CN108770883A - 一种环境友好的抑藻剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜水浸提液或大蒜乳酸浸提液。本发明与现有技术相比，所述的抑藻剂具有抑藻作用强、环境毒性低的特点。

Description

一种环境友好的抑藻剂
技术领域
本发明属于抑藻剂，特别属于环境友好的抑藻剂这一技术领域。
背景技术
由于水体富营养而频频出现的蓝藻水华暴发已成为全球性环境难题。蓝藻暴发不仅导致水生态环境的恶化，其分泌的藻毒素也给人类健康带来威胁(Alexander et al.,2017)。因此，如何有效减少蓝藻水华肆虐一直是近年来水环境领域的热点研究课题之一(Thomas et al.,2012)。植物的化感作用被认为是一种安全有效的生物学控藻方法(Wanget al.,2017)。大量的研究已经报道如沉水植物穗花狐尾藻(Myriophyllum spicatumL.)、金鱼藻(CeratophyllumdemersumL.)、普生轮藻(Chara vulgaris)均有非常好的抑藻作用，它们分泌的脂肪酸或酚酸类化感物质对水华蓝藻铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)具很强的抑制效应(Lu et al.,2017)；而一些挺水植物如芦苇(Phragmitescommunis)、菖蒲(AcoruscalamusL.)、再力花(Thalia dealbata)等也因为其比较强的吸收氮磷以及化感抑藻作用而被广泛研究和种植。但许多化感物质在抑藻的同时，对环境不友好，容易对水中的动物造成伤害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种环境友好的抑藻剂。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜水浸提液或大蒜乳酸浸提液。
优选的抑藻剂为大蒜乳酸提取液。
所述的大蒜水浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5-6倍体积水，混合均匀，放置于摇床上振摇24-48h，过滤，即可；所述的大蒜水浸液的密度为1.157-1.195mg·mL-1
所述的大蒜乳酸浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5-6倍体积乳酸，混合均匀，放置于摇床上振摇24-48h，过滤，即可；所述的大蒜乳酸浸液的密度为1.302-1.364mg·mL-1
所述的乳酸为乳酸为分析纯，含量99％。
本发明中大蒜(Allium sativum L.)是人类生活中的常用食物，还可强力杀菌，但由于植物中的化感抑藻物质大多为脂溶性，因此其水提液的抑藻效果只能通过增加抑藻物质用量才能达到；而通过有机溶剂分离提取的化感物质在实际应用时仍然由于化感物质的再溶解问题而限制了其使用。
本发明中乳酸是植物无氧代谢产物，是某些植物的化感物质成分之一，经研究表明乳酸具有良好的抑藻性能,而且乳酸也是良好的有机溶剂，无异味，能与水任意互溶。日常生活中，乳酸还是重要的食品添加剂和防腐剂。因此，本发明采用乳酸浸提和萃取大蒜中的有效成分，增强化感物质的溶解性。
本发明中的大蒜的水浸提液和乳酸浸提液均可通过破坏铜绿微囊藻的细胞膜结构，增大细胞膜的通透性，从而抑制藻细胞的生长。并且又没有像其它常见抑藻效果好的化感物质如壬酸、辛酸的刺鼻气味：特别是大蒜的乳酸浸提液的5μL·L-1处理组对于铜绿微囊藻细胞的影响与对照组在24h时就已达到极显著性差异，而在第72h其抑制率就达到90％以上。一般研究化感物质抑藻实验时常采用藻的初始密度为105cells/mL，本发明藻的初始密度为2.5×106cells/mL，藻的密度大，化感物质用量也需增大，但在这样的初始藻密度下，大蒜的乳酸浸提液第48h的EC50仅需要2.05μL·L-1(即0.0028mg·L-1)，这样的效果在以前关于其他化感物质抑藻的研究报道中是未见的。
本发明以模式生物多刺裸腹溞和斑马鱼为实验动物进行了大蒜乳酸浸提液的急性毒性研究。结果表明大蒜乳酸浸提液对多刺裸腹溞和斑马鱼的LC50都远远小于对铜绿微囊藻的EC50，对多刺裸腹溞48h LC50值是0.074mg·L-1，是对同期铜绿微囊藻EC500.0028mg·L-1的26倍，对斑马鱼48h LC50值是0.585mg·L-1，为对铜绿微囊藻EC50的208倍，所以利用大蒜的乳酸浸提液进行抑藻，对环境的毒性是非常非常小的，对环境非常友好。
