CN108760733A - 一种宫颈癌尿液检测试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种宫颈癌尿液检测试剂及其应用，该试剂由预处理试剂R1、缓冲试剂R2和显色试剂R3三种试剂组成，其中预处理试剂R1为包括无机杂多酸盐和叶酸的水溶液，缓冲试剂R2为包含十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、TritonX‑100和EDTA的缓冲溶液，显色试剂R3为包括邻苯三酚红、钼酸钠、乙醇和丁二酸‑苯甲酸钠缓冲液制成的显色液。本发明利用无机杂多酸盐和叶酸的水溶液作为待检样品的预处理试剂，充分利用无机杂多酸盐同时具有酸性、氧化还原性等多功能性的催化特点，促进尿液中宫颈癌蛋白标记物显色反应的发生，显著提高诊断结果的灵敏度。本发明的检测试剂可提高宫颈癌筛查率，对于减少宫颈癌的发病率和降低其死亡率有着迫切的现实意义。

Description

一种宫颈癌尿液检测试剂及其应用

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种宫颈癌尿液检测试剂及其应用。

背景技术

宫颈癌是全世界女性常见的恶性肿瘤之一，在危害女性健康的恶性肿瘤中，宫颈癌被列在第三位。据统计，2008年在全球女性所有新发癌症中，新发宫颈癌所占的比例为9％，仅次于乳腺癌和结肠直肠癌。在我国，据统计每年新发子宫颈癌患者约15万例。业已公认高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是宫颈癌发生的必要条件。但从HR-HPV感染妇女诱发宫颈上皮内瘤变(CIN)发展为浸润性宫颈癌(ICC)约需5-20年时间，这为通过筛查发现并治疗癌前病变以降低宫颈癌的发病率和死亡率赢得了时间。

临床实践证明，早期发现宫颈癌治愈率达90％以上。宫颈癌筛查是实现宫颈癌早发现、早诊断和早治疗的重要的二级预防手段。大量研究表明，筛查的实施是近年来欧美各国宫颈癌死亡率下降的主要原因之一。合理的筛查能够早期发现宫颈癌，提高治愈率，减少术后辅助治疗，节省医疗费用，提高患者生活质量。为此，我国已将宫颈癌列为两癌筛查之一。

目前临床上宫颈癌的筛查方法主要有肉眼观察法、细胞学检查法和HPV检测法。细胞学检查因其快速、价廉，是目前最常用的方法，在宫颈筛查中仍起着重要作用，并被许多国家作为常规筛査项目。但细胞学检查并不十分可靠，具有较高的假阴性，通常需要重复检查才能获得满意的敏感度，且巴氏涂片在腺癌检测中的敏感度比鳞癌更低。虽然薄层液基细胞学等新技术的出现改善了细胞学的制片问题，但并没有彻底改变其敏感度低的现状，这也制约着细胞学筛查的发展。HPV检测是宫颈癌筛查的另一项重要方法，在欧洲国家，HPV检测正在取代细胞学检查，成为宫颈病变初筛的首选。HPV检测具有很高的敏感性，在大样本筛査中可查出高风险人群，比细胞学筛查更为有效。但HPV的感染非常普遍，据统计，性活跃妇女终生累积感染率可高达80％。这种感染通常是一过性的，可通过自身免疫系统及时清除，并不导致高度CIN及宫颈癌的发生。因而，HPV检测通常具有较高的假阳性，尤其在年轻女性中其特异性更低。

因此，从宫颈癌筛査及早期诊断的角度出发，有必要寻找新的手段来替代或协助常规筛查方法进行综合判断，使宫颈癌的筛查更加准确和可靠。利用体液样品对患者脱落细胞及其相关产物(包括核酸、蛋白质、糖类、脂类等)进行检测，成为比较简便和可靠的癌症诊断方式。例如，通过对唾液样品进行细胞病理学分析，对分泌的生长因子和其他分子进行检测，用于肺癌、唾液腺癌的诊断；对粪便里的脱落细胞的遗传和表观遗传学基因改变的检测，用于直肠、结肠癌的诊断。研究表明，宫颈癌患者的尿蛋白质组与健康女性的尿蛋白质组不同，并且S100A7和CEACAM8可以作为宫颈癌潜在的肿瘤标志物。因此，对尿液里的脱落的病变上皮脱落细胞的蛋白质的检测，可以用于宫颈癌的诊断。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种宫颈癌尿液检测试剂及其应用，该检测试剂可以直接作用于人体尿液，采用比色法定性检测尿液中病变上皮脱落细胞蛋白质，从而筛查妇女宫颈癌。

为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种宫颈癌尿液检测试剂，所述检测试剂由预处理试剂R1、缓冲试剂R2和显色试剂R3三种试剂组成，其中预处理试剂R1为包括无机杂多酸盐和叶酸的水溶液；缓冲试剂R2为包含十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、TritonX-100和EDTA的缓冲溶液；显色试剂R3为包括邻苯三酚红、钼酸钠、乙醇和丁二酸-苯甲酸钠缓冲液制成的显色液。

