CN1088105C - 血液携带的间质细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个哺乳动物血液携带的细胞类群，它们能表达出一个独特的表面标志图样，其中包括结缔组织成纤维细胞的一些典型的标志，这些细胞在此称作“血液携带的间质细胞”。具体地说，本发明涉及这些血液携带的间质细胞的分离、表征和应用。本发明的细胞与外周血液白细胞之间可由其特殊的大小、形态、细胞表面表型和生物学活性区分开，同样也可以通过其他表面表型标志将其与结缔组织成纤维细胞区分开。如动物模型所示，这些在培养物中和在体内增殖的细胞，能够从血液迁移到创伤部位。因此，这样的血液携带的间质细胞可能有非常广泛的应用，包括但不限于加快创伤愈合、组织重塑和基因治疗。

Description

血液携带的间质细胞

                     1.概述

本发明涉及一个哺乳动物血液携带的细胞类群，它们能表达出一个独特的表面标志图样，其中包括结缔组织成纤维细胞的一些典型的标志，这些细胞在此称作“血液携带的间质细胞”。具体地说，本发明涉及这些血液携带的间质细胞的分离、表征和应用。本发明的细胞与外周血液白细胞之间可由其特殊的大小、形态、细胞表面表型和生物学活性区分开，同样也可以通过其他表面表型标志将其与结缔组织成纤维细胞区分开。如动物模型所示，这些在培养物中和在体内增殖的细胞，能够从血液迁移到创伤部位。因此，这样的血液携带的间质细胞可能有非常广泛的应用，包括但不限于加快创伤愈合、组织重塑和基因治疗。

                   2.发明背景

                   2.1创伤愈合

创伤可以被认为是组织的正常结构的物理性截断，它可能是由于物理或者化学的原因，例如烧伤，擦伤，割伤或者外科手术过程造成的。就皮肤而言，既然它通常的功能是作为身体的第一道防线，则皮肤的创伤可能会严重地损害个体的抗感染能力，除了痛苦、不适外更会导致个体对偶发性感染的易感性。因此，非常需要开发这方面的药剂和方法，以促进快速治愈创伤的应答。

当创伤发生时，机体启动了一个相互协同的修复应答，这是一系列复杂的过程，包括了体液和细胞两方面因素，而且这个过程持续几天到几周的时间。特别是据显示，创伤愈合依赖于特异类型的细胞、细胞因子和细胞外基质之间的相互作用(克拉克，1989，现代细胞生物学评论， 1：1000)。创伤愈合的第一步包括被认为是血小板的血液携带细胞的活动。这些细胞在创伤部位聚集，并且建立起一道临时屏障以阻止血液的流失。血小板的这一作用是通过分泌催化血块形成的凝血酶和其他因子完成的，这些因子吸引其他的细胞到受损的部位。

在最初的二十四小时过后，更多的细胞成分到达并对创伤愈合过程发挥作用。血液携带的嗜中性白细胞和单核细胞迁移到创伤部位。这些细胞在某种程度上能中和入侵微生物和分泌能够清除最初血块的酶类。这时是通常所指的伤口愈合中的“发炎”阶段，巨噬细胞开始通过分泌多种炎症细胞因子而发挥重要作用，例如肿瘤坏死因子(TNF)，白细胞介素如IL-1、IL-6、IL-8、转化生长因子-β(TGF-β)等，以及生长因子如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，来源于血小板的生长因子(PDGF)，以抵抗感染和补充其他细胞种类。这些细胞种类包括上皮和结缔组织细胞，尤其是成纤维细胞，它们最终修复组织损坏的部位。组织修复的最后一个阶段是组织的重塑，包括胶原蛋白交联，胶原溶解，胶原合成，以增强伤口内部结构的完整性。遗憾的是，全过程要相当长的时间才能完成。

为了加快创伤愈合过程，防止或减少感染和对深层组织的进一步损害，近年来许多种方法都已被研究过。一种相对传统的方法包括将健康的组织移植到创伤部位上，尤其是用从身体其他部位获得的自体组织(贝尔等，1983，皮肤学研究杂志，81：25)。另一种方法是给予能够提高趋药性、促进细胞增殖的细胞因子，诸如PDGF、TGF-β和FGF(皮尔斯等，1989，细胞生物学杂志，109：429；拉伯利等，1988，科学，241：708)。

             2.2创伤愈合过程涉及到的细胞类型

在几天到几周的时间中，组织修复和重塑持续进行。在皮肤中发生表皮化过程，即当下层的真皮被修复时，邻近的表皮细胞在创伤部位生长来保护真皮。  结缔组织间质细胞，也被认为是成纤维细胞，是创伤修复的后一阶段的首要介体。这些细胞在创伤部位内增殖，产生胶原蛋白和其他基质成分。在这一阶段，细胞和大分子构成的网状组织被建立起来，以负责特殊的组织或器官最终的组织再生。平滑肌细胞和血管内皮细胞也移至创伤部位。新的血管系统形成，用以支持和营养新建的组织。

