CN108779085B - 在通过抑制cyp17a1和cyp19a1治疗癌症中具有应用的药效团、化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用作药物的化合物，所述化合物通过抑制CYP17A1酶和CYP19A1酶起作用。所述化合物在癌症特别是前列腺癌和乳腺癌的治疗中具有特别应用。所述化合物具有下式:[化学式1]
Figure DDA0001685058010000011
其中：R独立地选自：任选取代的芳酰胺；任选取代的烷基芳酰胺；任选取代的芳基甲酰胺；任选取代的氰基哌啶；任选取代的氧代哌啶；任选取代的N‑(吡啶‑3‑基)；任选取代的吡啶‑3‑基；任选取代的吡唑‑4‑甲酰胺；任选取代的嘧啶‑4‑基甲酰胺；任选取代的嘧啶‑4‑基甲酰胺；任选取代的1H‑吡咯‑2‑基甲酰胺；任选取代的吗啉甲酰胺；任选取代的1H‑吲唑‑3‑基甲酰胺；任选取代的5‑氰基哌啶‑3‑基甲酰胺；任选取代的喹啉‑7‑基；任选取代的吡嗪‑2‑基甲酰胺；任选取代的1H‑1,3‑苯并二唑‑6‑甲酰胺；以及任选取代的3‑氧代‑3,4‑二氢‑2H‑1,4‑苯并噁嗪‑7‑基甲酰胺；每个R1、R2、R3、R4、R5独立地选自：H；OH；卤素原子；OCH3；以及NH2；并且X独立地选自O、H和OH。要求保护一些化合物本身，并且本发明还包括其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。

Description

在通过抑制CYP17A1和CYP19A1治疗癌症中具有应用的药效 团、化合物和方法
技术领域
本发明涉及抑制催化雄激素生物合成的关键酶。其尤其涉及CYP17A1和CYP19A1酶的有效和选择性非甾族抑制剂的设计、鉴定和生物学活性。CYP17A1和CYP19A1是甾类激素生物合成的重要酶，并且对这些酶的抑制被用于治疗雄激素依赖性癌症如前列腺癌和乳腺癌。
出于本发明的目的，使用活性化合物的训练集开发了3D-QSAR药效团模型。还使用了灵活的对接技术。开发的药效团模型是本发明的一个方面。本发明还提供了对所讨论的酶展现抑制活性的各种化合物。这些化合物提供了可以被进一步精制以用于抑制癌症细胞增殖的组合物和方法中，以及预防或治疗癌症的方法中的决选名单。本发明还提供了使用药效团来筛选对所讨论的酶展现抑制活性的化合物的方法。
定义
“CYP17A1”：除非上下文另有说明，此术语在本说明书中用于指CYP17A1酶而不是其编码基因(细胞色素P450，家族17，亚家族A，多肽1)。因此，术语CYP17A1是指细胞色素P45017A1，也称为甾体17-α-单加氧酶、17α-羟化酶、17,20-裂解酶和/或17,20-碳链裂解酶。
“CYP19A1”：除非上下文另有说明，此术语在本说明书中用于指CYP19A1酶(也称为芳香酶)而不是其编码基因(细胞色素P450，家族19，亚家族A，多肽1)。
“双重抑制剂”意思是CYP17A1和CYP19A1两者的抑制剂。
“3D-QSAR”意思是三维定量结构-活性关系。
“包括/包含”当在本说明书中使用时被用来指定所陈述的特征、整体(integer)、步骤或部件的存在，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整体、步骤或部件或其组。
化合物的参考数字和字母：本说明书所附的权利要求书被认为是本公开的整体部分。权利要求书中所示的参考数字和字母(例如“[化合物1；Z44426883]”)用于促进权利要求书的整体与说明书中描述的化合物的相关性，但并非旨在以任何方式限制权利要求书的语言，除非相反情况从上下文显而易见。
R基团
叙述的结构以在它们键合到适用的化学支架上之前将存在的形式存在。例如，在其中R基团将通过涉及NH2部分的亲核取代键合至其支架的情况下，R基团被叙述为其在所述取代反应之前(即，在从所述NH2部分失去H之前)将存在的形式。
背景技术
大多数前列腺癌和乳腺癌是激素依赖性的。前列腺癌(PC)对雄激素信号通路的依赖已被认识到达数十年，但PC仍然是西方社会男性死亡的主要原因。
当前列腺癌细胞响应于雄激素甾体而增殖时，CYP17A1抑制是防止雄激素合成和治疗致死的转移性去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的策略。
CYP17A1酶和CYP19A1酶具有相似的催化循环。它们催化甾类激素的生物合成。非甾类和甾类治疗策略是已知的。沿着雄激素合成途径作用的已知CYP17A1抑制剂包括酮康唑、阿比特龙、Galeterone(TOK-001或VN/124-1)和Orteronel(TAK-700)。
CYP17A1酶催化参与甾体生物合成的两种主要途径，即17α-羟化酶和17,20-裂解酶活性。在第一步骤中，底物孕酮和孕烯醇酮在所述底物的17α-位置羟基化，以分别形成17α-羟孕酮和17α-羟基孕烯醇酮。在第二步骤中，17,20-裂解酶活性破坏17α-羟孕酮的C17-C20键以产生脱氢表雄酮(DHEA)。CYP17A1抑制剂的主要优点是它们阻碍睾丸和肾上腺中的雄激素生物合成以及癌细胞中细胞内雄激素的形成。
CYP19A1酶催化雄烯二酮的三步A环芳构化以得到雌酮。CYP19A1还催化将睾酮氧化成雌二醇。第一步骤是形成19-羟基睾酮，所述19-羟基睾酮继而被氧化成19-氧睾酮并且随后被氧化成雌二醇，类似于雄烯二酮分解代谢成雌酮。
经历CYP19A1催化的三步芳构化的另一甾体底物是16α-羟雄烯二酮。该氧化的最终产物是16α-羟雌酮。
有大量证据表明，乳腺癌(BC)组织含有负责从循环前体局部生物合成雌激素的所有酶，并且已经很好地证实，增加对局部雌激素的暴露是乳腺癌发生和生长的重要风险因素。因此CYP19A1抑制可用作治疗乳腺癌的策略。
除CYP17A1和CYP19A1外，参与甾体生物合成的CYP450酶的组还包括以下项：参与胆固醇侧链断裂的CYP11A1、参与甾体-21-羟化酶活性的CYP21、参与甾体-11-β-羟化酶活性的CYP11B1、以及参与醛固酮合酶活性的CYP11B2。然而，抑制CYP11A1和CYP21不适合作为药物靶标，因为前者影响所有甾体激素的生物合成，而后者参与糖皮质激素和盐皮质激素的生物合成。
已知的甾体抑制剂醋酸阿比特龙抑制CYP17A1，并且已显示为可改善CRPC的总体存活率。然而，阿比特龙是与许多靶标相互作用的‘混杂’药物，会导致副作用和毒性。它没有被很好地吸收并且其药代动力学不是最佳的。
也已经开发了具有类似抑制特性的其他药物。关于对本领域现有技术状态的综述，可以参考在本专利说明书的末尾处陈述的引用PTL1至PTL5和NPL1至NPL7。
尽管近期在此领域中取得了进展，但迫切需要新的治疗策略，并且需要开发新的CYP17A1和CYP19A1抑制剂作为附加防线。影响不同点处的雄激素合成和信号传导的多重标靶策略也是有利的；因此需要双重抑制剂(即可以抑制两种或更多种酶的活性的化合物，例如能够抑制CYP17A1和CYP19A1两者的化合物)。
发明内容
本发明涉及药效团的开发，由该药效团来鉴定和合成可用于抑制CYP17A1和CYP19A1的化合物。
本发明的各个方面在两个主标题下进行讨论，第一是涉及药效团的那些方面，并且第二是涉及已经被鉴定的化合物和它们作为药物的应用的那些方面。
药效团
根据本发明的第一方面，提供了一种用于设计、筛选和鉴定CYP17A1和CYP19A1酶的抑制剂的药效团，所述药效团在分子内具有以下原子空间排列：
·两个氢键受体(在此称为A1和A3)；
·两个氢键供体(在此称为D4和D5)；以及
·两个芳香环(在此称为R10和R11)；
其中：
·(A1)和(A3)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000021
·(A1)和(D4)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000022
·(D4)和(R10)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000023
·(D4)和(A3)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000024
·(D4)和(R11)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000025
·(D4)和(D5)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000026
·(R10)和(A3)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000027
·(R10)和(R11)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000028
·(R10)和(A1)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000029
·(R10)和(D5)的中心之间的距离为
Figure GDA00034891952200000210
·(R11)和(D5)的中心之间的距离为
Figure GDA00034891952200000211
·(R11)和(A3)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000031
·(R11)和(A1)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000032
·(D5)和(A3)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000033
以及
·(D5)和(A1)的中心之间的距离为
Figure GDA0003489195220000034
药效团可以包括具有至少一个稠合的联芳基和/或四芳基基团的杂环化合物。
药效团可以包含选自下列的特征：
苯并噁嗪、苯氧基苯甲酰胺、甲酰胺、苯甲酰基-氨甲酰基、甲基噻唑、苯基甲基-硫代噻唑、丁酰氨基苯基、氨磺酰基苯氧基、苯基甲氧基丙酰胺、以及氧杂四环十七碳己烯(oxatetra cycloheptadeca hexaene)。
药效团模型可以包含具有如附图的图1至图3所示的构造的假设AADDRR.860，其中：
A代表氢键受体；
D代表氢键供体；并且
R代表芳香环。
根据本发明的进一步方面，提供了所述药效团模型AADDRR.860作为3D-QSAR药效团模型来搜索新化学实体(NCE)的药效团特征方面的相似性和/或筛选和鉴定待用于CYP17A1和CYP19A1抑制的候选化合物的用途。
以下表1列出了所述药效团模型AADDRR.860的统计数据。
[表1]3D-QSAR药效团模型的统计数据：
Figure GDA0003489195220000035
优选的3D-QSAR药效团模型为在使用留n交叉验证方法离群值去除22个结构后具有R20.9228和Q20.9400的AADDRR.860。
优选的药效团模型被映射到参考配体N-{4'-[1-羟基-1-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙基][1,1'-联苯]-3-基}乙酰胺(下表4中的化合物7；表4A中的17[12])，该参考配体拟合该模型的拟合度评分为3.0。这种比对象征着参考配体中存在的特征与药效团模型的良好匹配。
因此，在本发明的进一步方面中，提供了N-{4'-[1-羟基-1-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙基][1,1'-联苯]-3-基}乙酰胺在作为设计、筛选和鉴定选自CYP17A1和CYP19A1的酶的抑制剂的方法中的参考配体的训练集中的用途。