进一步地，所述无机杂多酸盐为过渡金属取代的Dawson结构杂多酸盐α₂-[n-(C₄H₉)₄]_(11-n)P₂W₁₇O₆₁(Mⁿ⁺.Br)或饱和Dawson结构杂多酸盐[n-(C₄H₉)₄N]₆P₂W₁₈O₆₂中的至少一种。

进一步地，所述预处理试剂R1中无机杂多酸盐的浓度为1.2-3.5mmol/ml，叶酸的浓度为2.4-6.5mmol/ml。

更进一步地，所述预处理试剂R1中无机杂多酸盐的浓度为1.8-2.5mmol/ml，叶酸的浓度为3.7-5.0mmol/ml。

进一步地，所述缓冲溶液中十二水磷酸氢二钠质量浓度为0.1％-1％、磷酸二氢钾质量浓度为0.01％-0.1％、氯化钾为0.6-1mM、氯化钠100-150mM、TritonX-100质量浓度为0.1％-1％、EDTA 5mM-25mM；所述缓冲试剂R1的溶剂为蒸馏水。

进一步地，所述显色试剂R3中各原料的浓度如下：邻苯三酚红质量浓度为0.01％-0.1％，钼酸钠质量浓度为0.06％-0.18％，乙醇质量浓度为1％-5％，丁二酸-苯甲酸钠缓冲液pH值为4.0-6.0；所述显色试剂R3的溶剂为蒸馏水。

进一步地，该试剂通过显色液R3中的邻苯三酚红与钼酸钠形成的红色复合物，在酸性条件下与蛋白质S100A7和CEACAM8结合形成蓝紫色复合物，根据颜色的变化确定是否患有宫颈癌。

本发明的另一目的在于提供上述任一项所述的宫颈癌尿液检测试剂的应用，所述宫颈癌尿液检测试剂应用于宫颈癌的筛查和辅助诊断方面。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)利用尿液筛查宫颈癌，克服了传统检查方法的不足，一方面增强了受试者的依从性，使加入到宫颈癌筛查的妇女大大增加；另一方面，对于一些未有性生活或者不愿进行妇科检查的妇女提供了新的宫颈癌筛查的途径，这些优势可以提高宫颈癌筛查率，促进宫颈癌的预防和控制工作效率，对于减少宫颈癌的发病率和降低其死亡率有着迫切的现实意义。

(2)本发明利用无机杂多酸盐和叶酸的水溶液作为待检样品的预处理试剂，充分利用无机杂多酸盐同时具有酸性、氧化还原性等多功能性的催化特点，促进尿液中宫颈癌蛋白标记物显色反应的发生，显著提高诊断结果的灵敏度。

(3)本发明的检测试剂制备方便，成本低；使用本发明的检测试剂检测尿液中宫颈癌的蛋白标记物，检测方法操作简单、特异性好、诊断结果更准确。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：

一种宫颈癌尿液检测试剂，检测试剂由预处理试剂R1、缓冲试剂R2和显色试剂R3三种试剂组成；其中预处理试剂R1包括：Dawson结构杂多酸盐α₂-[2-(C₄H₉)₄]₉P₂W₁₇O₆₁(Mⁿ⁺.Br)215.3mg、叶酸135.6mg加入50ml水中，混合均匀；缓冲试剂R2包括：十二水磷酸氢二钠716mg、无水磷酸二氢钾540mg、氯化钾75mg、氯化钠800mg、TritonX-100 100mg、二水EDAT二钠186mg，加入100ml的蒸馏水溶解搅拌均匀；显色试剂R3包括：邻苯三酚红120mg、钼酸钠26.3mg，分别量取乙醇5ml和丁二酸-苯甲酸钠缓冲液12.5ml至50ml的蒸馏水中，溶解搅拌均匀，形成红色复合物。

实施例2：

一种宫颈癌尿液检测试剂，检测试剂由预处理试剂R1、缓冲试剂R2和显色试剂R3三种试剂组成；其中预处理试剂R1包括：Dawson结构杂多酸盐α₂-[2-(C₄H₉)₄]₉P₂W₁₇O₆₁(Mⁿ⁺.Br)289.6mg、叶酸156.7mg加入50ml水中，混合均匀；缓冲试剂R2包括：十二水磷酸氢二钠926mg、无水磷酸二氢钾625mg、氯化钾75mg、氯化钠800mg、TritonX-100 120.5mg、二水EDAT二钠180mg，加入100ml的蒸馏水溶解搅拌均匀；显色试剂R3包括：邻苯三酚红225mg、钼酸钠52.3mg，分别量取乙醇7.5ml和丁二酸-苯甲酸钠缓冲液15ml至50ml的蒸馏水中，溶解搅拌均匀，形成红色复合物。

