquitinase USP9X promotes metastatic features of lung cancer via PGE2 signaling", 《AMERICAN JOURNAL OF CANCER RESEARCH》 *
单玉兴等: "藤黄酸对骨肉瘤中hTERT和Bcl-2蛋白的影响", 《中国实验诊断学》 *
周晓华等: "泛素特异肽酶9与肿瘤的研究进展", 《中国肿瘤外科杂志》 *
巴成磊等: "藤黄酸联合顺铂对人骨肉瘤细胞作用的实验研究", 《中国矫形外科杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112206323B (zh) 2022-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fang et al. MicroRNA‐29b suppresses tumor angiogenesis, invasion, and metastasis by regulating matrix metalloproteinase 2 expression
US9827224B2 (en) Methods and compositions for ameliorating pancreatic cancer
Yoshida et al. Clinical and functional significance of intracellular and extracellular microRNA-25-3p in osteosarcoma
Liu et al. Zinc finger E‐box binding homeobox 1 promotes invasion and bone metastasis of small cell lung cancer in vitro and in vivo
Jiang et al. High expression of NSUN5 promotes cell proliferation via cell cycle regulation in colorectal cancer
Wojnarowicz et al. Anti-tumor effects of an ID antagonist with no observed acquired resistance
CN109321656B (zh) 蛋白depdc1作为诊断三阴乳腺癌的标记物的用途
Ting et al. Withaferin A targeting both cancer stem cells and metastatic cancer stem cells in the UP-LN1 carcinoma cell model
CN117487915A (zh) H2afv在肝癌诊断、预后、预防或治疗中的应用
US9745578B2 (en) Targeting microRNA miR-409-3P to treat prostate cancer
CN111166867B (zh) Pd-1泛素化激动剂的功能与用途
CN104906598B (zh) ACTL6A基因shRNA敲除序列在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用
CN112206323B (zh) USP9x抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用
CN114306611B (zh) Abhd2基因表达抑制剂、其应用及药物
CN114606323A (zh) 一种识别胃癌干细胞的标志物lgsn作为胃癌诊断和治疗靶标的应用
CN105287632A (zh) 一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药pdx模型的构建方法
KR101191958B1 (ko) Ｔｌｅ1 억제제를 유효성분으로 함유하는 활액막 육종 예방 및 치료용 약학적 조성물
Yu et al. MicroRNA-1269a promotes the occurrence and progression of osteosarcoma by inhibit-ing TGF-β1 expression.
CN113995753A (zh) 一种中药分子槐果碱在制备治疗胶质母细胞瘤药物上的应用
CN112656805A (zh) 抑制ythdf1活性的物质在制备预防或治疗胃癌产品中的应用
CN117607442B (zh) 一种预测乳腺癌免疫治疗效果的标志物、试剂盒与应用
Zhao et al. Patient-derived bladder cancer xenograft models reveal VEGF and CDK4 enhancing tumor metastasis behavior
CN118436656A (zh) 吴茱萸碱在调控结直肠癌中多胺代谢、yap蛋白磷酸化和核转位的应用
CN110079528B (zh) 靶向otud7b基因的小干扰rna在胶质瘤靶向治疗中的应用
CN114107507B (zh) Zswim1蛋白在调控肺腺癌细胞增殖和转移中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant