CN108823182A - 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1、编码基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1，为由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或将SEQ ID NO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且蛋白仍具有抗镰孢菌枯萎病性能的衍生蛋白质。并公开其编码基因及在抗镰孢菌枯萎病上的应用。本发明首次公开了在普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病反应中发挥重要作用的PvMES1蛋白。其编码基因过表达的植株对镰孢菌枯萎病原菌抗病性显著增强，当接种病原菌后该基因表达量最高达13.6倍,而该基因沉默植株接种病原菌后基因表达量最低降至0.48倍，植株抗病性显著降低。本发明为植物镰孢菌枯萎病抗病分子育种提供了有效方法。

Description

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1、编码基因及 应用

技术领域

本发明涉及普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1、编码基因及其应用。

背景技术

作物病害是导致农作物减产的重要原因之一，减少病害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。尖镰孢菌菜豆专化型(Fusarium oxysporum f.sp phaseoli)是一种普通菜豆常见土传性病害病原菌，在中国广大菜豆种植区危害非常严重。菜豆镰孢菌枯萎病是普通菜豆维管束类病害的一种，是由尖镰孢菌菜豆转化型引起的典型土传真菌病害，在适宜的发病年份和地区，给菜豆生产带来很大危害。该病原菌已经在全世界很多菜豆种植地区都有发现，主要危害菜豆的根、茎及叶片，发病叶片迅速枯萎变黄，脱落，植株最终死亡。菜豆镰孢菌枯萎病首次报道于美国，其主要发生于中部高原及西部地区(Harter,1929)。该病在我国北方俗称死秧，各地露地和保护地栽培中均可发生，发病后死苗在30～50％以上，严重时甚至达90％，给菜豆生产带来严重威胁(杜永刚&李昶，2008)。

普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)是最重要的食用豆类之一，约占全球食用豆类总产量的50％，是全球产量最高的食用豆类(Phillip et al.,2004)。普通菜豆是人类饮食中植物蛋白质(约22％)，维生素(叶酸)和矿物质(钙，铜，铁，镁，锰，锌)的重要来源(Broughton et al.,2003)，此外食用普通菜豆对癌症、糖尿病和心脏病等影响人类健康的重要疾病也有很好的预防和治疗作用(Hangen&Bennink,2003)。

水杨酸(SA)是一种小分子酚类次生代谢物，它是许多植物免疫系统中重要内源信号分子(Vlot et al.,2009)，涉及并参与植物的过敏反应(Hypersensitive reaction，HR)和系统获得抗性(Systemic acquired resistance，SAR)反应，在植物的抗病反应中起到关键作用(Durrant&Dong,2004；Kumar et al.,2012)，见图1。病原菌的浸染不仅能够导致植物被侵染部位SA的积累，同样在未侵染的部位也积累了大量的SA，从而诱导SAR的产生(Malamy et al.,1990；Métraux et al.,1990)，因此SA表现出对植物抗病性的调节作用在很久前就已经吸引了科学家的关注。

SA与植物镰孢菌枯萎病的抗病性存在着密切的联系。拟南芥(Edgar et al.,2006)，番茄(Mandal et al.,2009)，海枣(Dihazi et al.,2011)，鹰嘴豆(Gayatridevi etal.,2012)，普通菜豆(Xue et al.,2013)等，对F.oxysporum的抗性受外源SA诱导均显著提高。Mandal等(2009)研究表明，SA处理番茄植株的叶片，能够显著地提高植株根中内源SA的含量，增强苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine aminotransferase，PAL)和过氧化物酶(Peroxidase，POX)活性，从而显著增强番茄对Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici的抗性；Dihazi等(2011)研究表明，SA处理海枣植株，海枣根中黄酮类化合物和可溶性蛋白质的含量、过氧化物酶活性均显著升高，并且通过电子显微镜观察发现，SA诱导根细胞间隙沉淀大量致密电子层，阻止病原菌的侵染，提高海枣对Fusarium oxysporum f.sp.albedinis的抗性；Gayatridevi等(2012)证明SA作为过氧化氢酶同工酶的调控因子，能够激发鹰嘴豆对F.oxysporum f.sp.ciceri的系统抗性。Xue等(2014)证明SA具有增强普通菜豆对F.oxysporum f.sp.phaseoli抗性的作用。SA既然是许多种植物防御系统中重要的信号分子，那么在植物体内直接影响SA水平的调节因子就必然与植物的抗病性存在密切的联系，SA结合蛋白2(SA-binding protein 2，SABP2)就是这样一类直接参与调控植物体内SA水平的蛋白。SABP2具有水杨酰甲酯酯酶(Methyl salicylate esterase，MES)活性，在植物体内将水杨酰甲酯(methyl salicylate，MeSA)转化成游离SA，提高植物体内SA水平，对植物激发系统抗性具有极其关键的作用(Park et al.,2007；Vlot et al.,2009；Liu et al.,2011)。在植物细胞中MeSA是SA稳定的的无活性衍生物，是植物体内SA主要的运输形式，可经植物韧皮部从病原菌感染位点运送到效应部位(远端组织)。国外学者已证明，植物遭受病原菌侵袭后应激产生一些SA信号分子，在SA甲基转移酶(SA methyltransferase)作用下生成MeSA，MeSA对SA水解酶不敏感(SA易受SA水解酶降解)，故可作为可移动的SAR信号，从病原菌感染的局部位点运送到植物远端组织，以激发起全植株水平的抵御病原菌的抗性(Park et al.,2007；Vlot et al.,2009；Liu et al.,2011)。因此SABP2，即MES，对于调控植物细胞内SA水平和建立植物抵御病原物侵染的抗性反应，均是必不可少的调控因子。目前关于MES基因的研究主要集中于烟草(Kumar&Klessig,2003)、拟南芥(Vlot et al.,2008)和马铃薯(Manosalva et al.,2010)等模式植物，受限于相关基因组学信息的匮乏，对普通菜豆等豆科植物MES基因家族的研究却鲜有报道。因此分离及应用普通菜豆MES基因，对于理解普通菜豆枯萎病的抗病机制，提升我国普通菜豆抗病育种水平都具有非常重要意义。

发明内容

1、发明目的。

本发明提出了一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1及其编码基因。

2、本发明所采用的技术方案。

一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1，为如下(a)或(b)所示的蛋白：

(a)由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且蛋白仍具有抗镰孢菌枯萎病性能的由(a)衍生的蛋白质。

PvMES1蛋白质序列包括277个氨基酸，理论蛋白分子质量为30.99kDa，等电点为8.70。该蛋白包含3个活性位点(Ser102,His227,and Asp255)，共同组成具有水解MeSA活性的结构域。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，在(a)所示的蛋白的N端或C端连接上如表1所示的标签

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5个	RRRRR
Poly-His	6个	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′端第49至882位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因，为如下1)、2)、3)或4)的基因：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO1的自5＇末端第49-882位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是SEQ ID NO1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述抗病相关蛋白PvMES1的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述抗病相关蛋白PvMES1的DNA分子。

其中所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的重组表达载体。

含有上述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的重组菌。

含有上述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的转基因细胞系。

含有上述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的基因表达盒。

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1在提高普通菜豆抵抗镰孢菌枯萎病性能上的应用。

3、本发明所产生的技术效果。

本发明首次公开了在普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病反应中发挥重要作用的PvMES1蛋白，并公开了其序列及编码蛋白的序列。实验证实，PvMES1基因过表达的植株对镰孢菌枯萎病原菌抗病性显著增强，当接种病原菌后PvMES1基因表达量最高达到13.6倍，而PvMES1基因沉默植株接种病原菌后PvMES1基因表达量持续下降，最低达到0.48倍，植株抗病性显著降低。本发明为普通菜豆或其他植物镰孢菌枯萎病抗病分子育种提供了有效方法。

附图说明

图1为IPTG诱导PvMES1基因的原核表达。

图2为利用亲和层析纯化PvMES1重组表达蛋白。1&2：纯化的PvMES1重组表达蛋白；M：蛋白质份子标准；3：40mM咪唑washing buffer；4：30mM咪唑washing buffer；5：20mM咪唑washing buffer；6：亲和层析吸附后包涵体蛋白溶液；7：亲和层析吸附前包涵体蛋白溶液。

图3为HPLC方法测定PvMES1重组蛋白生物活性。

图4为接种病原菌3周后普通菜豆抗病表型分析图，A：对照；B：PvMES1基因过表达植株。

图5普通菜豆PvMES1基因过表达植株抗病生理特性分析。诱导基因表达后12d接种镰孢菌枯萎病原菌，A：基因表达量分析；B：MES酶活性分析；C：游离SA含量分析；D：病原菌定殖量。

图6接种病原菌2周后普通菜豆抗病表型分析图，A：对照；B：PvMES1基因沉默植株。

图7普通菜豆PvMES1基因沉默植株抗病生理特性分析。诱导基因沉默后12d接种镰孢菌枯萎病原菌，A：基因表达量分析；B：MES酶活性分析；C：游离SA含量分析；D：病原菌定殖量。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、普通菜豆中抗病相关蛋白的编码基因PvMES1的克隆

一、抗病相关蛋白的编码基因PvMES1的分离

1.总RNA提取及mRNA纯化，以普通菜豆(BRB130，国家作物种质库)为试材，分别在接种病原菌后0、24、48、72、96和120h于根组织采样并等量混合，用TRIZOL提取总RNA，用oligo(dT)纤维素分离纯化mRNA并合成cDNA。

2.以合成cDNA作为模板，设计引物利用RT-PCR方法分离普通菜豆中MES1基因，引物序列如下：

MES-F1：TATAGCGAGAAAGGAATC

MES-R1：AAGTTTGGCTGATGGGTT

扩增获得约900bp大小的扩增片段，其中第49-882位共计834bp为开放阅读框。

分别通过体外和体内实验验证PvMES1基因功能。

①体外活性的验证

采用pET28a作为外源基因的重组表达载体，将经过酶切的PvMES1基因连接入经相同酶切的pET28a表达载体，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建PvMES1基因原核表达菌株，通过IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳检测，初步确定PvMES1重组蛋白的分子量约为30.0kD(图1)，方法参照汪家政等(2000)。采用亲和层析技术，利用层析树脂上特异性识别6×His标签的抗体，纯化PvMES1重组蛋白(图2)。参照Forouhar et al.(2005)的方法检测PvMES1重组蛋白的体外MES活性。方法如下：将上清液与MeSA混合，置于37℃温浴30min，加入水杨酸甲基转移酶和14C-S-腺苷甲硫氨酸标记水解产生的SA，生成14C-MeSA，加入等体积乙酸乙酯，混匀后离心提取有机相，通过闪烁计数仪定量分析14C-MeSA含量，计算上清液MES活性。结果表明，重组蛋白PvMES1具有MeSA水解活性，可以水解MeSA生成SA(图3)。

②体内活性的验证

(a)过表达技术

通过VIGS技术构建PvMES1基因过表达体系，采用BamHI和ClaI双酶切方法将PvMES1基因开放阅读框序列全长导入pG7R2V载体中，构建基于VIGS技术的基因过表达载体，与pGHopR1载体一并进行体外转录，合成BPMV病毒用于接种菜豆植株，通过基因过表达方法验证PvMES1基因功能，方法参照Díaz-Camino et al.(2011)。结果表明：接种病原菌3周后，PvMES1基因过表达植株对镰孢菌枯萎病原菌抗病性显著增强，仅真叶出现轻微枯萎，变黄症状，整株长势良好，而对照植株叶片则完全萎蔫，枯萎，根系变色，组织破坏严重(图4)。

生理试验结果表明，过表达植株根组织中PvMES1基因的表达量显著提高，接种BPMV后11天，基因表达量升高至3.1倍，而当接种病原菌后PvMES1基因表达量更是显著升高，最高达到13.6倍(图5A)。MES活性分析表明，PvMES1基因过表达植株根中MES活性显著高于对照，接种病原菌后明显升高，最高可达0.42nmol/min/μg，伴随着MES活性升高，根组织内游离SA含量逐渐升高，最高也可达到220ng/g，均显著高于对照组植株(图5B,C)。利用Real-time PCR技术检测菜豆植株根部病原菌定殖量，方法参照薛仁风(2012)。结果表明，接种3天后，过表达植株中病原菌定殖量与对照差异并不显著，6天后PvMES1基因过表达植株根中病原菌定殖量要显著低于对照，这表明PvMES1基因表达量的升高显著提高了寄主抗病性，抑制了病原菌对寄主根组织的侵染(图5D)。

(b)基因沉默技术

通过VIGS技术构建PvMES1基因沉默体系，采用BamHI和ClaI双酶切方法将PvMES1基因开放阅读框中约500bp序列片段导入pG7R2V载体中，构建基于VIGS技术的基因沉默载体，与pGHopR1载体一并进行体外转录，合成BPMV病毒用于接种菜豆植株，通过基因沉默方法验证PvMES1基因功能，方法参照Díaz-Camino et al.(2011)。结果表明：接种病原菌2周后，PvMES1基因沉默植株对镰孢菌枯萎病原菌抗病性明显降低，植株完全枯萎，死亡，维管束组织遭受破坏程度严重，对照组植株叶片出现明显枯萎，变黄等典型枯萎病发病症状，这表明PvMES1基因的沉默表达显著降低了寄主对病原菌的防御能力(图6)。

生理试验结果表明，基因沉默植株根组织中PvMES1基因的表达量显著降低，接种BPMV后12天，基因表达量已经降低至0.78倍，而当接种病原菌后PvMES1基因表达量继续下降，最低达到0.48倍(图7A)。MES活性分析表明，PvMES1基因沉默植株根中MES活性显著低于对照，接种病原菌后更是明显下降，最低仅为0.25nmol/min/μg，伴随着MES活性降低，根组织内游离SA含量逐渐降低，最低可达82.2ng/g，均显著低于对照组植株(图7B,C)。利用Real-time PCR技术检测菜豆植株根部病原菌定殖量，方法参照薛仁风(2012)。结果表明，接种3天后，基因沉默植株中病原菌定殖量与对照差异并不显著，6天后PvMES1基因沉默植株根中病原菌定殖量显著高于对照，这表明干扰PvMES1基因表达显著降低了寄主抗病性(图7D)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>辽宁省农业科学院