在某些实施方式中，本发明提供了一种用于设计、筛选和鉴定用于CYP17A1抑制的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含类药分子的候选化合物的数据库；
(b)生成所述候选化合物的3D描述符；
(c)预先确定一组过滤标准并将所述生成的描述符与所述过滤标准进行比较，从而选择和拒绝所述数据库内分别满足或不满足所述标准的候选化合物；
(d)提供如本文所述的药效团模型并将所述选择的化合物对所述模型进行拟合，从而鉴定表现出满足最佳拟合阈值的拟合的化合物；以及
(e)预测满足所述最佳拟合阈值的所述化合物的活性值。
根据本发明的进一步方面，提供了一种用于设计、筛选和鉴定用于抑制CYP17A1和/或CYP19A1的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)编译训练集和测试集，每个此类集合包含已知CYP17A1抑制的化合物(所述训练集可包含约105种此类化合物)；
(b)生成所述训练集中的每种化合物的3D构象异构体的数据集；
(c)将所述训练集的每种化合物与观察到的CYP17A1抑制的pIC50值相关联；
(d)由步骤(b)中的所述构象异构体的数据集产生一组药效团假设；
(e)通过在训练和测试数据集中建立关于拟合度评分在2.5至3.0的范围内(包含端值)(优选约3.0)的参考配体与药效团假设的比对成本，来计算在步骤(b)中产生的每个构象异构体的CYP17A1抑制活性；
(f)参考本发明的药效团，查找至少一种待筛选的所述候选化合物的拟合度评分；
(g)计算训练集和测试集中每个药效团假设的回归系数；以及
(h)针对训练集和测试集两者，分别选择具有R2(范围为0.92-0.99)和Q2(范围为0.90-0.99)的最佳拟合模型。
来自所述参考配体的训练和测试数据集中的任何化合物(配体)的均方根偏差(RMSD)可有利地设定为
Figure GDA0003489195220000041
根据本发明的又进一步方面，提供了一种用于设计、筛选和鉴定CYP17A1抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)编译已知对于CYP17A1具有pIC50>7.00的化学上不同的活性配体(优选已知具有pIC50>7.54，即IC50>29nM的那些)的数据集；
(b)生成所述数据集中的所述活性配体的可能互变异构/电离状态(通常在约pH7.4处)、立体异构体和构象异构体(“构象”)的一组三维结构并编译包含所述构象的构象数据集；
(c)通过识别每个所述构象中的药效团特征并将它们映射到所述构象中的特定位置来建立药效团部位，所述特征包括选自下列的特征：氢键受体(A)、氢键供体(D)、带负电荷的基团(N)、带正电荷的基团(P)、疏水性基团(H)和芳环(R)；
(d)通过执行对与所述构象数据集对应的常见药效团的搜索来查找多个药效团假设；所述搜索跨越呈现有所述药效团部位的药效团变体；
(e)通过评估构象数据集内构象的相对构象能量来对所述多个药效团假设进行评分，使得所述构象拟合拟合度评分在2.5至3.5的范围内(优选＝约3.0)的所述假设，由此从构象数据集选择参考配体；
(f)建立QSAR药效团模型；对于待映射到药效团上的每种化合物，此步骤通常包括将所述化合物转化成三维构型并将所有其构象与能量存储在适当的计算软件中，所述计算软件可以随后被操作以执行计算，所述计算比较正被映射的化合物的三维构象异构体与具有实验活性的药效团；
(g)随机地或准随机地选择多个结构以包括训练集和测试集来验证所述模型，所述选择过程包括(i)通过指定待包括在训练集中的结构的百分比并从现有数据集中随机或准随机地选择所述指定百分比的结构并将它们分配给训练集，来针对所述训练集选择配体的随机或准随机分数；以及(ii)将现有数据集中的其余结构分配给测试集。
(h)制备含有类药分子的全原子3D结构的3D结构数据库，所述类药分子具有符合适用于潜在类药分子的标准的分子特性，所述数据库可经搜索以与所述QSAR药效团模型匹配；
(i)生成所述3D结构的互变异构体和/或电离状态，并从所述3D结构数据库中去除高能互变异构和/或电离状态；
(j)通过筛选所述数据库来在所述3D结构数据库内搜索与所述QSAR药效团模型的匹配，从而生成命中(hit)的匹配集合；
(k)通过几何优化来选择具有所述命中的低能构象异构体并进行所述低能构象异构体的构象搜索；
(l)使用来自所述几何结构优化和构象搜索的命中的输出文件作为配体的来源以作为输入(“输入配体”)；
(m)由x射线晶体结构数据库制备酶；
(n)进行虚拟筛选以执行刚性受体-柔性配体与来自所述3D结构数据库的类药分子的对接来作为用于选择所述类药分子的子集的过滤标准，其中对接评分被用作所述类药分子与所述制备的酶的亲和性的定量测量；以及
(o)对所述类药分子的子集进行诱导拟合对接(IFD)，并且编译在所述IFD下表现出拟合的所述分子的数据集以充当潜在的CYP17A1和/或CYP19A1抑制剂的数据集。
该方法可以包括以下子步骤：
(a)有利地，部位点的数量可以被选择为6，优选匹配所述数据集中最有活性的结构的活性组(active group)中的4个(并且对假设的匹配可以通过匹配所述假设中的所有所述6个部位点来建立)。
(b)药效团特征的可用参数可设定如下：A＝2、D＝2、H＝2并且R＝3。
(c)选择用于搜索的假设可以是AADDRR.860。
(d)参考配体可包含N-{4’-[1-羟基-1-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙基][1,1’-联苯]-3-基}乙酰胺(表4中的化合物7；表4A中的17[12])，其是训练集的部分并且也可以在图2至图4中看到。
(e)选择低能构象异构体的步骤可以基于小于0.5kcal/mol的相对势能(potentialenergy)阈值。
(f)由x射线晶体结构制备酶的步骤可以包括针对卟啉的Fe选择+3的氧化态。
(g)虚拟筛选步骤可以包括高通量虚拟筛选工作流程(HTVSW)。
化合物
在进一步方面，本发明提供了在下表2和表2A中列出用作药物的化合物。所述化合物中的若干种是CYP17A1和/或CYP19A1的抑制剂，并且因此在治疗癌症中具有应用，典型地(i)前列腺癌和/或(ii)乳腺癌。所述化合物中的一些本身也被理解为新颖和有创造性的。
[表2]用于治疗前列腺癌和乳腺癌的CYP17A1和/或CYP19A1的抑制剂：
Figure GDA0003489195220000051
Figure GDA0003489195220000061
Figure GDA0003489195220000071
Figure GDA0003489195220000081
Figure GDA0003489195220000091
Figure GDA0003489195220000101
(关键：首字母缩略词“DS”表示对接评分并涉及结合能量。)
应该注意，表2中的五(5)种化合物仅为CYP17A1抑制剂，四(4)种仅为CYP19A1抑制剂，并且四(4)种为双重抑制剂，即CYP17A1和CYP19A1两者的抑制剂。双重抑制剂是化合物7、10、12、13。
因此，在进一步方面，本发明提供了双重抑制剂，所述双重抑制剂是用于直接抑制CYP17A1酶和CYP19A1酶两者的化合物，所述化合物选自由表2中的化合物7、10、12、13(列“编号”)。
在进一步方面，本发明提供了用于直接抑制CYP17A1的化合物，所述化合物选自由表2中列出的化合物1、2、3、6、7、9、10、12、13(列“编号”)。
在又进一步方面，本发明提供了用于直接抑制CYP19A1的化合物，所述化合物选自由表2中列出的化合物4、5、7、8、10、11、12、13(列“编号”)。
应该理解的是，药学上优选的分子将是具有有利的结合亲和力以及对于靶标酶(CYP17A1或CYP19A1)的抑制的低IC50值的那些分子。有利的是，它们还应该显示出关于抑制代谢所需酶的高IC50值。
从表2可以看出，结构7、8、10、11、12、13显示出对CYP19A1的最低IC50值(亚微摩尔抑制效能水平)。
结构1、2、3、6、7、9、10表现出微摩尔水平的CYP17A1抑制效能。
还测试了表2中的化合物对代谢酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的抑制。得到的IC50值列于表2中。结构1、2、3、4、11和13抑制多种CYP450同种型，并且因此不能与这些同种型的抑制剂共同施用，以防止药物间相互作用。
对表2中的分子进行的毒性研究表明，结构5、6、7、8、9、10和12具有优异的安全性，并且结构1、2、3、4、11和13具有相当好的安全性。
结构1、2、3、4、5、6和9具有不同的化学支架。结构7至13共享共同的化学支架(化合物8至13是母体化合物7的衍生物)。
除了表2中的化合物之外，如下表2A中所示开发了化合物12的一系列进一步衍生物。
[表2A]作为用于治疗前列腺癌和乳腺癌的CYP17A1和/或CYP19A1的另外的抑制剂的化合物Z2234185123(表2中的化合物12)的衍生物：
Figure GDA0003489195220000102
Figure GDA0003489195220000111
Figure GDA0003489195220000121
Figure GDA0003489195220000131
Figure GDA0003489195220000141
[表2B]CYP17A1和/或CYP19A1的抑制剂(来自表2的化合物)的进一步性质：
Figure GDA0003489195220000142
从上面表2和表2A的考虑，将可以看出，本发明的进一步方面提供了用作药物的化合物，每种所述化合物具有下式：
[化学式1]
Figure GDA0003489195220000151
其中：
R独立地选自：任选取代的芳酰胺(arylamide)；任选取代的烷基芳酰胺；任选取代的芳基甲酰胺；任选取代的氰基哌啶；任选取代的氧代哌啶；任选取代的吡啶-3-基；任选取代的吡唑-4-甲酰胺；任选取代的嘧啶-4-基甲酰胺；任选取代的嘧啶-4-基甲酰胺；任选取代的1H-吡咯-2-基甲酰胺；任选取代的吗啉甲酰胺；任选取代的1H-吲唑-3-基甲酰胺；任选取代的5-氰基哌啶-3-基甲酰胺；任选取代的喹啉-7-基；任选取代的吡嗪-2-基甲酰胺；任选取代的1H-1,3-苯并二唑-6-甲酰胺；任选取代的3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基甲酰胺；
Figure GDA0003489195220000152
Figure GDA0003489195220000161
其中至化学式1的附接点在每种情况下由星号(*)指示；
每个R1、R2、R3、R4、R5独立地选自由：H；OH；卤素原子；OCH3；以及NH2；并且
X独立地选自H；OH和＝O；
及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。
R可以独立地选自：
[表R]化学式1的R基团：
Figure GDA0003489195220000162
Figure GDA0003489195220000171
其中至化学式1的附接点在每种情况下由星号(*)指示；
用作药物的化合物可以选自上面表2和表2A中公开的那些。
表2和表2A的化合物，和/或如由化学式1限定的化合物，以及它们的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和/或前药可以被应用以用于治疗癌症，特别是前列腺癌和乳腺癌。
本发明还提供了所述化合物、盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和/或前药在制造用于治疗癌症——特别是前列腺癌和乳腺癌——的药物中的用途。
