CN108760443A - 一种病理标本的固定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病理标本的固定方法，属于病理标本处理技术领域，包含以下步骤：将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，常温下晾干；配制固定液；将固定液加入固定缸中，并将固定缸放入恒温箱中，42~48℃恒温保存1.5~2h；将病理标本放入固定液中固定1~1.5h后，取出即可。本发明制备的固定液，不含有甲醛，性能稳定，环保安全，固定效果好，对常见的细菌具有显著的抑制效果。本发明的固定方法能够很好地保存组织细胞离体时具有的生理和病理形态结构及生物化学和免疫化学成分，且本发明固定时间短，固定充分，为制作优秀病理切片奠定坚实的基础，也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术方法赖以成功的基础。
Description
技术领域
本发明属于病理标本处理技术领域，具体涉及一种病理标本的固定方法。
背景技术
病理标本是形态教学和科研的重要材料，也是肿瘤诊断的重要依据，而组织固定是制作诊断切片的关键。活体组织病理诊断是外科疾病诊断的金标准，如果组织自溶、结构破坏、细胞变形就可能导致无法诊断。病理标本自离体后应该及时得到正确的固定，然后送往病理科进行检查，而病理标本处理不当，不仅会带来临床诊断上的困难，甚至对患者的治疗效果也会有影响。
目前，国内大部分医院病理科仍采用传统方法处理常规病理标本，整个过程耗时8~14h，基本能满足日常病理诊断的需要。随着现代医院规模不断扩大、病理科标本量增多、病床周转率逐渐增高的现象日趋凸显，病理诊断报告发放速度需随之加快，这就需要缩短标本处理时间。因此，有些快速组织处理方法也逐渐被多家病理科应用到常规工作中。
在病理制片过程中，组织的固定至关重要。长期以来，中性缓冲甲醛以其可靠的固定性、良好的经济实用性成为病理实验室的首选固定液。其固定的石蜡包埋组织（FFPE）为临床和分子生物学分析提供了丰富的档案材料。但是用甲醛固定组织主要存在以下缺点：①挥发性很强，且其挥发性随着环境温度的升高而加快，甲醛在目前我国有毒化学品控制名单中位列第二，已经被确定为是致癌和致畸物，特别是工作在一线的医生及技术人员长期暴露于甲醛严重超标的环境中，对身体健康造成严重的危害。②易引起组织内形成广泛的蛋白质交联，影响免疫组织化学染色中抗原决定簇的暴露。③易导致 DNA 断裂，交联作用阻碍核酸的提取并局限了DNA片段的PCR扩增产物的长度。而且随着时间的推移，这种交联会越来严重，长期存储可在一定程度上影响高质量DNA和（或）RNA的提取效率。近年来，随着分子生物学技术的不断发展及疾病相关基因研究的不断深入，分子病理学检测已成为病理诊断的重要辅助手段。在形态学、免疫组织化学、相关遗传物质保存等方面优于甲醛的绿色环保固定液成为研究热点。
公开号为CN107367407A的专利文献公开了一种病理标本固定和脱水处理方法，包括以下几个步骤：病理标本组织固定、病理标本组织冲洗、病理标本组织脱水、病理标本组织渗透、病理标本组织浸蜡。该发明采用先用固定液病理标本组织固定，再用自来水清洗干净，能有效去除组织中的血污和不纯的固定液等杂质，保证了脱水机中的固定液的纯度；脱水处理中采用梯度脱水，脱水完全，浸蜡之前采用二甲苯溶液梯度渗透，能有效进行浸蜡，浸蜡均匀，便于后期切片的制作。但是，该方法采用的固定液的成分为甲醛、水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，含有甲醛成分，挥发性强，影响人员的健康，而且该发明用固定液固定标本前未将固定缸清理，含有杂质或细菌，影响诊断结果。
公告号为CN102175496B的专利公开了一种无甲醛组织标本固定液，其包括如下体积份数的组分：乙醇710-790份、冰乙酸20-40份、丙酮10-30份、多元醇40-60份、三氯乙酸40-60份、表面活性剂40-60份、增溶剂40-60份。该无甲醛组织标本固定液采用无毒无害的化学试剂，经细胞形态学实验、免疫组织化学实验、分子病理学实验及核酸提取实验证明，无醛固定液具有较为全面的固定效果，完全可以替代甲醛应用于相关的病理学实验，以完成对组织标本的固定作用。但是，该固定液中含有大量的乙醇，对标本有脱水收缩的作用，长期使用容易使标本失水，固定后的标本形态会有很大改变，有时会对诊断结果造成影响。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种病理标本的固定方法，标本固定彻底，效果好，安全环保，形态保存完整，不会引起标本变硬、变形。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种病理标本的固定方法，包含以下步骤：