创伤修复的主要细胞介体包括血液携带的血小板和白细胞，例如嗜中性细胞和单核白细胞，单核白细胞迁移到受伤区域后成为巨噬细胞。这些血液来源的白细胞可以抵抗感染并分泌细胞因子和生长因子。而且，周围结缔组织的成纤维细胞也向受伤部位内生长以提供更多的细胞因子和细胞外基质蛋白。但是在本发明之前，还从未有人描述过有参与和加强创伤修复过程能力的血液携带的成纤维细胞样细胞类群。

                    3.发明概述

本发明涉及与创伤愈合有关的哺乳动物血液携带的间质细胞，分离这些细胞的方法，以及应用这些细胞促进创伤愈合和组织修复的方法。

本发明部分基于申请人的发现，即一类相对较大的，纺锤形的，成纤维细胞样的细胞，它们可以从人和鼠类外周血中分离并培养。用对多种已知的细胞标志特异的抗体来对这些细胞进行表型分析，表明这些细胞来源于间质细胞，因为它们表达了典型的成纤维细胞标志如胶原蛋白、波形蛋白、纤维结合素。在细胞培养物中，这些大型纺锤形细胞与小型圆细胞共存，后者也表现出成纤维细胞样的表型。因此，这些间质细胞能够通过它们的大小、形态和特殊的表型与其他外周血白细胞区别开来。因为相对于已知的血液细胞类型而言，这些细胞的表面标志形式与成纤维细胞表型一致，因此这些细胞在此被称为“血液携带的间质细胞。”本发明以实施例的方式描述了人体血液细胞被分离、培养和其细胞表面表型鉴定。在体外，间质细胞的扩增与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以剂量依赖方式相关。在体内，可观察到相应的鼠类细胞类群迁移到实验性地移植到动物身上的创伤腔(wound chamber)中。

在此描述的血液携带的间质细胞，和这些细胞产生的各种因子的广泛应用，都被包含在本发明中，特别是在改善伤口愈合方面，包括但不限于皮肤创伤、角膜创伤、具上皮内表层的器官创伤、擦伤、刀伤、烫伤、慢性溃疡、炎症和类似情况以及外科手术过程引起的创伤。

另外，间质细胞可以通过遗传工程来表达所需的一种或几种基因产物。基因工程细胞可以被用于体内(例如，或者还给自体宿主，或者送入一合适的受体)以局部地或全身性地释放它们的基因产物。

                     4.附图简述

图1：细胞荧光测量中入射光的前向散射和侧向散射表明，经过培养后细胞类群的大小和颗粒性结构增加。

图1A：新分离的培养前的外周血淋巴细胞。

图1B：培养四周后回收的细胞。

图2：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子导致血液携带的间质细胞的扩增。

                    5.发明详述

本发明涉及哺乳动物血液携带的间质细胞，分离和表征这些细胞的方法，以及这些细胞的种种应用方法，这些应用包括但不限于创伤愈合和基因治疗。

本发明将在下面进行详述，其目的在于描述而不是限制。这里描述和举例说明的从人体血液中分离间质细胞的特殊步骤和方法仅仅是说明性的。本领域已知的其他相似的步骤和方法同样适用。并且，相似的技术可能适用于分离非人类的哺乳动物血液中的间质细胞。

             5.1.血液携带的间质细胞的分离

本发明提供了从外周血或其他生理来源富集和/或纯化间质细胞的方法。这些细胞具有的生物活性允许不必在绝对洁净的装置中使用它们。虽然优选的是血液，但是本发明中的间质细胞也可从它们存留或成熟的任何组织中分离出来，这些组织包括但并不限于骨髓、胎肝、或胚卵黄囊。

为了从外周血液中获得与创伤愈合有关的间质细胞，需使用多种分离步骤。第六节所描述的实施例中的分离方法的变化被包含在本发明范围之内。依照本发明的这个方面，血液携带的间质细胞可以根据有或没有特异性细胞表面标志来分离。这些技术包括：流式细胞计数法(使用荧光激活的细胞分选器)，生物素—抗生物素蛋白或生物素—抗生蛋白链菌素分离法(使用了与表面标志偶联的生物素特异性的多克隆或单克隆抗体，以及与固体支持物，比如亲和柱基质或塑料表面，结合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素)，磁性分离法(利用抗体包被的磁珠)，破坏性分离法(例如抗体加补体或与细胞毒素或放射性同位素偶联的抗体，用以移去不需要的细胞类群)。

