CN108840933A - 一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法，经过多次重复免疫、细胞融合、拉莫三嗪单克隆抗体纯化等步骤制得拉莫三嗪单克隆抗体，为以后的拉莫三嗪药物浓度检测提供原材料。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法。
背景技术
癫痫病是一种由多种病因引起的慢性反复发作性神经系统常见病，以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征，患病率为5％，我国目前约有癫痫患者900万，每年新发病例约40万。拉莫三嗪，化学名称为3,5‐二氨基‐6‐(2,3‐二氯苯基)‐1,2,4‐三嗪，是一种苯基三嗪类的抗癫痫药物。拉莫三嗪主要作用于电压依赖性钠通道，对反复放电有抑制作用，也可能作用于谷氨酸相关神经递质。可抑制谷氨酸和天冬氨酸的抗癫痫药，能稳定突触前膜，抑制谷氨酸和天冬氨酸的释放。
发明内容
本发明目的在于提供一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：
第一步：将拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物作为免疫原注射入Balb/c小鼠体内，所用免疫原用量为40-80ug/只，每隔7~15天免疫一次，使Balb/c小鼠产生抗血清；
第二步：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5~7:1的数量比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用聚乙二醇水溶液作为融合剂将两种细胞融合得到融合细胞，然后将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的细胞培养板中，再将细胞培养板置于CO2培养箱中进行培养；待融合细胞开始形成集落后进行第一次 ELISA 筛选，以筛选到仅与拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆6~8天后再进行单克隆孔的ELISA 筛选，重复亚克隆 2~3 次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；
第三步：向6~7周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，注射量为0 .5 mL/只，7天后腹腔注射所述杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水，离心后吸出上清液，然后用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到拉莫三嗪单克隆抗体溶液。
优选的技术方案为：所述聚乙二醇水溶液的质量分数为40~50%。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是免疫时间进程表。
图3是第二次采血检测结果。
图4是第三次采血检测结果。
图5-8是融合检测阳性数据。
图9是一抗检测阳性数据。
图10-11是一抗检测抑制数据。
图11是二抗检测阳性数据。
图12是二抗检测抑制数据。
图13-19是上清检测数据。
图20是上清检测结果数据。
图21是腹水检测数据。
图22是拉莫三嗪单克隆抗体制备结果。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明制得了拉莫三嗪单克隆抗体，为以后的拉莫三嗪药物浓度检测提供原材料。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂与溶液：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（北京勤邦生物技术有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS，浓度，pH7.2），包被液（磷酸盐缓冲液 浓度，pH7.4），反应稀释液（PBST，浓度，pH7.4+0.05%吐温20），洗涤工作液（用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释）；封闭液（在0.02mol/L PBS1中加入0.05%BSA），底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化氢，B液为四甲基联苯胺；终止液（2mol/L H2SO4），酶标二抗（北京勤邦生物）。
主要仪器设备：真空冷冻干燥机，电热恒温培养箱，ProteinA/G柱，酶标仪，低温高速离心机等。
动物免疫：1、免疫方式：皮下多点注射。免疫小鼠数量：各免疫原分别免疫5只Balb/c小鼠，共30只。免疫时间进程记录，如图2所示。1.小鼠以不同的免疫原分组，每组5只鼠。2.M：免疫，1M代表第一次免疫；C：采血，1C代表第一次采血检测结果；以此类推。
检测方法：
1、主要试剂：酶标二抗（北京勤邦生物），改造抗原（北京勤邦生物），标准品，洗涤液，抗体稀释液，标准品稀释液，抗原稀释液，底物A /B 液，封闭液。
2、主要耗材：96孔酶标板（北京勤邦生物）。
3、实验操作步骤：
A、包板：稀释液稀释抗原至500倍浓度，混匀并加入酶标板（每孔100ul、37 ℃
孵育、2小时），洗板一次，拍干；
B、封闭：加入封闭液进行封闭（每孔150ul、37 ℃孵育、2小时），弃液，拍
干，备用；
C、加抗体：将抗体稀释相应浓度，每孔加入50ul；（37 ℃孵育、30分钟）；
D、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
E、加酶标二抗：每孔100ul、37℃孵育、30分钟；
F、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
G、显色：加入等量A/B底物显色液，（每孔100ul 、37 ℃孵育、15分钟）；
H、终止：加入终止液终止反应；
I、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm。
实施例：一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法
一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤，具体流程如图1所示。
第一步：将拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物作为免疫原注射入Balb/c小鼠体内，所用免疫原用量为60ug/只，每隔7~15天免疫一次，使Balb/c小鼠产生抗血清；