在进一步方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向需要其的人施用治疗有效量的表2和表2A中公开的化合物和/或如由化学式1限定的化合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物或前药；或含有这些实体中的任何一种的药学上可接受的组合物。此方法可以进一步包括以下步骤：在所述施用步骤之前测试人以确定所述人是否患有癌症。
在本发明的进一步方面，提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向已经被鉴定为患有此类癌症的患者施用表2和表2A中公开的化合物和/或如由化学式1限定的化合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物或前药；或含有这些实体中的任何一种的药学上可接受的组合物。此方法可以进一步包括以下步骤：测试患者以鉴定患有癌症的患者。
在本发明的又进一步方面，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：选择患有此类癌症的患者，以及向所述选择的患者施用治疗有效量的表2和表2A中公开的化合物和/或如由化学式1限定的化合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物或前药；或含有这些实体中的任何一种的药学上可接受的组合物。此方法可以进一步包括以下步骤：测试患者以确定患者是否患有癌症。
癌症可以是前列腺癌或乳腺癌。
根据本发明的进一步方面，提供了抑制需要其的受试者中雄激素活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的表2和表2A中公开的化合物和/或如由化学式1限定的化合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物或前药；或含有任意实体的药学上可接受的组合物。
在本发明的又进一步方面，提供了所谓的双重抑制剂，所述双重抑制剂是用于直接抑制CYP17A1酶和CYP19A1酶两者的化合物，选自以下表2化合物：[化合物7；Z1567948782]；[化合物10；Z2234175518]；[化合物12；Z2234185123]；[化合物13；Z518027752]；及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。
本发明的进一步方面提供了用于直接抑制CYP17A1酶的化合物，所述化合物选自以下表2化合物：[化合物1；Z44426883]；[化合物2；Z92489215]；[化合物3；Z220306370]；[化合物6；Z51102986]；[化合物7；Z1567948782]；[化合物9；Z2234084128]；[化合物10；Z2234175518]；[化合物12；Z2234185123]；[化合物13；Z518027752]；及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。
本发明的进一步方面提供了用于直接抑制CYP19A1酶的化合物，所述化合物选自以下表2化合物：[化合物4；Z225980484]；[化合物5；Z854502162]；[化合物7；Z1567948782]；[化合物8；Z2230799627]；[化合物10；Z2234175518]；[化合物11；Z2234175520]；[化合物12；Z2234185123]；[化合物13；Z518027752]；及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。
如上所述，使用药效团模型鉴定的化合物中的一些本身被认为是新颖的和有创造性的。
因此，化合物被提供为具有下式：
[化学式1]
Figure GDA0003489195220000181
其中：
R独立地选自：任选取代的芳酰胺；任选取代的烷基芳酰胺；任选取代的芳基甲酰胺；任选取代的氰基哌啶；任选取代的氧代哌啶；任选取代的吡啶-3-基；任选取代的吡唑-4-甲酰胺；任选取代的嘧啶-4-基甲酰胺；任选取代的嘧啶-4-基甲酰胺；任选取代的1H-吡咯-2-基甲酰胺；任选取代的吗啉甲酰胺；任选取代的1H-吲唑-3-基甲酰胺；任选取代的5-氰基哌啶-3-基甲酰胺；任选取代的喹啉-7-基；任选取代的吡嗪-2-基甲酰胺；任选取代的1H-1,3-苯并二唑-6-甲酰胺；以及任选取代的3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基甲酰胺；
Figure GDA0003489195220000182
Figure GDA0003489195220000191
其中至化学式1的附接点在每种情况下由星号(*)指示；
每个R1、R2、R3、R4、R5独立地选自：H；OH；卤素原子；OCH3；以及NH2；并且
X独立地选自H；OH和＝O；
前提条件是所述化合物不选自下列：
·2-氯-N-(3-{[(6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]甲基}苯基)苯甲酰胺(分子式：C22H17Cl2N3O3)[化合物7；Z1567948782；CAS注册号：1445723-38-5]；
·7-[[[3-(3-吡啶)苯基]甲基]氨基]-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮[CAS注册号：1797677-20-3]；或者
·2-氯-N-[3-[[(3,4-二氢-3-氧代-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]甲基]苯基]苯甲酰胺[CAS注册号：1832317-56-2]。
还涵盖所限定化合物的盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。
根据本发明的此方面的化合物可以选自：
(来自表2)：[化合物8；Z2230799627]；[化合物10；Z2234175518]；[化合物11；Z2234175520]；
[化合物12；Z2234185123]；以及[化合物13；Z518027752]；以及
(来自表2A)：[化合物12.8；Z2670000119]；[化合物12.9；Z2670000121]；[化合物12.10；Z2670000123]；[化合物12.11；Z2670000126]；[化合物12.12；Z2670000128]；[化合物12.13；Z2670000131]；[化合物12.14；Z2670000141]；[化合物12.15；Z2670000145]；[化合物12.16；Z2670000147]；[化合物12.17；Z2670000133]；[化合物12.18；Z2670000134]；[化合物12.19；Z2670000137]；[化合物12.20；Z2670000139]；[化合物12.21；Z2670000151]；[化合物12.22；Z2670000158]；[化合物12.23；Z2670000160]；[化合物12.24；Z2670000163]；[化合物12.25；Z2670000382]；[化合物12.26；Z2670000388]；[化合物12.27；Z2670000392]；以及[化合物12.28；Z2670000395]。
本发明还提供了选自下列的化合物：
·2-氨基-3-甲基苯甲酸2-(4-氨磺酰基苯氧基)乙酯(分子式：C16H18N2O5S)[化合物4；Z225980484]；以及
·N-(3-{[氨甲酰基(苯基)甲基]氨基}苯基)-2-甲氧基丙酰胺(分子式：C18H21N3O3)[化合物5；Z854502162]；
及其盐、溶剂化物、水合物、初级代谢物和前药。
本文公开的化合物和组合物可以被配制以用于作为固体、粉末、片剂、胶囊、混悬剂、乳液和/或无菌溶液施用至患者。它们还可以被配制以用于通过肠胃外途径引入，例如借助于注射、栓剂、局部递送或吸入。本文公开的治疗方法可以同样包括相似的施用模式。
在又进一步方面，本发明提供了用作药物的化合物，无论何时所述化合物已通过实施本文所述的用于设计、筛选和/或鉴定选自CYP17A1和CYP19A1的酶的抑制剂的方法而被鉴定。
附图说明
为了更好地理解本发明，并且为了显示如何实现本发明，现在将参照附图通过非限制性示例来描述本发明的实施方式，其中：
图1
[图1]示意性地示出了优选的药效团假设或模型AADDRR.860，示出了其距离和角度。名称的AADDRR部分是指变体，而860是指假设的最大数量，这对于数据集中的高活性分子是独特的。
图2
[图2]示意性地示出了覆盖到优选的参考配体即N-{4’-[1-羟基-1-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙基][1,1’-联苯]-3-基}乙酰胺(表4中的化合物7；表4A中的17[12])上的优选药效团模型(假设AADDRR.860)的距离。
图3
[图3]示意性地示出了覆盖到优选参考配体上的优选药效团模型(假设AADDRR.860)的键角。
图4
[图4]示意性地示出了映射到药效团假设AADDRR.860上的优选参考配体的“干净”图示，其中为清楚起见去除了距离和键角。
图5
[图5]示意性地示出了对经鉴定的潜在CYP17A1抑制剂(对应于表2中列出的所选化合物)的对接筛选和配体相互作用图(LID)。
图6
[图6]示意性地示出了对经鉴定的潜在CYP19A1抑制剂(对应于表2中列出的所选化合物)的对接筛选和配体相互作用图(LID)。
图7
[图7]示意性地示出了用于模型验证的单独参考配体TOK-001(Galeterone)的原生对接姿势(docking pose)。
图8
[图8]示意性地示出了药效团假设AADDRR.860的pIC50(估计对照实验)的验证图。QSAR模型对应于具有3个潜在变量的PLS模型。左手绘图针对训练集(R20.9228)，而右手绘图针对测试集(Q20.9400)。
图9.1
[图9.1]示出了化合物1至6的母体和相应片段的LC-MS/MS谱。
图9.2
[图9.2]示出了化合物7至12的母体和相应片段的LC-MS/MS谱。
具体实施方式
根据本发明鉴定的化合物抑制CYP17A1和CYP19A1酶在用于雄激素和雌激素的甾类生成的以下途径中的活性：
CYP17A1
CYP17A1的抑制剂阻断17α-羟化酶活性，即孕酮的羟基化以形成17α-羟孕酮：
Figure GDA0003489195220000211
CYP19A1
CYP19A1的抑制剂阻断雄烯二酮和睾酮的芳构化以分别形成雌酮和雌二醇：
Figure GDA0003489195220000212
使用3D-QSAR技术开发定性3D药效团假设或模型。
使用具有不同程度抑制的已知CYP17A1抑制剂的化学结构来产生药效团模型。然后使用优选的药效团模型来使用偏最小二乘回归(PLS)执行化学计量分析。
药效团模型AADDRR.860(附图中的图1至图3)被选择作为与已知化合物最优选拟合。然后使用该模型来搜索关于新化学实体(NCE)的药效团特征的相似性并虚拟地筛选待用于CYP17A1和CYP19A1抑制的候选化合物的数据库。
使用灵活的对接技术来挖掘合适的候选化合物。对接常用于预测小分子药物候选物与其蛋白质靶标的结合取向，以便预测所述小分子的亲和力和活性。
对它们的靶标酶和负责已知药物的代谢的各种CYP450同种型的各种抑制效能显示在上表2中。
使用的设备和软件
在本发明的开发中使用了以下设备和软件：
·Maestro(v10.2)，
Figure GDA0003489195220000213
套件2015中的图形用户界面(GUI)，用于执行所有模拟任务。该GUI具有针对该套件中的所有
Figure GDA0003489195220000214
模块的内置工作流。(关于Maestro面板参见引用NPL8)。
·构象搜索通过使用MacroModel(v10.8)进行。(参见引用NPL9.)