或者，所述间质细胞可以通过下述方法分离：重复的密度梯度离心、外源凝集素层析、亲和层析(包括正向选择和反向选择)，或这些方法联合使用。正向选择法可以应用具有抗间质细胞特异性的表面标志的抗体的亲和层析法。例如，在密度梯度离心或塑料粘附后，血液中的大部分的单核细胞被去掉，这时一种抗波形蛋白的抗体就可被用来正向选择间质细胞。反向选择法包括了对在此公开的操作规范的修改，见后。实质上，一个间质细胞制备物可以和一个或更多抗细胞表面抗原的抗体直接反应，所述抗原与间质细胞的迁移无关。可以应用任何抗T细胞，B细胞，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，树突状细胞和粒性白细胞标志的抗体。这样的抗体包括例如对T细胞特异的抗-CD3，抗-CD4，抗-CD5，抗-CD8，抗-αβ，抗-γδT细胞受体；对B细胞特异的抗-CD12，抗-CD19，抗-CD20；对单核白细胞特异的抗CD-14；对NK细胞特异的抗CD-16，抗CD-56。这些抗体可以重复性地结合使用或按一定顺序使用来富集间质细胞。一旦结合了抗体，细胞会吸附于包被了抗鼠抗体(因为多数抗细胞表面标志的单抗是小鼠产生的)的固体表面柱，从而被分离；或者，如果抗体与生物素偶联，可以用抗生物素蛋白包被的表面分离结合抗体的细胞；或者，如果抗体偶联于磁珠，可在磁场中分离抗体识别的表达抗原的细胞。

          5.2.血液携带的间质细胞的特征描述

如本文实施例所述，血液携带的细胞可以用免疫化学的方法在外周血中检测到，并且可以被多种步骤纯化到均一。细胞在短期培养中分为形态学上截然不同的两类，一种“圆形”的细胞类型和一种“纺锤形”的成纤维细胞状的细胞类型。在短期培养中，圆形细胞似乎是由淋巴细胞和一种小的圆形细胞组成的混合物，后者象纺锤形细胞，有成纤维细胞样的表型。长期培养好象加强了间质细胞(即表现成纤维细胞表型的圆形和纺锤形细胞)的生长，直至它们在体外成为优势细胞类型。小型的圆形间质细胞代表的可能是纺锤形间质细胞的有丝分裂活跃期。因此在短期培养中的初始淋巴细胞类群，即在没有特异淋巴因子的培养条件下寿命有限的细胞，最后将生成更持久的间质细胞。

本发明中的细胞被表征为源于间质细胞，因为与得自血液的细胞相比，它们有不寻常的表面表形。特别是，这些细胞表达波形蛋白、纤维结合素、I和III型胶原蛋白，这些是成纤维细胞的典型标志。相反地，这些细胞不表达细胞角蛋白、冯·威利布兰德因子、肌间线蛋白、层粘连蛋白和平滑肌细胞α肌动蛋白，所有这些蛋白是上皮、内皮和平滑肌细胞常用的识别标志。而且，外周血白细胞典型地表达的抗原如CD3，CD4，CD8，和CD56在血液携带的间质细胞中也不出现。有趣的是，这些细胞对CD34却是阳性的，而CD34是造血干细胞的标志，这说明这里所说的间质细胞可能源于骨髓。

本发明的间质细胞在细胞荧光图象法入射光前向和侧向散射中表现出比外周血液淋巴细胞大些和更具颗粒状结构。它们呈现出一种独特的纺锤形的形态学特征，这对于成纤维细胞是典型的而对于其他得自血液的细胞却是不典型的。因此，综上所述，血液携带的间质细胞是一个独特的类群，基于它们的大小、细胞表面表形和形态学性质，它们不同于所有前面描述过的来源于血液的细胞类群。

          5.3.血液携带的间质细胞的培养和扩增

用常用的标准培养技术长期在培养基中体外增殖已分离的血液携带的间质细胞对本领域的技术人员来说是熟知的。优选地，使用富含血清的培养基，更优选地，用含有20％胎牛血清的培养基(例如：可参照6.1.1，见后)。现已表明，细胞的生长在加入GM-CSF后被进一步加强。从上面的叙述可以知道，从外周血中获得的白细胞的短期培养物含有混杂的淋巴细胞类群，而成纤维细胞标志阳性细胞在长期培养物中占优势。GM-CSF加速了成纤维细胞样细胞在培养物中占优势的过程。另外，被分离的细胞可用于基因工程表达内源的GM-CSF以便以一种自动分泌的方式维持长期生长。(参照5.4，见后)。在这种方式下产生的连续细胞系或者克隆，可以使后面分离表面标志和细胞因子以及编码它的基因更容易。血液携带的间质细胞的长期培养可以在组织培养瓶、摇瓶、生物反应器系统中利用本领域中的任何已知方法进行。事实上，这些间质细胞可以对多种其他常规细胞因子和生长因子有响应。

           5.4.血液携带的间质细胞的应用

血液携带的间质细胞在培养中增殖的能力表明它们可被用于很多方面，如创伤愈合、基因治疗，尤其是对于自体和同基因宿主。就这些目的，细胞可以在分离后被直接使用，或在体外培养中导入或不导入外源基因，在培养中表达或不表达基因产物的情况下使用。