<120>普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1、编码基因及应用

<160> 2

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211> 899

<212> DNA

<213>Phaseolus vulgaris

<400>1

tatagcgagaaaggaatcacgagaaggaaccacgagaagaaaacaactatgagttcagaa 60

aaagttgtgttaatttttattttgtgtatgagcatgatgagttcaggacattgtaaagat 120

aacaagcattatgttctggtgcatgggggttgccatggagcttggagttggtacaagctc 180

aagccactcttggaatctgcaggccacaaggtcacagtactcgaccttgcagcatctggc 240

attaacatgcagaaaattgaagatgttcatactttctcacagtacactgagcctttgttg 300

cagctattggcaaaaattcccccgaacgaaaaggtgattctagtgggtcatagccttggg 360

ggactcaacatagcacttgccatggagaaattcccagaaaaaattctagctggtgttttc 420

gtaacagcttttgttccagatactgaacacagcccttcttatgtattggaaaagtatggt 480

gagaggacccccttgtctgcatggatggatactaaatttgaaccaagtggaaacaaaaca 540

tcaatgttctttggtcccaagtttttggccaacaagctctatcaactttcccctgctcag 600

gatcttgaattggccaagactttagtaaggccatcatcactcttcgtggaagacttgtca 660

aggcaaaagaatttttcgaaagagggatatgggtcagttccacgttcctatattgtttgc 720

actgaggaccttggaattactttggattaccaacgatggatgatcaaaaatgctgcaatc 780

agtgacgttgtatatatcaaaggcgcagatcatatggttatgaatagcaagcctcgccaa 840

ctacttgattctctccggaagatagcaactaaatatgcataaacccatcagccaaactt 899

<210>2

<211> 277

<212> PRT

<213>Phaseolus vulgaris

<400>2

Met Ser Ser Glu Lys Val Val Leu Ile Phe Ile Leu Cys Met Ser Met

1 5 10 15

Met Ser Ser Gly His Cys Lys Asp Asn Lys His Tyr Val Leu Val His

20 25 30

Gly Gly Cys His Gly Ala Trp Ser Trp Tyr Lys Leu Lys Pro Leu Leu

35 40 45

Glu Ser Ala Gly His Lys Val Thr Val Leu Asp Leu Ala Ala Ser Gly

50 55 60

Ile Asn Met Gln Lys Ile Glu Asp Val His Thr Phe Ser Gln Tyr Thr

65 70 75 80

Glu Pro Leu Leu Gln Leu Leu Ala Lys Ile Pro Pro Asn Glu Lys Val

85 90 95

Ile Leu Val Gly His Ser Leu Gly Gly Leu Asn Ile Ala Leu Ala Met

100 105 110

Glu Lys Phe Pro Glu Lys Ile Leu Ala Gly Val Phe Val Thr Ala Phe

115 120 125

Val Pro Asp Thr Glu His Ser Pro Ser Tyr Val Leu Glu Lys Tyr Gly

130 135 140

Glu Arg Thr Pro Leu Ser Ala Trp Met Asp Thr Lys Phe Glu Pro Ser

145 150 155 160

Gly Asn Lys Thr Ser Met Phe Phe Gly Pro Lys Phe Leu Ala Asn Lys

165 170 175

Leu Tyr Gln Leu Ser Pro Ala Gln Asp Leu Glu Leu Ala Lys Thr Leu

180 185 190

Val Arg Pro Ser Ser Leu Phe Val Glu Asp Leu Ser Arg Gln Lys Asn

195 200 205

Phe Ser Lys Glu Gly Tyr Gly Ser Val Pro Arg Ser Tyr Ile Val Cys

210 215 220

Thr Glu Asp Leu Gly Ile Thr Leu Asp Tyr Gln Arg Trp Met Ile Lys

225 230 235 240

Asn Ala Ala Ile Ser Asp Val Val Tyr Ile Lys Gly Ala Asp His Met

245 250 255

Val Met Asn Ser Lys Pro Arg Gln Leu Leu Asp Ser Leu Arg Lys Ile

260 265 270

Ala Thr Lys Tyr Ala

275

Claims (9)

1.一种普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1，为如下(a)或(b)所示的蛋白：

(a)由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且蛋白仍具有抗镰孢菌枯萎病性能的由(a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1，其特征在于：在(a)所示的蛋白的N端或C端连接上如表1所示的标签

表1.标签的序列

标签 残基 序列 Poly-Arg 5个 RRRRR Poly-His 6个 HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL

3.权利要求1所述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因，为如下1)、2)、3)或4)的基因：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO1的自5＇末端第49-882位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是SEQ ID NO1所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述抗病相关蛋白PvMES1的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述抗病相关蛋白PvMES1的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因，其特征在于：严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

5.含有权利要求3所述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的重组表达载体。

6.含有权利要求3所述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的重组菌。

7.含有权利要求3所述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求3所述的抗病相关蛋白PvMES1编码基因的基因表达盒。

9.普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白PvMES1在提高普通菜豆抵抗镰孢菌枯萎病性能上的应用。