S1：将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，常温下晾干；
S2：配制固定液；
S3：将步骤S2得到的固定液加入步骤S1的固定缸中，并将所述固定缸放入恒温箱中，42~48℃恒温保存1.5~2h；
S4：将病理标本放入所述固定液中固定1~1.5h，取出即可。
优选的，所述固定液的组成为：所述固定液的组成为：甘油45-52ml，薄荷醇3~4.2g，异噻唑啉酮1.5~2g，氯化钠30~35g，表面活性剂0.5~0.9g，添加剂8~10g，纯水补至1000ml。
优选的，所述固定液的组成为：甘油49ml，薄荷醇3.8g，异噻唑啉酮1.7g，氯化钠33g，表面活性剂0.7g，添加剂9g，纯水补至1000ml。
优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和脂肪酸失水山梨醇酯中的一种或两种。
优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和脂肪酸失水山梨醇酯的混合物，重量比聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯：脂肪酸失水山梨醇酯为2~3:1。
优选的，所述添加剂由以下重量份的组分制备：甲壳素2~5份、36%的盐酸10~15份、氢氧化钠3~5份、二甲基二硫代氨基甲酸钠5~8份和水20~25份。
优选的，所述添加剂由以下步骤制备：称取甲壳素与36%的盐酸混合，置于搅拌电机中进行第一次搅拌20~30min，然后加入氢氧化钠和水，进行第二次搅拌5~10min，最后加入二甲基二硫代氨基甲酸钠，进行第三次搅拌10~15min。
优选的，所述第一次搅拌的转速为200~300r/min，所述第二次搅拌的转速为500~600r/min，所述第三次搅拌的转速为200~300r/min。
本发明的有益效果是：
本发明先将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，对固定缸进行杀菌，消毒，同时石碳酸水还具备防腐效果，用石碳酸水浸染过，可以防止霉菌感染，更加安全。本发明将加有固定液的固定缸放入恒温箱中，42~48℃恒温保存1.5~2h，将病理标本放入固定液中固定1~2h。本发明将病理标本在42~48℃恒温固定，恒温有利于加快固定液内部分子的运动，有利于增强固定液的渗入，固定更加充分，而且本发明不受外界气候的影响，不会引起组织变硬变形，固定效果更好。采用本发明的固定方法，只需固定1~2h，采用传统的固定方式固定时间为4~15h，本发明明显缩短了固定时间，提高了工作效率。
本发明的固定液，以薄荷醇和异噻唑啉酮为主要杀菌成分，薄荷醇具备特有的薄荷香气，具有止痒、防腐、抗炎作用；异噻唑啉酮与微生物接触后，能迅速地不可逆地抑制其生长，从而导致微生物细胞的死亡，故对常见细菌、真菌、藻类等具有很强的抑制和杀灭作用。杀生效率高，降解性好，具有不产生残留、操作安全、配伍性好、稳定性强、使用成本低等特点。甘油具有防腐性、吸湿性，能够保持病理标本的柔软度，与杀菌成分混合，保持药效不挥发，增强防腐性能和杀菌效果，同时也作为有机溶剂。氯化钠用于维持体系的稳定和平衡，也具有具有杀菌消毒的作用。
表面活性剂聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和脂肪酸失水山梨醇酯均能降低固定液表面的张力，增强组分之间的相容性，与甘油、薄荷醇和异噻唑啉酮相结合，增加与细菌生物膜蛋白质的强烈相互作用使之变性或失去功能，从而达到稳定消毒杀菌的效果，二者混合后效果更佳，同时，表面活性剂协同恒温固定的方法，有助于提高染色效果。添加剂中甲壳素具有防霉杀菌效果，溶于浓盐酸中，具有较强的吸附作用，与甘油复合作用，吸附在标本表面，抑制病原菌萌发，使病原菌的酶钝化，阻止病原菌侵入植物细胞。氢氧化钠用于中和酸碱度；二甲基二硫代氨基甲酸钠防止病菌人侵，起到保护作用，形成一层致密性保护药膜，抑制病菌孢子的萌发和入侵，从而达到杀菌防腐的效果。
本发明制备的固定液，不含有甲醛，性能稳定，环保安全，固定效果好，对常见的细菌具有显著的抑制效果。采用本发明的固定方法能够很好地保存组织细胞离体时具有的生理和病理形态结构及生物化学和免疫化学成分。且本发明固定时间短，固定充分，为制作优秀病理切片奠定坚实的基础，也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术方法赖以成功的基础。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所涉及的病理组织是指具有病变的组织或脏器，并不限于某一特定组织，本领域的技术人员根据普遍知识能够常规选择将某一病理组织采用本发明进行处理，并获得预期的效果。
