CN108785293A - 阿坎酸钙在抗sars冠状病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种针对SARS冠状病毒主蛋白酶的化合物。该化合物为阿坎酸钙，对SARS冠状病毒主蛋白酶具有显著的抑制活性，因此本发明提供的化合物有望成为冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂。

Description

阿坎酸钙在抗SARS冠状病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及酶学及药学的技术领域，具体说是阿坎酸钙在抗SARS冠状病毒感染中的应用。

背景技术

SARS冠状病毒属冠状病毒科，病毒体含单股正链RNA分子.基因组全长为29727个核苷酸，具有典型冠状病毒的11个开放读码结构分别编码纤突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、基质蛋白(M)、复制酶(Rep)及核衣壳蛋白(N)。主要结构蛋白和复制酶基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致，在5’和3’末端含非常短的非翻译区。2003-04-12，加拿大科研人员率先公布了全球首份SARS冠状病毒基因组序列图谱，4月14日，美国科学家也宣布绘制出SARS冠状病毒基因组序列图。4月16口WHO正式宣布.确认冠状病毒的一个变种是引起SARS的病原体。SARS病毒在外界的生存能力比预想的要强。根据研究结果得知，在人体常见的3种排泄物(痰、粪便、尿液)和血液中，SARS病毒能长时间保持活力。虽然SARS目前没有大规模的爆发，但是其治疗药物至今也没有问世。因此，寻找SARS有效的治疗药物仍是一件具有重大意义的事。

发明内容

为了解决现有技术中用于治疗SARS冠状病毒感染的药物疗效不佳的问题，本发明提供了阿坎酸钙在SARS冠状病毒感染中的应用。

本发明提供了针对以SARS冠状病毒为例的冠状病毒主蛋白酶的抑制剂，抑制剂为阿坎酸钙。

本发明所涉及阿坎酸钙购买于topscience公司。通过设立阴性对照，发现阿坎酸钙对以SARS冠状病毒为例的冠状病毒主蛋白酶都有很好的抑制活性，因此这一类化合物有望作为抑制以SARS冠状病毒为例的冠状病毒主蛋白酶的潜在药物。

本发明提供一种预防或治疗含有冠状病毒主蛋白酶感染的药物，其活性成分为阿坎酸钙，该药物包含上述含有阿坎酸钙以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明提供了针对以SARS冠状病毒为例的冠状病毒主蛋白酶的抑制剂，这种抑制剂为阿坎酸钙。阿坎酸钙对以SARS冠状病毒为例的冠状病毒主蛋白酶活性具有显著的抑制效果。

附图说明

图1为阿坎酸钙对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制作用示意图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明：

本发明采用的SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化等方法步骤及化合物筛选方法参考文献方法(Rao,Z.H.et al.,PNAS,2003,100,13190-13195)，筛选方法是饶子和等在CN101418334A中公开的筛选方法。SARS冠状病毒主蛋白酶的活性测定采用纯度大于95％的荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2作为底物；荧光强度测定的仪器为FluoraskanAscent荧光仪(Thermo),激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm；

蛋白缓冲液组分为50mM Tris,pH＝7.3,1mM EDTA；用缓冲液配置冠状病毒主蛋白酶(终浓度1μM),加入以DMSO溶解的抑制剂(终浓度为10μM),1200rpm震荡15s，30℃孵育3min,迅速加入荧光底物MCA-AVLQSGFRK(DNP)K,底物浓度为20μM，1200rpm震荡5s每2s记录一次荧光读数，共测定150个点。阴性对照为不加抑制剂，其他实验条件均相同。

以时间为X轴，荧光值为Y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据荧光强度以及反应时间，采用GraphPad Prism5软件分析前20s的酶促反应的速率。设定V0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，Vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性Ra(Residual Activity,Ra)(Vi/V0)以及抑制率Ir(Inhibition Rate,Ir)(1-Vi/V0)。

对于剩余活性<20％的化合物进行复筛，排除假阳性的可能。对于剩余活性低于15％的化合物，设计荧光淬灭实验。综合考虑化合物的剩余活性百分率和荧光淬灭率就可以判断化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制效果。因为该体系主要是通过荧光强度筛选，所以，当有荧光的化合物或者是与MCA类似的化合物都会对体系产生干扰。另外，很多Dnp类似的结构会淬灭体系的荧光而造成假阳性，为了排除假阳性结果，我们采用先将蛋白酶与荧光底物反应一段时间，让体系荧光达到最大值Q1、再在体系中加入与实验组等量的化合物，并检测体系的荧光值大小为Q2。将两者的荧光值按照公式计算得出荧光淬灭率Qr((Qr＝Q1-Q2)/Q2*％)。当荧光淬灭率高于20％为假阳性结果需排除，当荧光淬灭率低于20％为阳性结果。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明涉及药学的技术领域，具体说是阿坎酸钙在以SARS冠状病毒为例的冠状病毒感染中的应用，阿坎酸钙在抑制SARS冠状病毒主蛋白酶时候Ir>85％以上,在制备以SARS冠状病毒为例的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力。

Claims (5)

1.阿坎酸钙在抗SARS冠状病毒感染中的应用，其特征在于：阿坎酸钙的结构式为：

2.根据权利要求1所述的阿坎酸钙在制备治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的阿坎酸钙在制备治疗冠状病毒感染药物中的应用。

4.一种治疗冠状病毒感染的药物，其特征在于它包含权利要求书1所述的阿坎酸钙以及一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。

5.根据权利要求书4所述的治疗冠状病毒感染的药物，其特征是它是含有所述药物的注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。