目前外源基因在不同器官的真核宿主细胞中稳定整合有一个主要障碍，即多数这样的细胞不能在体外增殖。由于间质细胞可在体外增殖，特别是受到GM-CSF的影响，因此它们可以作为向培养物中导入外源基因的受体的理想候选者。除了血液携带的间质细胞合成的细胞因子，许多别的细胞因子或粘附分子都可以通过基因工程方法引入这些细胞，这样能提高它们促进和加速创伤愈合及组织重塑，以及释放为了治疗之用而引入这些间质细胞的基因的产物的能力。

通常，这些细胞的基因工程处理方法包括：从个体中分离血液携带的间质细胞，将一个基因转入细胞以及确认该基因的稳定整合和所需基因产物的表达。这样的基因工程细胞可被植入同一个、或一个HLA匹配的或其他适宜的患者体内，和/或可用作这些细胞产生的因子和/或其编码基因的来源。为了本发明的实施，按下文第六节中描述的步骤分离的间质细胞可用作基因转移实验的受体。这些细胞能在外源基因导入前、中、后培养生长。其增殖活力能被GM-CSF加强。为向培养的间质细胞导入外源基因，可采用常规技术，包括但不限于显微注射、转染和转导法将任何克隆的基因导入。

基因转移的方法之一是使用重组病毒，比如逆转录病毒或腺病毒。例如，若用腺病毒表达载体，一个编码序列可被连接于一个腺病毒转录、翻译控制复合物，如晚期启动子和三分裂状先导序列。通过体内或体外重组，这个嵌合基因于是被插入病毒基因组。插入到腺病毒基因组的非必要区段(如E1或E3区段)将产生一个活的重组病毒，它能在被感染的间质细胞中表达基因产物(例见罗甘和申克，1984，美国国家科学院院刊，81：3655--3659)或者可用牛痘病毒的7.5K启动子(例见马科特等，1982，美国国家科学院院刊，79：7415--7419；马科特等，1984，病毒学杂志，49：857--864；潘尼加利等，1982，美国国家科学院院刊，79：4927--4931)。由能够作为染色体外因子复制的牛乳头状瘤病毒制成的载体也是候选者(沙夫等，1981，分子细胞生物学，1：486)。其DNA进入细胞后不久，该质粒即可在每个细胞复制约100到200个拷贝。插入的cDNA的转录不需要质粒整合入宿主染色体，因此能产生高水平表达。通过在质粒中插入一个可选择的标记，比如neo基因，这些载体能被用于稳定表达。或者，一个逆转录病毒基因组可经修饰后用作一个载体，它能引入和指导任何所需基因在血液携带的间质细胞中表达(康尼和马利甘，1984，美国国家科学院院刊，81：6349--6353)。应用可诱导的启动子，如金属硫蛋白IIA启动子和热休克启动子，也可以实现高水平表达。

为了获得重组蛋白的长期的、高产量生产，稳定表达常是优先考虑的。间质细胞可被适宜的表达控制因子(如启动子、增强子、控制序列、转录终止子、多聚腺苷酸部位等等)和可选的标记物控制下的cDNA转化，而不用包含病毒复制起点的表达载体。该可选的标记物提供了对选择物的抗性，并且使细胞将重组DNA稳定地整合到其染色体中并且生长，形成的目的基因，它随后被克隆和扩增成细胞系。例如，外源DNA被导入间质细胞后，细胞在富集培养基中生长1至2天，此后被转移到选择培养基。可以采用许多选择系统，包括(但不限于)单疱疹病毒胸苷激醇基因(魏格勒等，1977，细胞，11：223)，次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(柴巴尔斯卡和柴巴尔斯基，1962，美国国家科学院院刊，48：2026)，和腺嘌呤磷酸核糖转移(罗依等，1980，细胞，22：817)。另外，对代谢物的抗性也可作为选择的基础：dhfr基因，它具有氨甲喋呤抗性(魏格勒等，1980，美国国家科学院院刊，77：3567；欧海尔等，1981，美国国家科学院院刊，78：1527)；gpt基因，它具有酶酚酸抗性(马利甘和伯格，1981，美国国家科学院院刊，78：2072)；neo基因，它具有氨基糖苷G-418抗性(克尔伯瑞-盖拉平等，1981，分子生物学杂志，150：1)；hygro基因，它具有抗湿菌素(hygronycin)抗性(斯坦特里等，1984，基因，30：147)。最近，又发现一些可选择基因，即：txpB基因，它使细胞能利用吲哚而取代了色氨酸；his D基因，使细胞能利用组氨醇而替代了组氨酸(哈特曼和马利甘，1988，美国国家科学院院刊，85：8047)；以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)基因，它提供了对鸟氨酸脱羧酶抑制剂-2-(双氟甲基)-DL-鸟氨酸，即OFMO的抗性(L.麦肯罗格，1987，现代分子生物学讨论，冷泉港实验室)。