实施例1~实施例3：以取自（1-1.5cm）×1cm×（0.2-0.3cm）人体甲状腺的病理组织为例。
一种病理标本的固定方法，包含以下步骤：
S1：将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，常温下晾干；
S2：配制固定液；
S3：将步骤S2得到的固定液加入步骤S1的固定缸中，并将所述固定缸放入恒温箱中，42℃恒温保存2h，固定液的体积为标本体积的6~10倍，确保标本能够完全浸入到固定液中；
S4：将病理标本放入所述固定液中固定1.5h，取出即可。
实施例1~3固定液的组成如下表1和表2所示。
表1 固定液中的各组分及重量
其中，实施例1和2的表面活性剂采用的是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯，实施例3的表面活性剂采用的是脂肪酸失水山梨醇酯。
表2 添加剂中的各组分及重量份数
所述添加剂由以下步骤制备：称取甲壳素与36%的盐酸混合，置于搅拌电机中进行第一次搅拌20min，转速为300r/min，然后加入氢氧化钠和水，进行第二次搅拌5min，转速为600r/min，最后加入二甲基二硫代氨基甲酸钠，进行第三次搅拌10min，转速为300r/min。
实施例1~3固定液的制备方法包含以下步骤：取500ml纯水与对应实施例中的氯化钠混合均匀，得到氯化钠溶液，然后依次加入甘油，薄荷醇，异噻唑啉酮，置于搅拌机中，在水浴35~40℃条件下，搅拌5min，转速800r/min，然后加入表面活性剂和添加剂，纯水定容至1000ml，调整转速为300r/min，搅拌45min即可。
实施例4~实施例6：以取自（1-1.5cm）×1cm×（0.2-0.3cm）人体肝脏的病理组织为例。
一种病理标本的固定方法，包含以下步骤：
S1：将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，常温下晾干；
S2：配制固定液；
S3：将步骤S2得到的固定液加入步骤S1的固定缸中，并将所述固定缸放入恒温箱中，48℃恒温保存1.5h，固定液的体积为标本体积的6~10倍，确保标本能够完全浸入到固定液中；
S4：将病理标本放入所述固定液中固定1h，取出即可。
其中，实施例4~6固定液的组成如下表3所示。
表3 固定液中的各组分及重量
实施例4~6的表面活性剂采用的均为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和脂肪酸失水山梨醇酯的混合物，实施例4和5的重量比聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯：脂肪酸失水山梨醇酯为2:1，实施例6的重量比聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯：脂肪酸失水山梨醇酯为3:1。
实施例4~6的添加剂的组成同实施例2，不同的是实施例4~6的添加剂均由以下步骤制备：称取甲壳素与36%的盐酸混合，置于搅拌电机中进行第一次搅拌20min，转速为300r/min，然后加入氢氧化钠和水，进行第二次搅拌5min，转速为600r/min，最后加入二甲基二硫代氨基甲酸钠，进行第三次搅拌10min，转速为300r/min。
实施例4~6固定液的制备方法包含以下步骤：取500ml纯水与对应实施例中的氯化钠混合均匀，得到氯化钠溶液，然后依次加入甘油，薄荷醇，异噻唑啉酮，置于搅拌机中，在水浴35~40℃条件下，搅拌8min，转速600r/min，然后加入表面活性剂和添加剂，纯水定容至1000ml，调整转速为500r/min，搅拌30min即可。
实施例7~实施例9：以取自（1-1.5cm）×1cm×（0.2-0.3cm）人体乳腺的病理组织为例。
一种病理标本的固定方法，包含以下步骤：
S1：将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，常温下晾干；
S2：配制固定液；
S3：将步骤S2得到的固定液加入步骤S1的固定缸中，并将所述固定缸放入恒温箱中，45℃恒温保存1.5h，固定液的体积为标本体积的6~10倍，确保标本能够完全浸入到固定液中；
S4：将病理标本放入所述固定液中固定1.5h，取出即可。
其中，实施例7固定液的组成同实施例4，实施例8固定液的组成同实施例5，实施例9固定液的组成同实施例6。不同的是实施例7~9的添加剂均由以下步骤制备：称取甲壳素与36%的盐酸混合，置于搅拌电机中进行第一次搅拌30min，转速为300r/min，然后加入氢氧化钠和水，进行第二次搅拌10min，转速为500r/min，最后加入二甲基二硫代氨基甲酸钠，进行第三次搅拌10min，转速为200r/min。