实施例3：

一种宫颈癌尿液检测试剂，检测试剂由预处理试剂R1、缓冲试剂R2和显色试剂R3三种试剂组成；其中预处理试剂R1包括：Dawson结构杂多酸盐[n-(C₄H₉)₄N]₆P₂W₁₈O₆₂159.6mg、叶酸84.6mg加入50ml水中，混合均匀；缓冲试剂R2包括：十二水磷酸氢二钠817mg、无水磷酸二氢钾425mg、氯化钾50mg、氯化钠800mg、TritonX-100 100mg、二水EDAT二钠180mg，加入100ml的蒸馏水溶解搅拌均匀；显色试剂R3包括：邻苯三酚红225mg、钼酸钠52.3mg，分别量取乙醇7.5ml和丁二酸-苯甲酸钠缓冲液15ml至50ml的蒸馏水中，溶解搅拌均匀，形成红色复合物。

实施例4：尿液中宫颈癌标志物的检测

1、检测对象

选取某医院妇科门诊就诊及体检的130例女性。将试验对象分为3组，第1组为临床确诊的宫颈癌患者65名，第2组为健康人45名，第3组为临床确诊的其它类型癌症患者20名。

2、检测方法

分别取晨尿试样1ml滴入10ml对照溶液10ml和10ml预处理试剂R1，摇匀，静置片刻；然后再加入缓冲试剂R2 20ml后，再加入显色试剂R3 5ml，观察混合物的颜色变化。若两溶液颜色一致则判定为阴性；若两溶液颜色不同，且测试溶液颜色显示的蓝色比对照溶液颜色更深则判定为阳性。

表1 实施例1的检测试剂检测结果

表2 实施例2的检测试剂检测结果

表3 实施例3的检测试剂检测结果

实验结果表明，根据表1、表2和表3结果计算得出，本发明检测试剂的敏感性高于92％，特异性高于93％，由此可见，本发明的检测试剂对宫颈癌的检出率较高，同时抗干扰性较强，具有特异性和准确率双高的特点，可作为有效的宫颈癌筛查试剂。本发明的检测试剂制备方便，成本低；使用本发明的检测试剂检测尿液中宫颈癌的蛋白标记物，检测方法操作简单、不需辅助的仪器设备，不需要冷藏，检测试剂特异性好、诊断结果更准确。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，所述检测试剂由预处理试剂R1、缓冲试剂R2和显色试剂R3三种试剂组成，其中预处理试剂R1为包括无机杂多酸盐和叶酸的水溶液；缓冲试剂R2为包含十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、TritonX-100和EDTA的缓冲溶液；显色试剂R3为包括邻苯三酚红、钼酸钠、乙醇和丁二酸-苯甲酸钠缓冲液制成的显色液。

2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，所述无机杂多酸盐为过渡金属取代的Dawson结构杂多酸盐α₂-[n-(C₄H₉)₄]_(11-n)P₂W₁₇O₆₁(Mⁿ⁺.Br)或饱和Dawson结构杂多酸盐[n-(C₄H₉)₄N]₆P₂W₁₈O₆₂中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，所述预处理试剂R1中无机杂多酸盐的浓度为1.2-3.5mmol/ml，叶酸的浓度为2.4-6.5mmol/ml。

4.根据权利要求3所述的一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，所述预处理试剂R1中无机杂多酸盐的浓度为1.8-2.5mmol/ml，叶酸的浓度为3.7-5.0mmol/ml。

5.根据权利要求1所述的一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，所述缓冲试剂R2中十二水磷酸氢二钠质量浓度为0.1％-1％、磷酸二氢钾质量浓度为0.01％-0.1％、氯化钾为0.6-1mM，氯化钠100-150mM，TritonX-100质量浓度为0.1％-1％、EDTA 5mM-25mM；所述缓冲试剂R2的溶剂为蒸馏水。

6.根据权利要求1所述的一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，所述显色试剂R3中各原料的浓度如下：邻苯三酚红质量浓度为0.01％-0.1％，钼酸钠质量浓度为0.06％-0.18％，乙醇质量浓度为1％-5％，丁二酸-苯甲酸钠缓冲液pH值为4.0-6.0；所述显色试剂R3的溶剂为蒸馏水。

7.根据权利要求1所述的一种宫颈癌尿液检测试剂，其特征在于，该试剂通过显色液R3中的邻苯三酚红与钼酸钠形成的红色复合物，在酸性条件下与蛋白质S100A7和CEACAM8结合形成蓝紫色复合物，根据颜色的变化确定是否患有宫颈癌。

8.如权利要求1-7中任意一项所述的宫颈癌尿液检测试剂的应用，其特征在于，所述宫颈癌尿液检测试剂应用于宫颈癌的筛查和辅助诊断方面。