本发明与现有技术相比，所制的抑藻剂具有抑藻作用强、环境毒性低的特点。
附图说明
图1为对照组的铜绿微囊藻藻细胞扫描电子显微镜图。
图2为浓度为1.25μL/L的实施例4所制的大蒜乳酸浸提液处理过的铜绿微囊藻藻细胞扫描电子显微镜图。
图3为浓度为2.5μL/L的实施例4所制的大蒜乳酸浸提液处理过的铜绿微囊藻藻细胞扫描电子显微镜图。
图4为浓度为5μL/L的实施例4所制的大蒜乳酸浸提液处理过的铜绿微囊藻藻细胞扫描电子显微镜图。
图5为浓度为10μL/L的实施例4所制的大蒜乳酸浸提液处理过的铜绿微囊藻藻细胞扫描电子显微镜图。
图6为浓度为15μL/L的实施例4所制的大蒜乳酸浸提液处理过的铜绿微囊藻藻细胞扫描电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
本发明数据采用Excel 2007软件处理，并通过SPSS16.0分析软件对各组之间差异进行单因素方差分析，P<0.01表示有极显著性差异；P<0.05表示有显著性差异，通过概率单位法求出大蒜乳酸浸提液对铜绿微囊藻的EC50以及对动物急性毒性的LC50。
实施例1：
一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜水浸提液。
所述的大蒜水浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5倍体积水，混合均匀，放置于摇床上振摇24h，过滤，即可；所述的大蒜水浸液的密度为1.195mg·mL-1
实施例2：
一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜水浸提液。
所述的大蒜水浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5.5倍体积水，混合均匀，放置于摇床上振摇36h，过滤，即可；所述的大蒜水浸液的密度为1.162mg·mL-1
实施例3：
一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜水浸提液。
所述的大蒜水浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入6倍体积水，混合均匀，放置于摇床上振摇48h，过滤，即可；所述的大蒜水浸液的密度为1.157mg·mL-1
实施例4
一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜乳酸浸提液。
所述的大蒜乳酸浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5倍体积乳酸，混合均匀，放置于摇床上振摇24h，过滤，即可；所述的大蒜乳酸浸液的密度为1.364mg·mL-1。
实施例5
一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜乳酸浸提液。
所述的大蒜乳酸浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5.5倍体积乳酸，混合均匀，放置于摇床上振摇36h，过滤，即可；所述的大蒜乳酸浸液的密度为1.337mg·mL-1。
实施例6
一种环境友好的抑藻剂，所述的抑藻剂为大蒜乳酸浸提液。
所述的大蒜乳酸浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入6倍体积乳酸，混合均匀，放置于摇床上振摇48h，过滤，即可；所述的大蒜乳酸浸液的密度为1.302mg·mL-1。
实施例7：
抑藻试验
7.1铜绿微囊藻培养条件
铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)购于中国科学院武汉水生生物研究所藻种库。实验前一周，采用BG-11培养基对铜绿微囊藻进行扩大培养，培养条件为：温度(25±1)℃，光照强度4000lx，光暗比为12h：12h，每天摇动3-5次。
