CN108802400A - 一种检测复合物IgA1-α1MG的方法及无创检测肾组织损伤的试剂盒 - Google Patents
一种检测复合物IgA1-α1MG的方法及无创检测肾组织损伤的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测复合物IgA1‑α1MG的方法及无创检测肾组织损伤的试剂盒,涉及生物技术领域,包括:利用抗人α1MG抗体捕获待测样本中的复合物IgA1‑α1MG,获得待测复合物IgA1‑α1MG;向所述待测复合物IgA1‑α1MG中加入标记物标记的抗人IgA1抗体,使标记物标记的抗人IgA1抗体的含量与所述待测复合物IgA1‑α1MG的含量呈正相关;通过检测标记在抗人IgA1抗体的标记物获得待测样品中是否存在复合物IgA1‑α1MG的检测结果,本发明实现了对IgA肾病的检测,填补了本技术领域对IgA肾病检测的空白,打破了本技术领域不能对IgA肾病的组织损伤进行无创检测的技术难题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种IgA肾病检测方法及试剂盒。
背景技术
IgA肾病是世界范围内最常见的一种原发性肾小球肾炎。在我国,IgA肾病 在肾活检原发性肾小球疾病病例中所占比例高达58.2%。IgA肾病最常累及的人 群为青壮年男性;且病程慢性进展,25%至30%的IgA肾病患者在发病后20至 25年内进展至需要肾脏替代治疗,给社会造成极大的疾病负担,此外,目前对 于肾病的检测一般采用创伤性检查的肾活检,对患者伤害较大。
IgA肾病的特征性表现是以IgA为主的免疫球蛋白分子在肾小球系膜区的团 块状沉积。临床观察显示IgA肾病存在极高的肾移植后复发率,接受肾脏移植的 IgA肾病患者有58%的会出现移植肾系膜区IgA的沉积。而另有研究显示接受 系膜区有IgA沉积的供肾的非IgA肾病患者,肾脏移植几周后移植肾上可出现 IgA沉积的减少或消失,因此提示IgA肾病中的致病因素来源于循环IgA分子而 非肾脏本身。
人类IgA分子主要包括IgA1和IgA2两种亚型。来自世界各地不同研究组 的报道均指出IgA肾病中沉积在系膜区的IgA分子主要为IgA1亚型,而非IgA2 亚型。目前,IgA肾病发病机制并不完全清楚,已经明确的是循环中含IgA1分 子的免疫复合物是IgA肾病的致病启动因素。但国内外的研究均发现循环含IgA1 分子的免疫复合物中与IgA1分子结合的包括多种蛋白成分,本发明人前期质谱 检测提示蛋白多达507种,在致病性的含IgA1分子的免疫复合物中,IgA肾病 的具体致病成分仍不明确,也无相应的检测试剂盒。
发明内容
为解决本领域存在的无法对IgA肾病进行无创检测的技术难题,发明人经过 大量研究发现,复合物IgA1-α1MG是IgA肾病的关键致病因子,因此,本发明 通过对样品中的复合物IgA1-α1MG的检测,实现对IgA肾病及肾组织损伤的无 创检测,本发明提供的检测方法及试剂盒不仅能够精准定量循环中致病因子复合 物IgA1-α1MG的浓度水平,还能及时有效的发现患者的肾组织是否存损伤,不 会对患者造成创伤。
为实现本发明的技术目的,本发明第一方面提供一种检测复合物 IgA1-α1MG的方法,包括:
利用抗人α1MG抗体捕获待测样本中的复合物IgA1-α1MG,获得待测复合 物IgA1-α1MG;
向所述待测复合物IgA1-α1MG中加入标记物标记的抗人IgA1抗体,使标记 物标记的抗人IgA1抗体的含量与所述待测复合物IgA1-α1MG的含量呈正相关;
通过检测标记在抗人IgA1抗体的标记物获得待测样品中复合物IgA1-α1MG 的检测结果;
根据检测结果对标记物进行定量,获得复合物IgA1-α1MG的含量。
其中,所述待测样本为血液、尿液。
其中,所述利用抗人α1MG抗体捕获待测样本中的复合物IgA1-α1MG包括:
将至少一株抗人α1MG抗体结合到固相载体上,形成固相抗体;