可以从外周血中分离出血液携带的间质细胞，经培养扩增后用于广泛的治疗目的，包括但不限于加快创伤愈合。有或没有外源基因的血液携带的间质细胞在经过纯化或部分富集后可被直接应用于外伤部位，包括但不限于严重的创伤、灼烧、切割、擦伤、慢性溃疡和皮肤炎症。这种细胞在化妆品方面的应用也包括于本发明范围之内。

而且，这些细胞也可被直接应用于损伤的组织或器官，例如那些由外伤或手术过程造成的，以修复内部器官，比如胃粘膜、心脏组织、骨骼和血管组织，以及那些用传统方法难以治愈的组织，如关节软骨、韧带、腱和神经组织。

另外，这些细胞也可通过多种方法给患者施用，以治疗内脏的外部或者内部损伤，包括但不限于静脉内、肌肉、皮下、皮内输注等等。施用的方法若能允许细胞的迁移(如静脉内施用)，间质细胞将在体内迁移到创伤部位，在那里它们可以促进创伤愈合。可以用这种方式应用基因工程间质细胞，将基因产物送至创伤部位；例如因子VIII、生长因子等的基因在这方面可能是有用的。另外，不允许细胞迁移的施用方法可能使被或未被基因工程化的间质细胞贮留于施用部位，在那里它们能释放基因产物到局部环境和/或全身中。

另一方面，可以设计一些方案来抑制或除去体内的这些细胞，例如施用抗特异表面标志的单抗，以治疗伴随有显著的纤维化的慢性疾病，特别是在过度纤维化的情况下，比如骨髓纤维化、组织细胞增多、肝硬化，瘢痕瘤形成、硬皮病等等。而且，抑制这些细胞迁移到创伤部位可防止伤疤的过量形成。

从个体中获得的外周血样品中的血液携带的间质细胞可以被定量，与健康个体的数值相比，这种细胞不正常的低或高浓度可能与疾病或紊乱有关。通过形态学分析、生物活性测定或优选地通过免疫化学方法，可对血液携带间质细胞进行定量。比如，对波形蛋白、纤维结合素、I或III型胶原蛋白特异的抗体可以被分别或联合使用来检测、量化这些细胞。

    5.5血液携带的间质细胞中的新标志和新细胞因子的鉴定

识别血液携带的间质细胞表达的新抗原性标志的多克隆和单克隆抗体的产生也包括于本发明范围内。这样的抗体可能有广泛的用途，例如通过亲和层析分离和表征血液携带的间质细胞。该领域内许多技术可被用于产生这些间质细胞的抗体。可以用存活的分离的间质细胞、固定化细胞或其膜制备物通过注射免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、仓鼠、小鼠、大鼠等。依赖于宿主的种类，可选用不同的佐剂以提高免疫应答，包括但不限于：(完全或不完全)福氏佐剂，矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，普卢龙尼克多元醇，多聚阴离子，多肽，石油乳剂，眼孔血蓝蛋白，二硝基酚，以及可能有用的人的佐剂如BCG(卡介菌)和

微棒状杆菌。

抗这些细胞上的新抗原的单抗可由任一种能让培养中的连续细胞系产生抗体分子的技术来获得。这些技术包括但不限于最先由科勒尔和密尔斯坦描述的杂交瘤技术(1975，自然，256，495--497)，更近一些的人B细胞杂交瘤技术(科斯伯等，1983，现代免疫学，4：72；科特等，1983，美国国家科学院院刊，80：2026--2030)，以及EBV杂交瘤技术(科利等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，阿兰.R.里斯公司，PP.77--96)。也可以用“嵌合抗体”产生技术，该技术是把合适的抗原特异性的小鼠抗体分子基因和一种人的抗体分子基因拼接起来(例见默里森等，1984，美国国家科学院院刊，81：6851--6855；纽伯格等，1984，自然，312：604--608；塔凯达等，1985，自然，314：452--454)。另外，产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可以被用来制备单链抗体。

可向同源的、同种异体的和异种的宿主注射活的或固定化的血液携带的间质细胞或其膜制备物。因为单抗能选择性地结合于该间质细胞而非其它血液细胞，因而能被筛选出来。

含有分子结合部位的抗体片段可由已知的技术制得。这样的片段包括但不限于：例如F(ab’)₂片段可由胃蛋白酶消化抗体分子而得，Fab片段来自于F(ab’)₂片段之二硫键还原。

血液携带的间质细胞能迁移到创伤部位的能力表明它们参与自然的创伤愈合反应，这些细胞可能是通过分泌细胞因子和/或与细胞-细胞接触有关的膜结合辅助分子发挥功能的。因此，间质细胞可以用作鉴别新的细胞因子和细胞表面辅助分子及其编码基因的来源。