大蒜(Allium sativumL.)，购于芜湖市农贸市场。
乳酸为分析纯，含量99％，购于上海国药集团。
7.2铜绿微囊藻生长的抑制率
在已灭菌的锥形瓶(250mL)加入铜绿微囊藻液100mL，藻的初始密度为2.5×106cells/mL，然后各锥形瓶分别加入实施例1所制的大蒜水浸提液、实施例4所制的大蒜乳酸浸提液，分别设置1.25、2.5、5、10、15μL·L-1 5个浓度梯度，同时，设置相同浓度梯度的单独乳酸处理组以及一个不作处理仅含相同藻液的对照组，各组3个平行，置于7.1相同条件下培养。分别于加样后24、48、72和96h取样用血球计数板进行藻细胞计数。铜绿微囊藻生长的抑制率计算公式为：
IR(％)＝(1-N/N0)×100
其中，IR为抑制率；N为实验组藻细胞数；N0为对照组藻细胞数。
7.3不同处理组对铜绿微囊藻生长的影响
表1分别表示的是乳酸、实施例1所制的大蒜水浸提液、实施例4所制的大蒜乳酸浸提液对铜绿微囊藻生长的抑制率。从表1可看出，除了最低浓度组(1.25μL·L-1)，同期大蒜的乳酸浸提液要比乳酸、大蒜水浸提液组的抑制率大，乳酸、大蒜水浸提液在96h达到最大抑制率分别是71.7241％和71.3793％，而大蒜乳酸浸提液10μL·L-1处理组在24h时的抑制率就达到了80％。可以看出，随着大蒜乳酸浸提液浓度的增加，对铜绿微囊藻生长的抑制率显著增大；且在同一浓度下，抑制率也随着处理时间的加长而增大。
大蒜乳酸浸提液处理第72h后，除了最低浓度(1.25μL·L-1)外，其余浓度的实验组抑制率均超过了80％，并在第96h后均超过了90％。其中，最大处理浓度(15μL·L-1)组，在第96h的抑制率已经达到了99.66％，几乎接近于100％。由此表明，大蒜乳酸浸提液对铜绿微囊藻的抑制效果要远好于乳酸以及大蒜水浸提液，且大蒜乳酸浸提液对铜绿微囊藻生长的抑制率与浸提液浓度呈正相关。
表1乳酸、大蒜水浸提液、大蒜乳酸浸提液的抑制率％
7.4藻细胞表面形态的观察
于实验第4d，分别收集对照组、实施例4组中1.25μL/L、2.5μL/L、5μL/L、10μL/L、15μL/L的铜绿微囊藻藻液，2500r/min离心10min，弃上清。采用无菌洁净的BG-11培养基洗涤沉淀2-3次，即向上述离心管中加入无菌培养基，振荡10min左右，然后4000r/min离心10min左右，重复2-3次。将2.5％戊二醛加入离心管中，固定2h后用新鲜配置的0.1％mol·L-1PBS缓冲液清洗2-3次。依次用30％、50％、70％、80％、90％、100％(两次)浓度的乙醇进行逐级脱水，样品在每级停留15-30min。加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合液，浸泡10-20min并适当摇动，离心后弃混合液，再加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20min，并适当摇动。冷冻干燥后用Hitachi H-600扫描电子显微镜对样品进行观察并拍照。
结果显示：对照组(图1)中的铜绿微囊藻细胞个体分明，结构完整，表面光滑；而实施例4所制的大蒜乳酸浸提液处理组藻细胞表面出现絮状不规则物质，且这些絮状物随浸提液浓度的增大而增多：
1.25μL/L(图2)、2.5μL/L(图3)组的细胞间彼此粘连；而5μL/L(图4)、10μL/L(图5)、15μL/L(图6)中几乎没有完整细胞的存在。由此可看出，铜绿微囊藻细胞在大蒜的乳酸浸提液作用下，细胞膜结构首先受到了破坏，导致胞内物质大量渗出，最后细胞裂解死亡。
实施例8：
实施例4所制的大蒜乳酸浸提液的对多刺裸腹溞、斑马鱼的急性毒性试验
8.1多刺裸腹溞的急性毒性试验
多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)由安徽师范大学生命科学学院生态学实验室提供。
多刺裸腹溞在温度为(25±1)℃、自然光照条件下进行克隆培养，所用的培养液曝气自来水制成，用充气泵加速除氧和增加溶解氧量；所用的饵料是由HB-4培养基培养的、处于指数增长期的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，离心浓缩后计数，投喂密度为1.0×106cells·mL-1。