向所述固相抗体中加入待测样本,充分接触后,使待测样本中的复合物 IgA1-α1MG被固相抗体完全结合,形成待测复合物IgA1-α1MG。
特别是,所述形成固相抗体之前,先将未固定在固相载体上的抗人α1MG 抗体及杂质去除。
特别是,所述形成待测复合物IgA1-α1MG之前,先将未结合到复合物 IgA1-α1MG上的固相抗体及杂质去除。
其中,所述标记物为辣根过氧化物酶。
其中,所述检测标记物的方法为双抗体夹心酶联免疫吸附法。
其中,所述固体载体为微孔板。
为实现本发明的技术目的,本发明第二方面提供无创检测肾组织损伤的试剂 盒,其特征在于,通过对待测样本中的复合物IgA1-α1MG进行定量检测,判断 待测样本是否为肾组织损伤样本,包括:
用于捕获血浆中IgA1-α1MG复合物的包被有抗人α1MG的固体载体;
用于检测并定量IgA1-α1MG复合物的包含有标记物标记的抗人IgA1抗体的 检测体系。
其中,所述肾组织损伤包括但不限于尿蛋白水平增高、肾组织上系膜细胞增 生、节段肾小球硬化、肾小管间质纤维化。
其中,所述固体载体为聚苯乙烯。
其中,所述标记物为生物素和辣根过氧化物酶。
其中,所述检测体系包括洗涤液、稀释液、显色液以及反应终止液。
其中,所述洗涤液为用于清洗多余抗体的洗涤液,包括但不限于浓度百分比 含量为0.05%PBST溶液。
其中,所述0.05%PBST溶液包括:8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4、0.2g KCl、 0.26gKH2PO4、1000ml H2O以及0.5ml Tween-20。
其中,所述稀释液为用于稀释抗体的稀释液,包括但不限于浓度为0.05M的 磷酸盐缓冲对、质量浓度为1%的BSA-PBST溶液。
其中,所述0.05M碳酸盐缓冲液包括:1.08g Na2CO3、2.95g NaHCO3、 900ml H2O。其pH值为9.6。
其中,所述1%的BSA-PBST溶液包括1g BSA和100ml的0.05%PBST溶 液。
特别是,所述浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液用于抗人α1MG抗体的稀释。
特别是,所述质量浓度为1%的BSA-PBST溶液用于血浆样本的稀释。
特别是,所述质量浓度为1%的BSA-PBST溶液用于与生物素反应的亲和素 的稀释。
其中,所述显色液为能够与标记物发生显色反应的溶液,包括但不限于TMB 显色液。
其中,所述反应终止液为浓度为1M的硫酸溶液。
其中,所述1M的硫酸溶液包括27.8ml的浓H2SO4溶液以及500ml H2O。
特别是,所述试剂盒还包括用于确定样本是否为肾组织损伤样本的判断系 统。
其中,所述用于确定样本是否为肾组织损伤样本的判断系统包括:
与酶标仪连接的数据读取单元,用于直接读取酶标仪检测的OD值,获得待 测样品的检测值以及标准样品的检测值;
与数据读取单元连接的数据分析计算单元,用于将测得的标准样品的OD值 形成标准曲线,同时根据形成的标准曲线计算待测样品检测值的浓度水平;
与数据分析计算单元连接的数据判断单元,根据程序设定的阈值对得到的 IgA1-α1MG复合物的浓度水平进行比对,当浓度水平高于阈值,则判断待测样 本为肾组织损伤患者样本,反之,则不是。
其中,所述正常阈值高限为90%健康对照患者的血浆IgA1-α1MG复合物的 浓度水平。
为实现本发明的技术目的,本发明还提供一种将第一方面提供方法应用于肾 组织损伤无创检测的应用。
为实现本发明的技术目的,本发明还提供一种将第二方面的试剂盒用于复合 物IgA1-α1MG检测的应用。
其中,所述肾组织损伤包括但不限于尿蛋白水平增高、肾组织上系膜细胞增 生、节段肾小球硬化、肾小管间质纤维化。
有益效果:
1、本发明提供的检测方法及试剂盒以复合物IgA1-α1MG作为致病因子,实 现了对IgA肾病的肾组织损伤的检测,填补了本技术领域对IgA肾病检测的空 白,打破了本技术领域不能采用无创手段对肾组织损伤检测的技术难题。