·通过使用PHASE(v4.3)来进行药效团建模，PHASE是
Figure GDA0003489195220000215
2015产品套件的模块。(参见引用NPL10和NPL11。)
·通过使用Jaguar(v8.8)来进行量子力学/分子力学(QM/MM)计算。(参见引用NPL12.)
·诱导拟合对接(IFD)协议2015-2用于对在虚拟筛选协议中存活的数据库命中进行所有灵活分子对接计算。(参见引用NPL13至NPL15.)
详细过程
1.1药效团假设的发展
通过使用已经显示出对CYP17A1酶的不同程度抑制的已知和先前合成的甾族和非甾族有机化合物的训练和测试数据集来进行药效团假设的设计。数据集的化合物从文献中收集并包括17-吲唑基雄甾烯衍生物、异亚丙基取代的联苯亚甲基4-吡啶、甾族咪唑基、三唑基取代的联苯、联苯亚甲基、亚甲基咪唑取代的联芳基、萘甲基咪唑衍生物、联苯-基-甲基咪唑衍生物和阿比特龙类似物。
在初始数据集中还包括FDA认证的CYP17A1抑制剂如酮康唑、阿比特龙，以及II期和III期药物候选物如具有对CYP17A1具有已知IC50抑制的Orteronel和Galeterone。
初始数据集由105个具有不同核心结构和对CYP17A1酶的广泛抑制活性的分子组成(体外实验IC50评分为13至20000nM)。表4和表4A列出了来自初始训练和测试数据集的分子的选择。
以摩尔(M)为单位的体外实验IC50值被转换成pIC50(即-logIC50)数据。IC50值是从文献中获得。设定pIC50阈值以用于选择活性和非活性配体。pIC50<7.01(IC50为97nM)的配体被认为是非活性物质(即弱结合剂)，而中等活性值(7.54<pIC50<7.01)被认为是中等抑制剂。最后，pIC50>7.54(IC50为29nM)的抑制剂被认为是最具活性的配体(即强结合剂)。此活性阈值在用于调查的软件模块中设定，以使得官能团的药效团特征的取样仅被局限于数据集中的高活性分子的那些。
1.1配体制备
将数据集中的结构作为2D添加到Phase中，并在ligprep面板中转换为3D。在pH7.4下产生低能结构的互变异构体，并且使用ligprep产生数据集中的立体异构体的所有组合。然后使用MacroModel(v.9.9)和ConfGen而不是混合蒙特卡洛多重最小低模式(MixedMonte Carlo Multiple Minimum Low Mode)(MCMM/LMOD)构象搜索方法来使经调整的3D结构经受构象搜索。
使用具有取决于距离的介电常数的OPLS-2005力场来生成具有恒定介电常数1.0的低能多重构象。将最小化步骤的次数设置为100。设定10Kcal/mol的最大相对能量差以节省多个构象异构体。设定
Figure GDA0003489195220000221
的均方根偏差(RMSD)截止值以消除冗余的构象异构体。
1.2创建部位步骤
在创建部位步骤中，针对一组化学结构模式映射立体异构体的所得构象异构体以辨识每个配体中的药效团特征。一旦特征已经被映射到构象中的特定位置，它就被称为药效团部位。这些药效团特征包括内置于特征中的氢键受体(A)、氢键供体(D)、带负电荷的基团(N)、带正电荷的基团(P)、疏水基团(H)和芳环(R)。用户可以选择添加数据集的其他特征特性。我们选择使用默认特征来说明在我们的数据集中存在的结构特征(即由大多数活性结构表现出的官能团类型)。
1.3查找共同药效团的步骤
在此步骤中，我们对在第一步中选择出的该组高亲和力(活性)配体中的共同药效团进行了搜索。所述搜索跨越被称为变体的一个或多个药效团家族(由前一步骤中针对数据集中所有结构创建的药效团部位产生)。部位点的数量被选择为6，并且数据集中最具活性的结构的活性基团中的至少4个需要被匹配。执行对具有过多或过少的特定类型特征的变体的滤除，并从经过滤的列表中选择一组变体。可以作出其中使用者在药效团可以被认为是假设之前减少必须与所述药效团匹配的配体的数目的选择。通过枚举给定变体的所有药效团并根据它们的位际距离将它们分成连续更小的高维箱来进行搜索。每个n点药效团包含n(n–1)/2个独特的位际距离，因此每个箱包含n(n–1)/2个维度。聚类到同一箱中的药效团被认为是等效的，并且因此对于它们从中出现的配体是共同的。箱的大小限定了每个位际距离的容差，以及因此共同药效团必须如何类似。最初，药效团特征的可用参数如下：A＝2、D＝2、H＝3，并且R＝3。然后我们选择将疏水性特征(H)从3减少至2，从而导致了特征的以下频率：A＝2、D＝2、H＝2并且R＝3。变体列表从34降至17，其中每个箱包含的药效团根据据说在分割过程中存活的最小所需数量的配体。每个存活箱都含有一组共同的药效团，所述药效团中的一个最终被挑出作为假设。这是药效团假设发展的关键阶段，因为所得的假设取决于在此对被视为数据集中更具反应性和共同性的点部位的数量作出的选择。非模型配体在此步骤中进行比对。
1.4评分假设步骤
在此步骤中，我们应用了评分函数，所述评分函数从每个幸存箱中确定最佳候选假设并提供了所有假设的总体排名。评分算法包括来自部位点和矢量的比对、体积重合度、选择性、匹配配体的数量、相对构象能量和活性的贡献。最佳假设的选择是基于与紧密地具有最高的拟合度评分3的假设拟合的构象异构体的相对构象能量进行的。此构象在数据集中被称为参考配体。出于本发明目的，此被确定为相对构象能为0.00kcal/mol的N-{4’-[1-羟基-1-(1H-咪唑-4-基)-2-甲基丙基][1,1’-联苯]-3-基}乙酰胺(表4中的化合物7；表4A中的17[12])。具有最低相对势能的构象异构体具有较少的立体碰撞，并且当与柔性酶或受体结合时会潜在地诱发构象变化。还存在表现出相似结果的其他假设，但我们关注于此假设，因为此假设在3D-QSAR模型步骤中具有针对训练和测试集的良好相关系数。
1.5构建QSAR模型步骤
在此步骤中，我们使用与假设中的至少三个点相匹配的分子的活性数据来构建所选假设的QSAR模型。可能的是，使用具有不同活性水平的分子，包括可能由于与靶受体的立体碰撞而失活的那些。QSAR模型将空间分割为均匀大小立方体的网格，并用一组具有二进制值的独立变量来表征每个分子，这些独立变量用六个原子类别或一组药效团特征类型来编码这些立方体的占位。将偏最小二乘(PLS)回归应用于这些变量，以构建一系列具有连续更多数量的因素的模型。可能的是，在工作区(Workspace)中查看QSAR模型，并通过原子或特征类别和配体来分析QSAR模型。这可用于鉴定对预测活性有正面或负面贡献的配体特征。
起初，我们不将数据集分别随机地分为训练集和测试集。我们选择用所有分子作为训练集来构建QSAR模型。PHASE中的‘基于原子的药效团模型’选项优于基于药效团的比对，这是因为它已经被描述为足够用于包含具有共同结构框架的少量可旋转键的结构。将PLS因子的数量设定为3以防止QSAR模型的过度拟合。结果给出了与实验活性相关的数据集中的所有配体的预测活性。我们手动去除数据集中预测pIC50值与实验pIC50值不一致的六个分子。这些离群值主要是由于来自体外实验的异质响应变量，因为可用的实验活性是用不同的测定方法从数据集中的其余分子测量的。然后我们随机选择85个结构作为训练集的部分，并且15个结构在测试集中。
结果是具有好的和不好的R2和Q2统计结果的组合的204个模型。最佳的3D-QSAR药效团模型为在使用留n交叉验证方法另外离群值去除22个结构后具有R2＝0.9228和Q2＝0.940的AADDRR.860。
附图的图8示出了药效团假设AADDRR.860的pIC50(估计对照实验)的验证图。QSAR模型对应于具有3个潜在变量的PLS模型。左手绘图针对训练集(R20.9228)，而右手绘图针对测试集(Q20.8953)。
下表3列出了已被鉴定的各种3D-QSAR药效团假设，并列出了它们的统计数据：
[表3]筛选后的3D-QSAR药效团模型的统计数据：
Figure GDA0003489195220000231
Figure GDA0003489195220000241
Figure GDA0003489195220000251
Figure GDA0003489195220000261
用于产生药效团的来自训练集和测试集的化合物列于下面的表4和表4A中。表4A还提供了适用于优选药效团模型AADDRR.860的训练集和测试集的子集的实际和预测活性。
[表4]用于产生药效团模型的已知CYP17A1抑制剂的IUPAC系统名称：
Figure GDA0003489195220000271
Figure GDA0003489195220000281
Figure GDA0003489195220000291
Figure GDA0003489195220000301
1.aKTZ–酮康唑
[表4A](部分1)：优选药效团模型AADDRR.860的实际活性对预测活性。(同样参见附图中的图8)：
(注释：此表格以两个分开的部分呈现。条目名称是指在本说明书的底部在引用列表的“非专利文献”部分在标题NPL16下列出的参考文献或期刊文章中所描述的化合物。作为命名法的示例，条目名称3j[11]是指在标题NPL16下的编号为“11”的文章中所描述的化合物3j。)
Figure GDA0003489195220000302
Figure GDA0003489195220000311
Figure GDA0003489195220000321
[表4A](部分2)：优选药效团模型AADDRR.860的实际活性对预测活性：
Figure GDA0003489195220000322
Figure GDA0003489195220000331
Figure GDA0003489195220000341
1.6准备用于高级药效团筛选的3D数据库
管理3D数据库(Manage 3D Database)面板提供了用于准备可供搜索与药效团假设的匹配的结构数据库的工具。数据库必须包含为实验结构的合理表示的全原子3D结构。将从Enamine数据库(www.enamine.net)作为.sdf文件下载的总共250万种类药结构添加到Maestro图形用户界面(GUI)中的管理3D数据库面板中。3D数据库通过在pH7.4处使用Epik产生结构的电离状态来准备。使用默认参数来对立体异构体进行取样和执行构象分析。选择去除高能离子化和/或互变异构态的标签。去除在物理化学性质方面不满足Lipinski五规则的结构。产生了通过此过滤阶段的结构的构象异构体，并由所选特征创建了药效团部位。还创建了用于根据需要进行数据库搜索的分子的子集。
1.7通过筛选3D数据库查找药效团假设的匹配
查找与假设的匹配(Find Matches to Hypothesis)面板是具有四个部分的单一面板。在前两部分中，我们指定在前一部分中准备的数据库用于搜索。我们还从最好的3D-QSAR模型选择了假设AADDRR.860来用于搜索。我们使用默认参数用于搜索并用于后续的命中显示。搜索分两步执行：查找与假设的匹配，以及获取命中。在查找数据库中的假设的匹配时，我们选择设定命中必须匹配假设中的所有六个点的约束。第二步骤可以用不同的处理选项重复，而不重复第一步骤。命中处理选项包括调整命中排序所按照的拟合度评分，施加关于命中数量的数字截止值，以及使用QSAR模型计算活性。由3D-QSAR模型预测命中的活性，并且将所有命中根据预测活性的增加进行排序。
2.分子对接计算