第二步：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按6:1的数量比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用聚乙二醇水溶液作为融合剂将两种细胞融合得到融合细胞，然后将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的细胞培养板中，再将细胞培养板置于CO2培养箱中进行培养；待融合细胞开始形成集落后进行第一次 ELISA 筛选，以筛选到仅与拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆7天后再进行单克隆孔的 ELISA 筛选，重复亚克隆 2次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；
第三步：向6~7周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，注射量为0 .5 mL/只，7天后腹腔注射所述杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水，离心后吸出上清液，然后用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到拉莫三嗪单克隆抗体溶液。
拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物的制备方法：
1、称10mg对氨基苯甲酸溶入1.1mL的0.2 mol/L HCl 中，置于0-4℃搅拌至完全溶解，得到对氨基苯甲酸溶液 ；然后称取6mg的 NaNO2溶在0.35mL的蒸馏水中，置于0-4℃搅拌至完全溶解，得到 NaNO2溶液；将NaNO2溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1 小时，得A液。
2、称取1.5mg 的拉莫三嗪分散在10mL含NaCl 的硼砂缓冲液中，置于 0-4℃下搅拌至完全溶解，得到B液；将A液逐滴加入到B液中，避光反应 2 小时，得到C液；含 NaCl 的硼砂缓冲液中，硼砂的浓度为 0.05mol/L，pH值为 8.5，并含有浓度为0.15mol/L的NaCl。
3、在C液中添加H3BO3晶体调节其pH值至7.4，然后加入94mg牛血清白蛋白、80mg碳二亚胺和4mg N- 羟基琥珀酰亚胺，然后置于室温搅拌 2 小时，得D液。
4、将D液转移到透析袋中，用0.01mol/L，pH为7.4 的PBS缓冲液，在0-4℃下透析五天，每 12小时更换一次透析液；将透析后的溶液冻干，得到固体粉末即为拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物，将其置于-20℃保存，备用。
按照图2免疫流程进行免疫、并完成血清采集与竞争抑制情况进行检测（检测结果见图3和图4）。在经第一、二、三次采血检测后选择效价较高、抑制较好、符合实验要求的目标小鼠进行融合。本项目优选1只小鼠进行了融合。
利用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与优选小鼠的脾细胞进行细胞融合，融合后经培养、观察、检测及阴阳性对照试验，获得一批符合实验要求的杂交瘤细胞，并对其继续培养与选择。从后期筛选细胞株情况看，从以上待融合的小鼠中的C1458-4小鼠获得理想的细胞株及抗体。
C1458-4鼠融合后共获得15个阳性孔，30ng/ml检测抑制,2孔抑制近完全，其余显色低且基本无抑制。进行下一步筛选工作，通过二次克隆共获得2株单细胞株。融合、克隆检测数据如下：检测数据见图5-图8（有标示的为后期进行克隆的孔），二次克隆检测数据见图9-12。
C1458-4小鼠融合后，经有限稀释法的一次、二次克隆及上清检测，共得到2株细胞株，具体效价对应数值以及每株细胞株对应鼠编号见表3。上清检测数据见图13-图19，汇总如图20所示。
对所获得的7株特异阳性细胞株分别进行小鼠腹水（抗体）制备，经腹水检测，结果均能达到实验要求，不同的细胞株产生的腹水效价等方面存在一定的差异。7株细胞株共获得22个腹水样品，具体效价等数据见图21。
经过检测、筛选与验证，如图22所示，最后共得到符合要求阳性细胞株7株，腹水制备共30个腹水，经抗体（腹水）检测后，大部分能够满足实验要求，只是不同的细胞株产生的腹水的效价等方面存在一定的差异。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (2)
1.一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物作为免疫原注射入Balb/c小鼠体内，所用免疫原用量为40-80ug/只，每隔7~15天免疫一次，使Balb/c小鼠产生抗血清；
第二步：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5~7:1的数量比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用聚乙二醇水溶液作为融合剂将两种细胞融合得到融合细胞，然后将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的细胞培养板中，再将细胞培养板置于CO2培养箱中进行培养；待融合细胞开始形成集落后进行第一次 ELISA 筛选，以筛选到仅与拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆6~8天后再进行单克隆孔的ELISA 筛选，重复亚克隆 2~3 次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；
第三步：向6~7周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，注射量为0 .5 mL/只，7天后腹腔注射所述杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水，离心后吸出上清液，然后用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到拉莫三嗪单克隆抗体溶液。
2.根据权利要求1所述的拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇水溶液的质量分数为40~50%。
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