2、本发明提供的检测方法及试剂盒不仅能够及时有效的区分和发现IgA肾 病样本,而且能够精准定量循环中致病因子复合物IgA1-α1MG的浓度水平,特 异性好、准确性高(相关性r为0.999)等优点,而且误差小、对检测设备要求低。
附图说明
图1是IgA肾病检测试剂盒标准曲线;
图2是本发明实施例3中确定样本是否为肾组织损伤样本的判断系统;
图3是本发明试验例2中IgA肾病患者级健康志愿者血浆IgA1-α1MG复合 物水平检测结果散点图;
图4是本发明试验例3中IgA肾病患者与健康志愿者的IgA1-α1MG复合物 水平与临床病理表型结果散点图,其中a是IgA1-α1MG复合物水平与肾功能表 型关联结果图;b是IgA1-α1MG复合物水平与蛋白尿水平表型结果散点图;c 是IgA1-α1MG复合物水平与肾组织上系膜细胞增生结果散点图;d是IgA1-α1MG 复合物水平与节段肾小球硬化结果散点图;e是IgA1-α1MG复合物水平与肾小 管间质纤维化结果散点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法,通 常按照常规条件,或按照厂商所建议的条件,未注明具体来源的成分,如无特别 说明,均通过市售获得。
本发明具体实施例中所用溶液的配置:
1、洗涤液的配置
将8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4、0.2g KCl、0.26g KH2PO4、1000ml H2O以及 0.5mlTween-20混合,搅拌均匀后,得到0.05%PBST溶液,该溶液的pH值为 7.4。
2、稀释液的配置
将1.08gNa2CO3、2.95g NaHCO3、900ml H2O混合,搅拌均匀得到0.05M磷 酸盐缓冲对,其pH值为9.6。
将1g BSA和100ml的0.05%PBST溶液混合,得到1%的BSA-PBST溶液。
其中,配置的1%的BSA-PBST溶液还可以作为封闭液使用。
3、反应终止液的配置
将27.8ml的浓H2SO4溶液以及500ml H2O混合均匀后,得到浓度为1M的 硫酸溶液。
实施例1检测复合物IgA1-α1MG的方法
1、包板
将没有标记的抗人α1MG抗体使用0.05M碳酸盐缓冲液稀释至5ug/ml,每 孔100ul,进行包板,使抗人α1MG抗体固定在固相载体上,4℃的温度条件下 孵育过夜;然后使用0.05%PBST,每孔360ul进行洗板,洗涤5次后,使未固定 到固相载体的游离成分被洗去,使用1%BSA-PBST封闭,每孔200ul,25℃孵 育2h,最后使用0.05%PBST洗板,每孔360ul,洗板5次,得到包被有抗人α1MG 抗体的固相载体。
其中,本发明所使用的固相载体可以是市售的任一一种吸附性能好,空白低, 孔底透明度高,各板之间和同一板各孔之间性能相近的固相载体,例如聚苯乙烯 载体。
2.加样
2.1待测样品及标准品的处理
将待测样品(例如在本发明的一个实施例中使用血浆标本作为待测样品)使 用1%BSA-PBST稀释40000倍;同时将标准品梯度稀释为3200倍,6400倍, 12800倍,25600倍,51200倍,102400倍和204800倍,分别加入到包被有抗人 α1MG抗体的固相载体上,血浆中的复合物IgA1-α1MG与固相载体上的抗人 α1MG抗体充分反应,使血浆中的复合物IgA1-α1MG被捕获到固相载体上,每 孔100ul,37℃孵育1h,然后使用0.05%PBST洗板,每孔360ul,洗板5次, 除去未反应的游离成分。
2.2抗体处理及加入