为了鉴别可能由间质细胞产生的新型细胞因子，可建立长期间质细胞培养物，或者用病毒或化学物质将这种细胞转化为肿瘤细胞以获得连续细胞系。因为多种细胞类型或动物模型能对培养物的上清液产生可检测的适宜的生物应答，故而可利用它们来直接分析上清液。这些细胞可以被代谢标记，并且将它们的上清液进行生化分析以鉴定具有观察到的生物活性的可能的蛋白质。而且，可通过诱导细胞因子在细胞中的产生来鉴别这些细胞因子。为此，要使细胞暴露于或接触诱导细胞因子表达、产生的介质。许多可诱导别的细胞产生细胞因子的介质在这里也可能是有用的。这样的介质包括但不限于钙离子载体、内毒素、佛波酯、已知的细胞因子、化学激活因子、生长因子、激素和/或其它的调节物。用SDS-PAGE和/或生物活性鉴定了候选蛋白后，即可用本领域已知的多种技术来纯化这种蛋白，包括但不限于SDS制备胶电泳、离子交换色谱、等电聚焦凝胶及其它类型的色谱法。蛋白的纯度可用SDS-PAGE来检验，由蛋白质检测法来定量，根据生物检定来确认其活性并且纯化的蛋白可用作制备多抗和单抗的免疫原。

这种纯化的蛋白可在生物检定中被进一步检测，以刺激和/或抑制不同组织类型的指示细胞系的增殖和/或分化，也可以用放射标记的蛋白通过诸如亲和标记的方法鉴别它们的细胞表面受体。可以用对细胞因子特异的抗体鉴别和定量这些细胞因子的膜结合形式和分泌形式，从而研究细胞因子的生物合成途径，亲和纯化这些蛋白，以及免疫筛选用于编码序列分子克隆的表达文库。

  6.实施例：血液携带的间质细胞的鉴定、分离和特征描述

                      6.1材料和方法

              6.1.1从外周血分离细胞和细胞培养

血液携带的间质细胞是从全血，例如人或鼠的血液，中分离的对人的细胞，用静脉穿刺法抽取60毫升血到用肝素处理过的注射器内并用磷酸盐缓冲液(PBS)1∶1地稀释。稀释后的血液在蔗糖梯度介质下分层，并在室温下以450×g离心30分钟。白细胞在红细胞之上形成了一条带，这时可得到并用PBS洗并离心三次以上。沉淀的细胞被重悬于25毫升杜氏改性依格斯培养基/20％胎牛血清(FBS)/和0.1％的艮他霉素中。细胞被平铺在150毫米组织培养皿上。在24小时后，培养基和非粘附细胞被吸出并换上新鲜的培养基。培养基每周要换成新鲜的并进行间隔计数。

              6.1.2免疫荧光和细胞荧光图象分析

在某些情况下，细胞被接种在底部放有显微镜盖玻片的小池中。这样就可用点状免疫荧光在13毫米的盖玻片上对培养四周的细胞进行观察。为了进行分析，玻片被从培养皿中移出，用PBS洗两遍，用3.5％的甲醛浸没固定20分钟。细胞再用PBS洗一遍，在-20℃的70％乙醇中浸7分钟。然后，用100％乙醇代替70％乙醇，同样在-20℃下浸没7分钟。细胞再浸入-20℃的70％乙醇5分钟，最后用PBS洗三遍。

50微升的初级抗体被含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS以1∶10稀释后，加到固定化细胞上，在室温下温育30分钟。细胞用PBS洗两次，之后用加入含3％BSA的PBS以1∶10的比率稀释50微升的荧光染料偶联的二级抗体，在室温下再温育30分钟。为了用两种抗体进行双染色，将细胞与带有不同荧光信号(例如：FITC，罗丹明或者得克萨斯红)的两种直接偶联的抗体按上述方式共同温育。细胞再用PBS洗两次，用80％甘油/50mM N-丙基没食子酸保存，并用荧光显微镜分析。

细胞荧光图象分析也应用于培养四周的细胞。粘附的细胞被轻轻刮下或洗下。用PBS洗过三遍并计数后，细胞以5×10⁶/毫升密度重悬于含有1％BAS的PBS中。3×10⁵个细胞等分在聚苯乙烯管中(10×75mm)，加入10微升未被稀释的初级抗体，在黑暗中冰浴45分钟，用1％BAS/PBS洗三遍。10微升二级抗体-荧光染料偶联物被加入(如果初级抗体没有被直接偶联荧光染料)，细胞在黑暗中冰浴40分钟。为了用两种抗体进行双染色，将细胞与带有不同荧光信号(例如：FITC，罗丹明或者得克萨斯红)的两种直接偶联的抗体按上述方式共同温育。将细胞再用1％BSA/PBS洗三次，重悬于25微升1％BSA/PBS和100微升3.5％甲醛中，在4摄氏度黑暗条件下保存，直至进行细胞荧光图象分析。细胞可用贝克登·迪金斯FACS 440和科特尔的Profile 2分析。