2.1使用宏观模型模块搜索命中的低能构象异构体
从数据库搜索获得的命中是作为单独构象异构体获得的。因此，重要的是在对接之前对低能构象异构体执行广泛的几何优化和构象搜索。我们使用OPLS_2005作为使用水作为溶剂的选择的力场。我们使用PRCG作为最小化方法。构象搜索方法是针对多个配体的混合扭转/大规模低模取样。我们使用默认参数进行此构象搜索。我们实施了用于选择低能构象异构体的过滤标准，所述过滤标准是所有相对势能低于0.5kcal/mol的构象异构体将在下一步骤中进一步使用。
2.2使用Jaguar对命中的构象异构体进行几何优化
用于使用Jaguar进行几何优化的输入结构是从来自先前的构象搜索工作的过滤步骤中存活的输出结构获得的。密度泛函理论(DFT)计算被用作使用B3LYP6-31G*基组的最佳理论水平。在几何优化过程中，Jaguar为了效率而调整每个几何步骤处的SCF计算的收敛标准。当连续几何结构的能量以及能量和位移的分析梯度的元素已经满足收敛标准时，几何被认为已经收敛。在这种情况下，我们选择具有寻找原子重叠的初始猜测的全分析收敛标准。在几何优化结束时，Jaguar对几何优化收敛进行简单分析。由于我们的结构是杂环的，所以将几何优化的步骤数设定为1000。我们还使用水作为隐式水模型的泊松-玻尔兹曼(Poisson-Boltzmann，PBF)溶剂模型。所计算的受关注的电子性质包括分子静电势(MESP)以及最高占据分子轨道和最低未占分子轨道(HOMO和LUMO)，分别来解释我们的命中中药效团部位的反应性。
2.3酶制备
分别与CYP17A1抑制剂TOK-001或Galeterone(3SWZ)和阿比特龙(3RUK)共结晶的CYP17A1的X射线晶体结构从蛋白质数据库PDB下载。这些晶体结构已分别以
Figure GDA0003489195220000351
和
Figure GDA0003489195220000352
的分辨率结晶并存储到蛋白质数据库(PDB)中。
(对于CYP19A1，相关的PDB晶体结构是3S7S、3S79和4KQ8。)
PDB结构是通过X射线晶体学(在一些情况下用XRD)共结晶的蛋白质-配体复合物。然而，通常来自PDB的结构文件不适合立即用于分子建模计算，这是因为典型的PDB结构文件仅由重原子组成并且可能包括共结晶配体、水分子、金属离子和辅因子。一些结构是多聚体，并且可能需要缩减为单一单元。由于X射线实验的分辨率有限，所以可能难以区分NH和O基团，并且必须检查这些基团的放置。PDB结构也可能缺少关于连接性的信息，这些信息必须与键级和形式电荷一起分配。在X射线晶体结构从PDB输入到工作区之后，对结构进行预处理以分配键级，添加氢原子，向金属添加零键级，产生二硫键，并使用Prime模块填充缺少的侧链和环。此外，来自活性部位中的杂基团的超过
Figure GDA0003489195220000353
的水被删除。PDB结构中作为多聚体存在的多个结构单元被删除以留下一个结构单元。使用Epik在pH7.4处产生酶和铁血红素的氨基酸残基的电离状态。所得的氧化态是卟啉的Fe的+2态以及+3态。我们选择(+3)态，这是因为处于静息状态的铁卟啉在催化循环中以这种氧化态存在以用于由细胞色素P450酶代谢底物。使用Propka进一步优化酶以分配氨基酸残基的pKa值。
2.4高通量虚拟筛选工作流(HTVSW)和诱导拟合对接(IFD)
来自几何优化的命中的输出文件是作为输入的配体的来源。然后使用灵活的配体对接方法针对3SWZ和3RUK酶的grid文件来对接配体。
图7示出了用于模型验证的单独参考配体TOK-001(Galeterone)的原生对接姿势。
表5显示了在对不同类型的PDBx射线晶体结构进行的交叉对接和原生对接方法中的均方根偏差(RMSD)以验证和测量对接方法的选择性：
[表5]RMSD的比较：
Figure GDA0003489195220000354
Figure GDA0003489195220000361
a交叉对接，b诱导拟合对接(原生对接)。
使用诱导拟合对接工作流进一步对接具有高对接评分的命中的所得对接姿势。在此对接方案中，考虑了结合过程中酶和配体的构象变化。由于CYP17A1是柔性酶，所以重要的是产生接近实际体内构象的构象异构体。表现出良好对接评分的命中被认为是潜在的CYP17A1抑制剂。
在执行诱导拟合对接后，改变来自命中化合物Z1567948782(化合物7)的某些官能团以产生其衍生物。目的是提高命中的抑制效能。针对CYP17A1结合Z1567948782的命中的衍生物如下：Z2234084128(化合物9)；Z2234175518(化合物10)；Z2234175520(化合物11)；Z2234185123(化合物12)；以及先前命名为980171513的Z518027752(化合物13)。
对Z2234185123(化合物12)的进一步衍生物的运算对接计算显示它们也是雄激素受体拮抗剂并抑制雄激素受体的各种突变体。
还建立了已经可在数据库中现货供应但先前未针对CYP17A1和CYP19A1抑制进行测试的以下命中：Z44426883(化合物1)；Z92489215(化合物2)；Z220306370(化合物3)；和Z51102986(化合物6)。
CYP17A1命中Z220306370(化合物3)和Z51102986(化合物6)通常被发现作为外消旋混合物而不是单一对映异构体。
示例性CYP17A1抑制命中的特征
命中Z2234175518表现出与已知的CYP17A1抑制剂阿比特龙和TOK-001(Galeterone)类似的结合机制。然而，我们的命中Z2234175518显示出3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基部分的NH基团与ASN202的羰基基团之间的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000362
此外，3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基部分的羰基基团显示出与TYR201的OH基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000363
吡啶环面对活性部位的Fe(+3)部分，并且因此阻止底物接近用于甾体激素代谢的Fe(+3)部分。命中还通过与CYP17A1的活性部位中的疏水性氨基酸残基的少量疏水性相互作用来容纳，诸如：ALA367、VAL482、ALA113、ALA105、ILE206、ILE205、LEU243、PHE300、TYR201、ILE198、ILE209、以及ALA302。
命中Z2234175520显示出与Z2234175518不同的结合机制，即使它们共享相同的核心结构并且唯一的区别是Z2234175520不具有吡啶环。命中Z2234175520显示在作为氢键供体的N-(2-羟苯基)的OH基与作为氢键受体的VAL482的羰基之间的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000364
显示了在作为氢键受体的3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]的氧原子与作为氢键供体的ARG239的N-H基团之间的进一步强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000365
3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]的羰基显示出与TYR201的OH基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000366
作为氢键供体的3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]基团的N-H基团显示出与作为氢键受体的ASN202的羰基基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000367
命中通过与CYP17A1的结合袋中的疏水性氨基酸残基的疏水相互作用来容纳。疏水性氨基酸基团包括以下项：LEU209、ILE205、ILE206、TYR201、PHE300、ILE198、PHE114、ALA113、以及ALA302。
命中Z2234185123显示在作为主链氢键供体的乙酰胺的N-H基团与作为氢键受体的LEU370的羰基之间的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000368
作为氢键受体的命中的羰基显示出与作为氢键供体的LEU214的N-H基团的侧链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000369
作为氢键受体的(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)的羰基与作为氢键供体的ARG239的N-H基团结合，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003610
作为氢键供体的N-{4-氯-3-[(3-氧代-3，4-二氢-2H-1，4-苯并噁嗪-7-基)氨甲酰基]苯基}的N-H基团显示出与作为氢键受体的VAL482的羰基的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000371
此配体的结合模式与Z1567948782的其他衍生物差异较大，因为它已经显示了在命中本身与酶的氨基酸残基之间的三个主链氢键。该酶通过疏水性相互作用来在其活性部位中容纳命中分子。疏水相互作用中涉及的氨基酸残基包括以下项：VAL215、MET369、LEU370、PRO368、PRO372、PHE114、TYR201、ILE206、VAL482、VAL366、ILE371、ALA367、以及LEU214。
命中Z518027752(先前命名为980171513)显示在作为氢键受体的3-{[(6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]基团的氧与作为氢键供体的ARG239的N-H基团之间的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000372
ARG239的芳环也显示出与3-{[(6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]基团的芳环的π-π键。作为氢键受体的3-{[(6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]的羰基显示与作为氢键供体的TYR201的OH基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000373
作为氢键供体的3-{[(6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]的N-H基团显示与作为氢键受体的ASN202的羰基的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000374