采用生物素biotin标记抗人IgA1抗体,使用1%BSA-PBST对标记的抗人 IgA1抗体稀释100倍,然后加入到固相载体的反应孔中,使标记的抗人IgA1抗 体与固相载体捕获的复合物IgA1-α1MG充分反应,每个反应孔的加入量为 100ul,37℃孵育1h,然后使用0.05%PBST洗板,洗去未反应的游离成分,每孔 360ul,洗板5次;然后加入使用1%BSA-PBST稀释2000倍的亲和素Extra Avidin,亲和素Extra Avidin上标记有辣根过氧化酶,生物素biotin与亲和素Extra Avidin特异性结合,每孔100ul,37℃孵育30min,使用0.05%PBST洗板,洗去 未结合的游离成分,每孔360ul,洗板5次。
3、检测
3.1显色处理
使用比例为1:1的TMB显色液A/B液,加入到固相载体,每孔100ul,25℃ 显色20min,然后加入1M硫酸终止反应,每孔100ul,终止反应;若反应孔中 有复合物IgA1-α1MG,则会使无色的显色剂现蓝色,加终止液变黄,表示待测 样品中存在复合物IgA1-α1MG。反之,则表示待测样品中不存在复合物 IgA1-α1MG。
3.2标准曲线的制作及浓度测定
使用酶标仪检测显色处理后的每个浓度水平的标准品溶液及待测样品溶液 在450或570nm处的OD值,等体积准确进样检测,获得的不同标准品的浓度 检测结果以及待测样品的检测结果,根据获得的不同标准品的浓度检测结果绘制 浓度标准曲线,其中绘制的标准曲线如图1所示,然后根据绘制的标准曲线对待 测样品的检测结果进行定量,得到复合物IgA1-α1MG的浓度水平。
需要说明的是,本发明所称的“孔”即固体载体上的“反应孔”。
实施例2无创检测肾组织损伤的试剂盒
本发明的试剂盒包括:
1、捕获血浆中IgA1-α1MG复合物的捕获体系,包括包被有抗人α1MG的 固体载体,0.05M碳酸盐缓冲液稀释液,0.05%PBST洗涤液和1%BSA-PBST封 闭液。
其中,0.05%PBST溶液包括8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4、0.2g KCl、0.26g KH2PO4、1000ml H2O以及0.5ml Tween-20混合,pH值为7.4。
其中,0.05M碳酸盐缓冲液包括1.08gNa2CO3、2.95g NaHCO3、900ml H2O 混合,pH值为9.6。
其中,1%BSA-PBST溶液包括1g BSA和100ml的0.05%PBST溶液。
2、用于检测IgA1-α1MG复合物的检测体系,包括
1%BSA-PBST溶液,用于稀释待测样品及标准品,或用于稀释亲和素ExtraAvidin,0.05%PBST洗涤液,生物素biotin与亲和素Avidin反应体系,TMB显 色液,A/B液比例为1:1。
其中,1%BSA-PBST溶液与0.05%PBST洗涤液的成分配比均与1相同。
实施例3无创检测肾组织损伤的试剂盒
包括实施例3中的1和2,以及用于确定样本是否为肾组织损伤样本的判断 系统。
进一步的,用于确定样本是否为肾组织损伤样本的判断系统如图2所示,包 括:与酶标仪连接的数据读取单元1,用于直接读取酶标仪检测的OD值,获得 待测样品的检测值以及标准样品的检测值;与数据读取单元1连接的数据分析计 算单元2,用于将测得的标准样品的OD值形成标准曲线,同时根据形成的标准 曲线计算待测样品检测值的浓度水平;与数据分析计算单元2连接的数据判断单 元3,根据程序设定的阈值对得到的IgA1-α1MG复合物的浓度水平进行比对, 当浓度水平高于阈值,则判断待测样本为肾组织损伤患者样本,反之,则不是。
试验例1试剂盒检测
1、试剂盒的剂量-反应曲线的线性
复孔测定试剂盒的标准品(标准品梯度稀释为3200倍,6400倍,12800倍, 25600倍,51200倍,102400倍和204800倍的标准品进行两孔测定),用四参数 进行拟合,标准曲线的线性检测结果如图1所示,拟合度r2为0.99943(>0.9900), 符合要求。
2、试剂盒的准确度
检测不同稀释梯度的参考品,每个稀释梯度参考品检测3次,计算测定结果 的均值M,测定值与靶值的相对偏差(Bias%)均<15.0%,符合要求。