                     6.1.3细胞分类

荧光活性细胞的分类是把来源于外周血的纺锤形间质细胞纯化到均一。这些研究应用了贝克登·迪金斯的FACs 440用来分离间质细胞，或者按照细胞大小(光线散射)；或者按照特异的细胞表面标志物的表达，这由抗体的特异性反应决定。

按照细胞大小：四周的细胞培养物被刮下并计数，在PBS中洗三次。细胞重悬于PBS中，浓度为5×10⁵/毫升，在分类之前保存在冰浴中。为了在分类之后培养，全部步骤要在无菌的环境下进行，细胞被收集到DMEM/20％FBS/0.1％艮他霉素中并铺平皿。

按照细胞表面标志物：四周的细胞培养物被刮下并计数，在PBS中洗三次。细胞重悬于PBS中，浓度为5×10⁵/毫升。3×10⁵个细胞等分在聚苯乙烯小管中(10×75mm)，加入10微升未被稀释的初级抗体，在黑暗中冰浴45分钟，用1％BAS/PBS洗三遍。10微升二级抗体-荧光染料偶联物被加入(如果最初的抗体没有被直接连接荧光染色)，细胞在黑暗中冰浴40分钟。为了用两种抗体进行双染色，将细胞与带有不同荧光信号(例如：FITC，罗丹明或者得克萨斯红)的两种直接偶联的抗体按上述方式共同温育。将细胞再用1％BSA/PBS洗三次，以5×10⁵的浓度重悬于25微升1％BSA/PBS和100微升3.5％的甲醛溶液，在4摄氏度的黑暗条件下保存。如果在分类后细胞还要被培养，细胞被收集到DMEM/20％FBS/0.1％艮他霉素中并铺平皿。

                   6.1.4试剂

这里描述的研究中用的大部分抗体是从贝克登·迪金斯(圣乔斯，加州)处购买的。其他试剂是：抗-纤维结合素，抗-肌间线蛋白，抗平滑肌阿尔法肌动蛋白，(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州)；抗-波形蛋白(实验系统公司，瑞利，北卡罗来纳州)，抗-胶原蛋白(凯米康公司，特米库拉，加州)和抗冯威利布兰德因子(精确)。

                    6.1.5增殖检测

为检测成纤维细胞的生长对GM-CSF的反应，用六孔盘培养细胞，每个孔中有5毫升全血中的白细胞。在培养两周以后，这些细胞用以下四种条件之一来处理：没有GM-CSF(对照)，25 U GM-CSF，50 UGM-CSF，100 U GM-CSF(每毫升)。培养基和GM-CSF每周更换。细胞计数是在培养皿上划分一个固定的区域，每周对该区域进行人工计数。每个区域内的成纤维细胞的百分比反映了具有标准成纤维细胞形态学的细胞的数量与该区域全部细胞数量的比值。

                   6.1.6迁移实验

创伤腔被移植到鼠的胁腹部的皮下囊中。创伤腔由一个3厘米长的空心硅橡胶管组成(道-康宁公司)，内含一块高压灭菌的聚乙烯醇海棉(Unipoint公司，NC)。切口被伤口夹封闭，小鼠被监测是否感染。植入一周后，用1cc的注射器和25g的针头经皮抽出创口液体。获得的细胞在DMEM/20％FBS/0.1％艮他霉素中培养。用形态学和荧光染色技术来分析成纤维细胞特异性标志物。

                     6.2.结果

经过2到4周的培养，非分裂和低粘附性的细胞逐渐减少。同时，粘附的、分裂中的细胞的分离团块可以被容易地识别出来。细胞在短期培养中分为形态学上截然不同的两类，一种“圆形”的细胞类型和一种“纺锤形”的成纤维细胞状的细胞类型。细胞荧光图象分析表明这些细胞分为两个亚群。光散射分析表明，圆细胞表现为“小”细胞，而纺锤形细胞表现为“大”细胞。在短期培养中(如1-2周)，圆形细胞类群是由淋巴细胞和有成纤维细胞表型的细胞组成的混合物。在长期培养中，存活的绝大部分细胞都显出间质细胞的表型。

随后，可以在荧光显微镜下直接观察(点状免疫荧光)和细胞荧光图象分析进行细胞表面标志物的免疫荧光分析。两种完全不同的细胞类型，被荧光活性分类法(FACs)进一步分离，纯化和定性。

通过抗体染色，大型的“纺锤形”细胞被确认为一种间质细胞，其表现典型的成纤维细胞标志：即I、III型胶原蛋白、波形蛋白、纤维结合素。这些结果被概括在表一中。依照大小或免疫荧光的细胞分类，以及随后的特异性染色，确认了上述细胞类型和表1中的表型分析。并且，这些细胞显得比外周血白细胞更大和更有颗粒性(图1)。