负责疏水相互作用的氨基酸残基包括以下项：TYR201、ILE198、ILE205、ILE206、LEU209、VAL482、VAL483、以及VAL366。
命中Z44426883显示在作为氢键供体的2-羟基-5-甲氧基苯甲酰基的OH基团与作为氢键受体的ASP298的羰基之间的强氢键相互作用，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000375
作为氢键受体的3-((4-乙基苯基)氨甲酰基)的羰基显示与作为氢键供体的ARG239的N-H基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000376
2H-吡喃-2-亚胺基团的NH2+基团显示出与GLU305的羧酸酯基团的盐桥相互作用。氨基酸侧链例如PHE114、ALA105、LEU209、LEU102、LEU214、ALA367、VAL366、ILE371、LEU370、VAL482和VAL483是疏水性相互作用中所涉及的。
命中Z220306370是R-对映体，并且显示在乙酰胺的羰基与活性位部位水之间的氢键网络，其还与ARG239的N-H基团结合。在命中的苯基基团与PHE114的苯基之间存在π-π相互作用。铁-卟啉部分显示与命中的吲哚环的π-π堆积相互作用。疏水相互作用中涉及的疏水性氨基酸基团包括以下项：ALA113、PHE114、ALA302、LEU102、LEU209、ILE371、LEU214、TYR201、以及VAL482。此结合机制显示出与针对TOK001(Galeterone)和阿比特龙观察到的机制类型的相似性。
命中Z51102986显示在作为氢键供体的4-丁酰胺基苯基的N-H基团与作为氢键受体的ASN202的羰基之间的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000377
命中中的吲唑部分的N-H基团还显示出与VAL482的羰基的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000378
酶结合袋中的疏水相互作用中涉及的疏水基团如下：VAL366、ALA367、VAL483、VAL482、ILE371、TYR201、ILE198、PHE300、LEU242、PHE114、LEU209、以及ALA302。
命中Z92489215显示在作为氢键受体的吲哚环的N-H基团与作为氢键供体的THR306的OH基团之间的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000379
命中的吲哚环显示出与铁-卟啉的Fe(+3)基团的π-阳离子相互作用。乙酰胺的羰基参与与水的氢键网络并且表现出
Figure GDA00034891952200003710
的键合半径。水与乙酰胺基之间的氢键网络延伸至ARG239的N-H基团和GLY297的羰基。命中的疏水基团参与与下列氨基酸的疏水相互作用：VAL366、ALA367、LEU370、VAL482、LEU102、PHE114、VAL483、ILE206、LEU209、以及ILE205。
命中Z1567948782显示在作为氢键供体的6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-7-基基团的N-H基团与其所针对的作为氢键受体的VAL482的羰基基团之间的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003711
作为氢键供体的苯甲基基团的N-H基团显示与卟啉部分中的Fe(+3)的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003712
在水分子与GLY297的羰基之间的活性部位中也存在氢键网络，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003713
该键合不涉及命中分子。
命中Z2234084128显示在N-(2-羟苯基)的OH基团与ASN202的羰基之间的键合半径为
Figure GDA00034891952200003714
的侧链氢键，以及充当氢键供体的N-H基团与充当氢键受体的ASN202的羰基之间的键合半径为
Figure GDA00034891952200003715
的另一个侧链氢键。作为氢键受体的Z2234084128的氨甲酰基苯氧基基团的羰基基团显示与作为氢键供体的ARG239的N-H基团的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003716
N-(2-羟苯基)的苯基基团显示与PHE300的苯基基团的π-π相互作用。
如可以看出，命中中的许多通过与活性部位的结合袋中的氨基酸残基的疏水相互作用来容纳。这种疏水相互作用中涉及的氨基酸包括：ALA105、ALA367、LEU370、VAL366、ALA302、LEU214、VAL482、VAL483、PHE114、ILE206、ILE205、LEU209、LEU242、PHE184、ILE246、PHE300、以及ILE198。
示例性CYP19A1抑制命中的特征
还进行了命中分子与CYP19A1酶的对接以便确立对CYP17A1酶和CYP19A1酶的双重抑制是否可能。
命中Z56773451的(R,R)对映体显示在作为氢键受体的OH基团的氧与作为氢键供体的MET374的N-H基团之间的主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000381
作为氢键供体的该命中的OH基团的氢显示与LEU372的羰基基团的主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000382
该命中的芳环显示与ARG115的苯基基团的π-π堆积。该命中与活性部位氨基酸残基之间的键通过与以下物质的疏水相互作用而进一步加强：ILE133、ILE305、ALA306、PHE221、TRP224、LEU477、VAL370、VAL372、VAL373、以及MET374。
命中Z56773451的(S,S)对映体显示在作为氢键供体的命中的邻位OH基团与ASP309的羰基基团之间的主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000383
作为氢键受体的命中的芳族环的邻位OH基团显示与THR310的OH基团的另一个侧链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000384
该命中的芳族环的间位OH基团显示与ASP309的羰基的主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000385
作为氢键受体的与该命中中的环戊基基团键合的芳族环的间位O-基团显示与MET374的N-H基团的强主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000386
该命中的芳族环的相同O-基团显示与ARG115的N-H基团的另一侧链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000387
作为氢键供体的该命中的芳族环的对位OH基团显示与作为氢键受体的LEU372的羰基基团的主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000388
作为氢键受体的该相同的对位OH基团显示与MET373的N-H基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000389
命中的疏水基团与活性部位的氨基酸残基之间的疏水相互作用如下：VAL373、MET374、LEU372、LEU477、VAL370、VAL369、以及LEU479。
命中Z518027752(先前命名为980171513)显示在作为氢键受体的苯并噁嗪环的羰基基团与作为氢键供体的MET374的N-H基团之间的强主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003810
作为氢键供体的环的N-H基团还显示与作为氢键受体的LEU372的羰基基团的主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003811
苯并噁嗪环显示与ARG115的NH2基团的π-π键。活性部位水分别与VAL369和370的N-H基团之间也具有氢键骨架。命中的疏水基团与活性部位的氨基酸残基之间的疏水相互作用如下：VAL373、MET374、LEU372、LEU477、TRP224、PHE221、ALA306、ILE132、以及ILE305。
命中Z2230799627显示在作为氢键受体的苯并噁嗪环的羰基基团与作为氢键供体的MET374的N-H基团之间的强主链氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003812
此结合模式由命中与活性部位的氨基酸之间的疏水相互作用促进，所述氨基酸如下：MET374、VAL373、PHE134、LEU372、LEU477、PHE221、TYR220、TRP224、ILE305、MET127、ILE133、LEU152、PHE148、ILE132、和VAL370。
命中Z2234175518显示在作为氢键供体的命中的氨基亚甲基的N-H基团与作为氢键受体的SER478中的OH基团的氧键合时在其之间的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003813
作为氢键供体的苯并噁嗪环的羰基基团显示与作为氢键供体的MET374的N-H基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003814
作为氢键供体的苯并噁嗪环的N-H基团显示与LEU372的羰基基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003815
苯并噁嗪环显示与ARG115的NH2基团的π-π相互作用。活性部位水分别与VAL369和VAL370的N-H基团之间也存在氢键骨架。疏水相互作用由以下氨基酸残基促进：MET374、VAL373、PHE134、TRP224、PHE221、ILE305、ALA306、VAL369、LEU477、VAL370、以及LEU372。
命中Z2234175520显示在作为氢键受体的苯并噁嗪环的羰基基团与作为氢键供体的THR310的OH基团之间的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003816
作为氢键供体的苯并噁嗪环的N-H基团显示与VAL369的羰基基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003817