3、试剂盒的精密度
a、分析内精密度:不同稀释梯度的参考品重复检测,本试剂盒的分析内精 密度检测结果显示分析内变异系数(CV)均<8.0%,符合要求。
b、批间精密度:用3个批号的试剂盒分别检测不同稀释梯度的参考品,各 重复10次,本试剂盒的分析间精密度检测结果显示批间变异系数(CV)均 <20.0%,符合要求。
从上述测定的数据可以看出,本发明提供的实施3的检测试剂盒准确度、精 密度等各项质量参数均符合要求。
试验例2 IgA1-α1MG免疫复合物的检测
使用本发明方法及试剂盒3对223例IgA肾病患者和104例健康志愿者的血 浆样本进行IgA1-α1MG免疫复合物的检测,血浆样本的采集方法及采集量均为 常规方法及标准,获得IgA1-α1MG免疫复合物的检测结果,具体检测结果如图 3所示。
根据图3的检测结果可知,IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物水平显著 高于健康志愿者。图中显示了检测的223例IgA肾病患者(IgAN)和104例健 康对照(HC)的血浆IgA1-α1MG复合物水平,其中IgA肾病患者的血浆IgA1-α1MG复合物水平显著高于健康对照。以90%健康对照患者的血浆 IgA1-α1MG复合物水平为正常阈值高限,则IgA肾病患者中有69.1%的患者血 浆IgA1-α1MG复合物水平高于此正常阈值高限,表明本发明方法及提供的试剂盒对IgA肾病患者和健康对照的区分度良好。
试验例3肾组织损伤的检测
采用常规方法(例如肾活检方法)对试验例2的223例IgA肾病患者和104 例健康志愿者的血浆样本进行尿蛋白水平增高、肾组织上系膜细胞增生、节段肾 小球硬化、肾小管间质纤维化检测,检测结果如图4所示。
根据图3的检测结果可知,IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物水平与临 床病理表型关联。a.IgA肾病患者的血浆IgA1-α1MG复合物水平与反映肾脏功 能的指标eGFR呈显著负相关(相关系数=-0.500)。b.IgA肾病患者的血浆 IgA1-α1MG复合物水平与24小时蛋白尿水平(24h UTR)相关。将IgA肾病患 者分为少量蛋白尿(<1克/天),中等量蛋白尿(1-3.5克/天)和大量蛋白尿(>3.5 克/天),可见少量蛋白尿的IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物水平显著低于 中等量和大量蛋白尿IgA肾病患者。c.IgA肾病患者的血浆IgA1-α1MG复合物水平与肾活检组织中肾小球的系膜增生病变(M)相关。将IgA肾病患者分为轻 度系膜增生病变(M0)和重度系膜增生病变(M1),可见重度系膜增生病变的 IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物水平显著高于轻度系膜增生病变IgA肾病 患者。d.IgA肾病患者的血浆IgA1-α1MG复合物水平与肾活检组织中肾小球的 节段硬化病变(S)相关。将IgA肾病患者分为无节段硬化病变(S0)和有节段 硬化病变(S1),可见有节段硬化病变的IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物 水平显著高于无节段硬化病变IgA肾病患者。e.IgA肾病患者的血浆IgA1-α1MG复合物水平与肾活检组织中肾小球的肾小管萎缩/间质纤维化(T)相关。将IgA 肾病患者分为轻度肾小管萎缩/间质纤维化病变(T0),中度肾小管萎缩/间质纤 维化病变(T1)和重度肾小管萎缩/间质纤维化病变(T2),可见重度肾小管萎缩 /间质纤维化病变的IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物水平显著高于中度和轻 度肾小管萎缩/间质纤维化病变IgA肾病患者,并且中度肾小管萎缩/间质纤维化 病变IgA肾病患者血浆IgA1-α1MG复合物水平显著高于轻度肾小管萎缩/间质纤 维化病变IgA肾病患者。