实验使用的多刺裸腹溞为在标准实验条件下经过3代孤雌生殖后所产的幼体。实验在60mL的烧杯中进行，每个烧杯中加入10个幼溞(龄长小于12h)和50mL的培养液(内含密度为1.0×106cells·mL-1的蛋白核小球藻)。
急性毒理实验前，先进行预实验，测定出最大无致死浓度和最小100％致死浓度范围。预实验设计为：将大蒜乳酸浸提液浓度设置为10、20、35、70、95μL·L-1，另设1对照组，每组设3个重复。实验期间不投饵，培养条件同上。48h后观察，记录每个烧杯中多刺裸腹溞的死亡数。根据预实验结果，大蒜乳酸浸提液对多刺裸腹溞的最大无致死浓度为20μL·L-1，最小100％致死浓度为70μL·L-1，故将大蒜乳酸浸提液浓度设置为20、34、48、62、76μL·L-1；另加1个对照组，每组设3个重复，24h后同样观察、记录每个烧杯中多刺裸腹溞的死亡数。
8.2斑马鱼的急性毒性试验
斑马鱼Tubingen品系成鱼，购于芜湖市花鸟市场，采用北京爱生公司研发的斑马鱼培养系统培养，饲料为新鲜孵化的卤虫(天津超鹰牌)。
斑马鱼为体型、长度、大小基本一致的成鱼、实验在1L的烧杯中进行，每个烧杯中加入10只斑马鱼和1000mL的曝气自来水。急性毒理实验前，先进行预实验。
将大蒜乳酸浸提液浓度设置为350、400、450、500、550μL·L-1，另设1对照组，每组设3个重复。实验期间不投饵，培养条件同上。24h后观察，记录每个烧杯中斑马鱼的死亡数。根据实验结果，大蒜乳酸浸提液对斑马鱼的最大无致死浓度为400μL·L-1，最小100％致死浓度为450μL·L-1，故将大蒜乳酸浸提液浓度设置为400、412.5、425、437.5、450μL·L-1，另加1个对照组，每组设3个重复，24h后同样观察、记录每个烧杯中斑马鱼的死亡数。
8.3检测标准
急性毒理实验中，受试个体死亡标准为：用手转动实验容器，沉到容器底部的个体(多刺裸腹溞或斑马鱼)在15s内仍不能游动者就可以认为已经死亡。
结果如表2、3所示：
表2实施例4所制的大蒜乳酸浸提液对多刺裸腹溞以及斑马鱼的毒性实验结果
表3实施例4所制的大蒜乳酸浸提液对多刺裸腹溞以及斑马鱼的LC50及95％置信限
如表2、3所示：多刺裸腹溞以及斑马鱼的死亡率与大蒜乳酸浸提液浓度呈现显著的剂量-效应关系。
实施例4所制的大蒜乳酸浸提液对多刺裸腹溞48h LC50值是54.305μL·L-1，95％置信区间为(49.832～59.596)μL·L-1。根据该大蒜乳酸浸提液的密度(1.364mg·mL-1)，其LC50值为0.074mg·L-1，95％置信区间为(0.068～0.081)mg·L-1，LC50值是大蒜乳酸浸提液对铜绿微囊藻EC50(0.0028mg·L-1)的26倍。
实施例4所制的大蒜乳酸浸提液对斑马鱼48h LC50值是429.119μL·L-1(为0.585mg·L-1)，95％置信区间为(425.508～432.963)μL·L-1(0.581～0.591mg·L-1)。LC50值大约是大蒜乳酸浸提液对铜绿微囊藻EC50(0.0028mg·L-1)的208倍。

Claims (5)

1.一种环境友好的抑藻剂，其特征在于：所述的抑藻剂为大蒜水浸提液或大蒜乳酸浸提液。
2.根据权利要求1所述的一种环境友好的抑藻剂，其特征在于：所述的抑藻剂为大蒜乳酸提取液。
3.根据权利要求1所述的一种环境友好的抑藻剂，其特征在于：
所述的大蒜水浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5-6倍体积水，混合均匀，放置于摇床上振摇24-48h，过滤，即可；所述的大蒜水浸液的密度为1.157-1.195mg·mL-1。
4.根据权利要求2所述的一种环境友好的抑藻剂，其特征在于：
所述的大蒜乳酸浸提液通过以下方法制备：新鲜大蒜鳞茎剥除外皮，用蒸馏水冲洗后用滤纸吸干其水珠，剪碎后放入研钵研磨至大蒜鳞茎小于40目，形成研磨液，在研磨液中加入5-6倍体积乳酸，混合均匀，放置于摇床上振摇24-48h，过滤，即可；所述的大蒜乳酸浸液的密度为1.302-1.364mg·mL-1。
5.根据权利要求2所述的一种环境友好的抑藻剂，其特征在于：所述的乳酸为乳酸为分析纯，含量99％。
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