表一来源于外周血的，大型纺锤形间质细胞表面表构型总结

阳性表达：                         阴性表达：

MHC II类                      T细胞受体(αβ和γδ)

CD 11b                                CD3

CD 11c                                CD4

CD 13                                 CD8

CD 34                                 CD11a

CD 45                                 CD14

波形蛋白                              CD16

纤维结合素                            CD19

I型胶原蛋白                           CD25

III型胶原蛋白                         CD33

                                      CD38

                                      CD44

                                      CD54

                                      CD56

                                    细胞角蛋白

                                冯·威利布兰德因子

                                    肌间线蛋白

                               平滑肌细胞α肌动蛋白

                                    层粘连蛋白

血液携带的间质细胞可以在加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)50U/ml的情况下体外增殖。

在小鼠背部实验性地植入创伤腔。观察到与人类血液携带的间质细胞形态学上一致的鼠类细胞向创伤腔内迁移。

本发明并不局限于实施例中的范围，那些只是对发明单方面的说明。事实上，这里描述和说明的本发明的其他修改，从以下的描述和附图来看，对本领域的技术人员将是显而易见的。这样的修改也包括在权利要求的范围内。

文中的参考文献在此引入作为参考。

Claims (15)

1.分离的哺乳动物血液携带的细胞，其显示

成纤维细胞表面表型标记物，包括波形蛋白、纤维结合素、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白；和

造血干细胞的CD45和CD34表型标记物。

2.细胞组合物，其在药用载体中包含哺乳动物血液携带的细胞，所述细胞显示

成纤维细胞表面表型标记物，包括波形蛋白、纤维结合素、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白；和

造血干细胞的CD45和CD34表型标记物。

3.权利要求2的细胞组合物，其中哺乳动物血液携带的细胞是基本均一的类群。

4.权利要求1或2的分离的哺乳动物血液携带的细胞，其对II类MHC、CD11b、CD11c或CD13也呈阳性。

5.权利要求1的分离的哺乳动物血液携带的细胞，其对T细胞受体αβ和γδ、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD16、CD19、CD25、CD33、CD38、CD44、CD54、CD56、细胞角蛋白、冯·威利布兰德因子、肌间线蛋白、平滑肌细胞α肌动蛋白或层粘连蛋白呈阴性。

6.权利要求2的细胞组合物，其中哺乳动物血液携带的细胞对II类MHC、CD11b、CD11c或CD13呈阳性。

7.权利要求7的细胞组合物，其中哺乳动物血液携带的细胞对T细胞受体αβ和γδ、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD16、CD19、CD25、CD33、CD8、CD44、CD54、CD56、细胞角蛋白、冯·威利布兰德因子、肌间线蛋白、平滑肌细胞α肌动蛋白或层粘连蛋白呈阴性。

8.从外周血中分离哺乳动物血液携带的细胞的方法，所述细胞显示

成纤维细胞表面表型标记物，包括波形蛋白、纤维结合素、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白；和

造血干细胞的CD45和CD34表型标记物；

所述方法包括将混合类群的血液细胞用抗I或III型胶原蛋白和CD34的抗体进行亲和分离。

9.从外周血中分离哺乳动物血液携带的细胞的方法，所述细胞显示

成纤维细胞表面表型标记物，包括波形蛋白、纤维结合素、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白；和

造血干细胞的CD45和CD34表型标记物；

所述方法包括：

(a)用抗T细胞、B细胞、单核细胞和自然杀伤细胞标记物的抗体将造血细胞的混合类群进行反向选择，以收集反向选择的细胞；

(b)在培养基中培养反向选择的细胞，以使能够增殖的细胞增殖；

(c)鉴定既具有成纤维细胞的表面表型标记物又具有造血干细胞表型标记物的反向选择的细胞，其中造血干细胞的表型标记物是CD45和CD34。

10.权利要求8或9的方法，其中首先将细胞的混合类群进行密度梯度离心分离，以得到白细胞级分。

11.权利要求10的方法，其进一步包括鉴定具有成纤维细胞表型标记物和造血干细胞表型标记物的亲和分离细胞的最终步骤。

12.分离的哺乳动物血液携带的细胞在制备促进哺乳动物伤口愈合的药物中的应用，其中所述哺乳动物血液携带的细胞显示

成纤维细胞表面表型标记物，包括波形蛋白、纤维结合素、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白；和

造血干细胞的CD45和CD34表型标记物。

13.权利要求12的分离的哺乳动物血液携带的细胞的应用，其中所述细胞被静脉内施用给哺乳动物。

14.权利要求12的分离的哺乳动物血液携带的细胞的应用，其中所述细胞被局部施用给哺乳动物。

15.权利要求12的分离的哺乳动物血液携带细胞的应用，其中哺乳动物是人。

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