可见,IgA1-α1MG复合物的浓度水平与肾活检的检测结果一致,通过本发 明的实施例2或3提供的试剂盒对患者进行抽血检测得到的IgA1-α1MG复合物 的浓度水平及判断结果,可以准确反映患者的肾组织损伤程度,避免了常规的方 法,例如肾活检对患者的手术创伤,降低了检测的时间成本、费用成本及人力成 本。
Claims (10)
1.一种检测复合物IgA1-α1MG的方法,其特征在于,包括:
利用抗人α1MG抗体捕获待测样本中的复合物IgA1-α1MG,获得待测复合物IgA1-α1MG;
向所述待测复合物IgA1-α1MG中加入标记物标记的抗人IgA1抗体,使标记物标记的抗人IgA1抗体的含量与所述待测复合物IgA1-α1MG的含量呈正相关;
通过检测标记在抗人IgA1抗体的标记物获得待测样品中复合物IgA1-α1MG的检测结果;
根据检测结果对标记物进行定量,获得复合物IgA1-α1MG的含量。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述利用抗人α1MG抗体捕获待测样本中的复合物IgA1-α1MG包括:
将至少一株抗人α1MG抗体结合到固相载体上,形成固相抗体;
向所述固相抗体中加入待测样本,充分接触后,使待测样本中的复合物IgA1-α1MG被固相抗体完全结合,形成待测复合物IgA1-α1MG。
3.一种无创检测肾组织损伤的试剂盒,其特征在于,通过对待测样本中的复合物IgA1-α1MG进行定量检测,判断待测样本是否为肾组织损伤样本,包括:
用于捕获血浆中IgA1-α1MG复合物的包被有抗人α1MG的固体载体;
用于检测并定量IgA1-α1MG复合物的包含有标记物标记的抗人IgA1抗体的检测体系。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述肾组织损伤包括但不限于尿蛋白水平增高、肾组织上系膜细胞增生、节段肾小球硬化、肾小管间质纤维化。
5.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述固体载体为聚苯乙烯;所述标记物为生物素和辣根过氧化物酶。
6.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述检测体系包括洗涤液、稀释液、显色液以及反应终止液。
7.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于确定样本是否为肾组织损伤样本的判断系统。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述用于确定样本是否为肾组织损伤样本的判断系统包括:
与酶标仪连接的数据读取单元,用于直接读取酶标仪检测的OD值,获得待测样品的检测值以及标准样品的检测值;
与数据读取单元连接的数据分析计算单元,用于将测得的标准样品的OD值形成标准曲线,同时根据形成的标准曲线计算待测样品检测值的浓度水平;
与数据分析计算单元连接的数据判断单元,根据程序设定的阈值对得到的IgA1-α1MG复合物的浓度水平进行比对,当浓度水平高于阈值,则判断待测样本为肾组织损伤患者样本。
9.一种将权利要求1所述的方法应用于肾组织损伤无创检测的应用。
10.一种将权利要求3-8任一所述的试剂盒用于复合物IgA1-α1MG检测的应用。
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WO2023216517A1 (zh) * | 2022-05-12 | 2023-11-16 | 深圳市陆为生物技术有限公司 | 计算样品的IgA免疫活动性指数的方法及装置 |
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