作为氢键供体的2-羟苯基基团的OH基团显示与作为氢键受体的THR310的OH基团的氧的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA00034891952200003818
在VAL370的羰基基团与活性部位水以及VAL369的N-H基团之间存在氢键网络。命中的2-羟基苯环与Fe(3+)基团之间存在π-阳离子相互作用。疏水性相互作用由酶的活性部位中的以下氨基酸残基促进：VAL373、ILE133、LEU477、MET374、LEU372、PHE134、TRP224、PHE221、VAL370、VAL369、以及ALA306。
对于命中Z2234185123，作为氢键供体的甲酰胺的NH2基团显示与作为氢键受体的ASP309的羰基基团的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000391
作为氢键受体的苯并噁嗪环的羰基基团显示与作为氢键供体的MET374的N-H基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000392
作为氢键受体的吡唑环的氮显示与作为氢键受体的SER478的OH基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000393
HID480的吡唑环显示与命中的吡唑环的π-π相互作用。命中的吡唑环也显示与PHE221的芳香环的另一π-π相互作用。疏水相互作用由酶在其活性部位中的以下氨基酸残基促进：ILE133、VAL373、MET374、LEU372、LEU477、PHE134、以及VAL369。
命中Z1567948782显示在作为氢键受体的苯并噁嗪环的羰基基团与作为氢键受体的MET374的N-H基团之间的强氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000394
作为氢键供体的苯并噁嗪环的N-H基团参与与作为氢键受体的LEU372的羰基基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000395
命中的苯甲酰胺环显示与卟啉环的三重π-π相互作用。存在由作为氢键供体的VAL369以其N-H基团与作为氢键受体的活性部位水表现出的氢键网络，以及由作为氢键供体的VAL370以其羰基基团与作为氢键供体的活性部位水表现出的氢键网络。与配体的疏水相互作用中所涉及的酶的疏水性氨基酸残基如下：PHE221、TRP224、LEU477、PHE134、VAL373、MET374、LEU372、VAL370、ILE132、ILE133、LEU152、和ALA306。
命中Z854502162显示在作为氢键受体的甲酰胺基团的羰基基团与作为氢键受体的MET374的N-H基团之间的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000396
作为氢键供体的甲酰胺的NH2基团显示与作为氢键受体的LEU477的羰基基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000397
作为氢键供体的键合至命中的苯基的N-H基团显示与作为氢键受体的LEU477的羰基基团的氢键，所述氢键的键合半径为
Figure GDA0003489195220000398
命中的苯基显示与PHE134的苄基基团的π-π相互作用。与配体的疏水相互作用中所涉及的酶的疏水性氨基酸残基如下：PHE134、MET374、VAL373、LEU372、LEU477、PHE221、VAL370、ILE305、ALA306、和ILE133。
合成方案
化合物Z225980484、Z51102986的一般过程
Figure GDA0003489195220000399
仪器：反应在8ml玻璃小瓶中进行。
装载：以1.0当量等于1.4mmol的所述化合物为目标来装载反应物。
方案：向小瓶中装入酸(1.2当量)、DMF(2ml)和DIPEA(1.2当量)。向搅拌的混合物中加入卤代烷(1.0当量)。将小瓶加盖并在搅拌下加热1小时。30分钟后，反应混合物变澄清并在100℃下继续加热6小时。然后将小瓶冷却、用水稀释、并用氯仿萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并浓缩。将粗产物用硅胶上的CombiFlash色谱纯化。平均产率为50％。
化合物Z220306370、Z92489215的一般过程
Figure GDA00034891952200003910
仪器：反应在8ml玻璃小瓶中进行。
装载：以1.0当量等于1.4mmol的所述化合物为目标来装载反应物。
向小瓶中装入S取代的试剂(1.0当量)、DMF(2ml)、DIPEA(1.2当量)。向搅拌的混合物中加入卤代烷(1.0当量)。将小瓶加盖并在搅拌下加热1小时。30分钟后反应混合物变澄清，并继续加热另外3小时。然后将小瓶冷却、用水稀释、滤除形成的沉淀物、用水洗涤并干燥。平均产率为20％。
用于化合物Z854502162的过程
Figure GDA0003489195220000401
仪器：反应在8ml玻璃小瓶中进行。
装载：以1.0当量等于1.8mmol的所述化合物为目标来装载反应物。
向含有特定量的第一试剂(1.0当量)的搅拌溶液中加入DIPEA(1.1当量)和在1mLDMF第二试剂(1.0当量)中的碘化钾(催化剂)。使反应混合物在沸水浴上搅拌约5分钟。在试剂完全溶解后，将经搅拌的反应混合物在水浴上加热6小时。
将反应混合物用过量的去离子水研磨并超声处理直至形成结晶沉淀物。将沉淀物过滤、用甲醇洗涤两次、并干燥。将粗产物通过色谱(硅胶，CHCl3:iPrOH＝4:1)纯化。产率为30％。
用于化合物Z44426883的过程
Figure GDA0003489195220000402
仪器：反应在8ml玻璃小瓶中进行。
装载：以1.0当量等于0.75mmol的所述化合物为目标来装载反应物。
向小瓶中装入醛(1.0当量)和相应的亚甲基活性化合物(1.0当量)、乙酸(5ml)和乙酸钠(1.1当量)。将小瓶加盖并在100℃下加热8小时。然后将瓶加冷却并用水(5ml)稀释。将形成的沉淀过滤、干燥、并从乙腈中重结晶。产率为48％。
表2中化合物7至13的合成：
化合物Z1567948782是表2中化合物7，其是表2中的化合物8至13的母体化合物。化合物7及其衍生物8至13的合成方案如下：
用于化合物Z1567948782(母体化合物7)的过程
Figure GDA0003489195220000403
仪器：反应在8ml玻璃小瓶中进行。
装载：以1.0当量等于0.7mmol的所述化合物为目标来装载反应物。
将胺(1.0当量)溶于3mL甲醇中并将反应混合物在小瓶中于室温下搅拌。然后将醛(1.0当量)加入到经搅拌的溶液中。将具有反应混合物的小瓶在58-60℃下超声处理60-90分钟，直到试剂完全溶解。可以加入至多5mL的乙腈以完成试剂的溶解。将反应小瓶冷却至0℃，并将硼氢化钠(150mg)以多个小部分加入到反应混合物中。将反应混合物在敞口小瓶中搅拌直至硼氢化钠溶解。将反应小瓶在室温下超声处理2小时，关闭，并使其在室温下静置过夜。然后将敞口的反应小瓶在50℃下超声处理直至甲醇几乎完全蒸发。将反应混合物用5mL甲醇研磨并搅拌，直至其大部分溶解。不溶部分主要由无机盐组成。通过使甲醇悬浮液通过离子聚合物清除剂来纯化产物。将产物用甲醇洗脱并减压去除溶剂以得到产物。将粗产物通过色谱(硅胶，CHCl3:iPrOH＝4:1)纯化。产率为25％。
Z1567948782(母体化合物7)的衍生物的合成
按照以下给出的方案进行合成：
方案1
Figure GDA0003489195220000411
R＝H；OH；Cl
方案2
Figure GDA0003489195220000412
方案3
Figure GDA0003489195220000413
步骤A
在0℃向化合物1(R＝H；3.0g，27.5mmol)的氯仿溶液中加入TEBA(3.1g，13.7mmol)和NaHCO3。然后在相同的温度下在20分钟内加入氯乙酰氯(4.6g，41.2mmol)的氯仿溶液。并将所得混合物在60℃下搅拌16小时。反应完成后，将溶剂蒸发并用DCM和水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并真空浓缩。所得溶液用戊烷和乙醚作为共溶剂洗涤，以得到作为固体的化合物2(3.2g，78％的产率)，该化合物足够纯以直接用于进一步反应。通过相同的过程获得具有R＝OH和Cl的化合物。
步骤B
向冰冷却的化合物2(R＝H；0.60g，3.35mmol)的AcOH(1.8mL)溶液中逐滴加入70％的HNO3(0.6mL)并在室温下搅拌15分钟。反应完成后，将反应混合物倒入冰水(100g)中，过滤分离的固体，用水洗涤，并减压干燥。将粗制化合物3直接用于下一步骤而无需进一步纯化(0.60g，80％)。通过相同的过程获得具有R＝OH和Cl的化合物。
步骤C
将1000mL圆底烧瓶净化，冲洗并保持氢气气氛，然后加入化合物3(R＝H；16.5g，85.05mmol，1.00当量)的THF(500mL)溶液。向该混合物中加入Pd/C(10％，4g)。使所得溶液在搅拌下反应过夜，同时将温度保持在室温下。通过TLC(PE/EtOAc＝1:1)监测反应进程。执行过滤。通过使用旋转蒸发器进行真空蒸发来浓缩滤液。这产生为红色固体的13.5g(97％)的化合物4。通过相同的过程获得具有R＝OH和Cl的化合物。
步骤D
在室温时在搅拌下向9.37mmol的化合物4在15ml无水乙醇中的溶液中加入11.44mmol相应的醛5。使用TLC来控制反应的终点。过滤反应混合物。将所得固体用无水乙醇洗涤，以得到7.665mmol黄色固体产物，将所述产物溶于20ml无水乙醇中。分批加入0.445g(11.5mmol，96％)硼氢化钠并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物倒入冰水中，过滤，干燥以得到产物：化合物8Z2230799627；化合物10Z2234175518；化合物11Z2234175520；以及化合物13Z518027752(先前称为980171513)。产率为74-92％。
步骤E
向化合物4(99mg；600μmol)的无水二氯甲烷(2ml)溶液中加入三乙胺(105μl，753μmol)和酰基氯6(170mg，600μmol)的无水二氯甲烷(2ml)溶液，并将混合物在室温下搅拌14小时。将水加入到反应溶液中，并用乙酸乙酯萃取有机相。将有机相用水以及碳酸氢钠和氯化钠的饱和水溶液洗涤。将所得混合物经硫酸镁干燥，然后减压浓缩。通过使用己烷:乙酸乙酯(1:1)作为洗脱溶剂经由硅胶柱色谱纯化粗产物，以产生：化合物12Z2234185123(160mg，99％)。
所有分子都是作为外消旋混合物而不是作为单独的对映体合成的。
体外方法：
1.1.对大肠杆菌CYPEX膜中的主要5种人肝CYP的CYP抑制
1.1.1.化合物制备
将测试化合物和对照抑制剂从固体化合物制备为DMSO原液。在添加到温育试管中之前，将原液在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中以四倍终浓度稀释。最终的DMSO浓度为1％。
1.1.2.5种CYP温育
使用重组微粒体(bactosome)混合物(在大肠杆菌中异源表达并作为所有5种同种型的定制混合物从Cypex,Dundee购买的5种CYP；产品目录号CYP/XG001，批次XG001001)来测量对5种CYP(CYP1A2、2C9、2C19、2D6和3A4)的抑制。
[表6]购自Cypex公司的CYP重组微粒体混合物：
重组微粒体 批号
CYP1A2LR C1A2LR010
CYP2C9R C2C9R012
CYP2C19R C2C19R018
CYP2D6LR C2D6LR001-3
CYP3A4LR C3A4LR006
以在每种底物的Km周围的浓度来使用每种同种型的选择性和FDA认可的底物。通过测量同种型特异的代谢物的外观来评估每种同种型的活性。CYP同种型、底物、温育浓度和测得的代谢物汇总在下表7中：
[表7]CYP同种型、底物、温育浓度和测得的代谢物：
Figure GDA0003489195220000431
测试化合物以6个浓度(半对数稀释度)50、15.81、5、1.58、0.5、0.016μM的终浓度来测试。使用5种同种型特异性抑制剂的混合物作为阳性对照。各个同种型特异性抑制剂、所使用的浓度范围和预期的IC50值汇总于下表8中：
[表8]阳性对照CYP抑制剂：
Figure GDA0003489195220000432
如下表9所示建立温育反应：
[表9]温育混合物：
Figure GDA0003489195220000433
在37℃下使用1500rpm振荡进行温育达恰好10分钟。通过加入100μl的MeOH/1μM的甲苯磺丁脲(内标)来停止反应。将猝灭的样品充分混合并且蛋白质在-20℃下沉淀过夜。在4℃下将样品以2,500×g(3,400rpm)下离心20分钟。将上清液转移至96孔板并通过LC-MS/MS分析。
1.1.3.LC-MS/MS分析
使用以下LC-MS/MS条件来分析5CYP抑制样品：
·柱：Waters ACE Excel C18-AR，50×2.1mm，2μm
·流动相A：MilliQ水+0.1％的甲酸
·流动相B：甲醇+0.1％的甲酸
·流速：0.8ml/min
[表10]LC梯度：
时间 ％A
0.00 5
0.20 5
1.50 85
1.55 99
2.00 99
2.05 5
2.10 5
[表11]MRM方法：
化合物 母体(m/z) 子体(m/z)
1’-羟基他克林 215.03 197.00
4’-羟基S-美芬妥英 235.10 150.00
羟基丁呋洛尔 278.14 186.00
4’-羟基双氯芬酸 312.10 229.80
1’-羟基咪达唑仑 341.92 202.80
甲苯磺丁脲 271.03 90.89
1.2.CYP17A1抑制
1.2.1.化合物制备
将测试化合物和对照抑制剂从固体化合物制备为DMSO原液。醋酸铵、甲苯磺丁脲、17α-羟孕酮和孕酮购自Sigma-Aldrich(Gillingham,UK)，并且酮康唑购自SequoiaResearch Products Ltd.(Pangbourne,UK)。HPLC级甲醇和甲酸购自Fisher Scientific(Loughborough,UK)。用于HPLC的水是在Milli Q系统(Millipore,Watford,UK)上纯化的。
1.2.2.CYP17A1温育
使用20pmol/ml的CYP17A1重组微粒体(Cypex,Dundee,UK)和0.1μM孕酮作为底物以及在含有5mM氯化镁的pH7.4的50mM磷酸钾缓冲液中的1mM NADPH来测量CYP17A1抑制。将抑制剂溶解于DMSO中并以七个1/2对数步骤连续稀释，最终浓度的范围为50μM至50nM。反应体积为100μl，并且最终DMSO浓度为1％(v/v)。通过加入NADPH开始反应，并在37℃下在BioshakeIQ(Q-Instruments,Jena,Germany)上以1800rpm振荡温育20分钟。通过加入含有作为内标的1μM甲苯磺丁脲的200μl甲醇来终止反应。
1.2.3.LC-MS/MS分析
使用以下LC-MS/MS条件来分析CYP17A1抑制样品中的17α-孕酮：通过液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)使用正模式的电喷雾离子化(ESI)来半定量地评估17α-孕酮的产生。在与Waters Acquity UPLC系统(Waters Corp.,Milford,MA,USA)组合的Waters QuattroUltima Platinum三重四极质谱仪上以MRM模式分析8μl的每种样品。
柱：ACE Excel C18-AR，50×2.1mm，2μm
流动相A：MilliQ水+0.1％的甲酸+0.025％(w/v)的醋酸铵
流动相B：甲醇+0.1％的甲酸+0.025％(w/v)的醋酸铵
流速：0.8ml/min
柱温：65℃
[表12]LC梯度：
时间 ％A
0.00 95
1.00 1
1.30 1
1.31 95
1.50 95
[表13]MRM方法：
Figure GDA0003489195220000451
1.3.CYP19A1抑制
1.3.1.化合物制备
将测试化合物和对照抑制剂从固体化合物制备为乙腈或DMSO原液。将化合物在相同溶剂中以1/2对数步骤连续稀释。
1.3.2.CYP19A1温育
使用CYP19/MFC高通量抑制剂筛选试剂盒(Corning)执行CYP19A1抑制实验。将测试化合物以七种浓度测试：可溶于乙腈的化合物在50.0、15.8、5.0、1.58、0.5、0.158和0.05μM下测试，而由于发现它们不溶于乙腈而必须溶于DMSO中的化合物在25、7.9、2.5、0.79、0.25、0.079和0.025μM下测试。
根据制造商的说明书在黑色96孔板(Greiner)中执行CYP19A1反应。每200μl反应由7.5pmol/ml的CYP19A1、25μM的7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)和NADPH再生体系组成，所述NADPH再生体系由8.2μM的NADP+、0.42mM的MgCl2、0.42mM的葡萄糖-6-磷酸、0.337单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在pH7.4的50mM磷酸钾缓冲液中组成。最终有机溶剂浓度为4％(v/v)乙腈或0.5％(v/v)二甲基亚砜。将板用自粘膜盖子覆盖并在37℃下温育10分钟。通过加入75μl终止溶液(在乙腈:MilliQ水(80:20)中的100mM Tris碱)来终止反应。
1.3.3.荧光定量分析
在
Figure GDA0003489195220000452
i3x(Molecular Devices)上分别使用409nm和530nm作为激发和发射波长来测量7-羟基-4-三氟甲基香豆素(HFC)的荧光。
1.3.4.数据分析
将每种浓度的每种测试化合物/阳性对照抑制剂的CYP活性转化为对照活性(CA)的％。使用每种测试化合物或阳性对照抑制剂的LC-MS/MS峰值响应(CYP代谢物峰面积/内标峰面积)，并将每个样品的响应表示为未抑制对照(DMSO温育)的百分比。然后将数据表示为(log(CA/100-CA)并用于生成伪Hill曲线图，使用该曲线的斜率和y轴截距来根据以下等式计算IC50值。
Figure GDA0003489195220000453
合成的各种化合物的液相色谱/质谱(LCMS)结果显示在图9中。
出于说明目的给出了本文公开的本发明的具体实施方式、方法和过程。本领域的技术人员将认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的变化是可能的。
工业适用性
本发明在药理学、药物设计和癌症治疗领域具有工业适用性。
所述化合物具有药物和治疗应用。它们选择性地占据特定的受体并应用于治疗前列腺癌和乳腺癌形式的病理病症。
本发明的有益效果
本发明可以提供优于先前已知的用于抑制CYP17A1和CYP19A1的治疗策略和化合物的优点。
例如，在本发明中鉴定的选定化合物表现出双重抑制活性(抑制CYP17A1和CYP19A1两者)。
就对接结果而言，杂环命中证明拟合在CYP17A1酶的活性部位中并且阻断接近与卟啉和半胱氨酸氨基酸五配位的三价铁(+3)。
体外测试的结果表明，本文公开的化合物提供与癌症抗争的附加武器(arsenal)。
引用列表
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表4的参考文献:
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Claims (5)

1.用作药物的化合物，所述化合物选自：
·3-{[(6-羟基-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]甲基}-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺(分子式：C21H18N4O4)[化合物8；Z2230799627]；
·3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]甲基}-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺(分子式：C21H18N4O3)[化合物10；Z2234175518]；
·N-(2-羟苯基)-3-{[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]甲基}苯甲酰胺(分子式：C22H19N3O4)[化合物11；Z2234175520]；
·N-{4-氯-3-[(3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨甲酰基]苯基}-1H-吡唑-4-甲酰胺(分子式：C19H14ClN5O4)[化合物12；Z2234185123]；
·3-{[(6-氯-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪-7-基)氨基]甲基}-N-(吡啶-3-基)苯甲酰胺(分子式：C21H17ClN4O3)[化合物13；Z518027752]。
2.权利要求1中所述的化合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其中，化合物8和11通过抑制CYP19A1酶，或作为CYP19A1酶的抑制剂起效；化合物10、12、13通过抑制CYP17A1酶和/或CYP19A1酶起效，或作为CYP17A1酶和/或CYP19A1酶的抑制剂起效。
3.根据权利要求2中所述的应用，其中所述癌症是前列腺癌。
4.根据权利要求2中所述的应用，其中所述癌症是乳腺癌。
5.一种组合物，其中，所述组合物包括权利要求1中所述的化合物，所述组合物被配制成以下剂型：固体形式、粉末、片剂、胶囊、混悬剂、乳液、无菌溶液、注射剂、栓剂、局部用组合物、以及可吸入组合物。
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