实施例7~9固定液的制备方法包含以下步骤：取500ml纯水与对应实施例中的氯化钠混合均匀，得到氯化钠溶液，然后依次加入甘油，薄荷醇，异噻唑啉酮，置于搅拌机中，在水浴35~40℃条件下，搅拌6min，转速700r/min，然后加入表面活性剂和添加剂，纯水定容至1000ml，调整转速为400r/min，搅拌40min即可。
对比例1
本对比例提供的一种病理标本的固定方法，同实施例1，但与实施例1不同的是，本对比例中，步骤S1：将固定缸清洗干净后，常温下晾干。
对比例2
本对比例提供的一种病理标本的固定方法，同实施例2，但与实施例2不同的是，本对比例中，步骤S3：将步骤S2得到的固定液加入步骤S1的固定缸中。
对比例3
本对比例提供的一种病理标本的固定方法，同实施例4，但与实施例4不同的是，本对比例中，固定液的组成和制备方法中未加入表面活性剂。
对比例4
本对比例提供的一种病理标本的固定方法，同实施例5，但与实施例5不同的是，本对比例中，固定液的组成和制备方法中未加入添加剂。
对比例5
本对比例提供的一种病理标本的固定方法，同实施例7，但与实施例7不同的是，本对比例中固定液的制备方法包含以下步骤：取500ml纯水与氯化钠混合均匀，得到氯化钠溶液，然后依次加入甘油，薄荷醇，异噻唑啉酮，表面活性剂和添加剂，纯水定容至1000ml置于搅拌机中，常温搅拌45min，转速400r/min即可。
固定液性能检测
①抑菌实验：取本发明实施例1~9、对比例3~5所得固定液，精确称重后置于无菌锥形瓶中作为样品组，并按上述方法制备不加保存固定液的对照样品组，将十三组分别加入70毫升的磷酸盐缓冲液（0.03moL/L）和5mL铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌液，在25℃、200rpm/min条件下，振荡培养，分别于1小时取样，计算细菌数量变化。每批实验重复4次，计算平均抑菌率。
抑菌率的计算：依据公式X=（A-B）/A×100%，X为抑菌率；A为试验样品振荡前平均菌落数；B为试验样品振荡后平均菌落数。判断标准：不加样品组振荡前后的菌落数差值要在10以内，试验样品抑菌率与对照组样品抑菌率之差＞26%，可判定该产品有抗菌作用。
②稳定性实验：将本发明实施例1~9、对比例3~5所得保存固定液置于4℃、无菌条件下贮存，6个月后重做抑菌实验，观察其抑菌效果，用游标卡尺测量抑菌环直径并记录，抑菌圈直径＞7mm，判定为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等于7mm，判为无抑菌作用；每组实验重复4次。
其中，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、白色念珠菌（ATCC 10231）均购自中国科学院微生物研究所。
本发明实施例1~9、对比例3~5的实验结果如表4所示。
表4 抑菌及稳定性测试结果
由表4可以看出，本发明制备的病理标本固定液对常见的细菌具有显著的抑制作用，经历6个月的稳定性实验后依然保持很强的抑菌效果。而对比例3未添加表面活性剂，具有一定的抑菌效果，但稳定性较差；对比例4未加入添加剂，抑菌和持久性抑菌效果均为最差；对比例5未进行水浴加热，抑菌性能较差。
③固定效果测试：临床采集肺癌组织样本140份，随机分成14组，每组10份，分别采用实施例1~9、对比例1~5的固定方法对上述样本进行固定。每组取5份放置6个月，检测标本的质地、手感和固定液的色质。其余每组的5份按照常规的方法进行相同的脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，由病理专家对染色效果进行评分，病理专家不知道每组病理标本的固定方法，每张切片按照整体形态、整体染色、细胞轮廓、细胞质染色细节、核染色细节、红细胞的完整性等六个方面给出评分，见表5。
1 分：效果欠佳（染色质量严重影响病理诊断会导致出现错误的诊断结果） 。
2 分：效果一般（染色质量不会严重影响病理诊断但是会导致出现错误诊断结果的可能）。
3 分：效果较好（染色质量能够满足病理诊断的需要，但是需要进行改进） 。
4 分：效果优秀（染色质量满足病理诊断的需要）。
表5 固定效果测试结果
经固定后测试，实施例1~9均表现出标本自然正常，未见霉变，质地滑柔，柔软度较明显，固定液清晰透亮，无刺激性气味。而对比例1和对比例4，标本质地硬，对比例2、3、5固定液均出现霉斑，混浊，对比例2标本略硬。本发明适宜长期保存，不发生明显的固缩或膨胀；触感接近原始状态，无明显硬化或软化现象，固定保存效果好。
由表5可以看出，本发明的固定效果好，从整体形态、细胞轮廓、染色效果等各方面综合考虑，实施例1~9均表现出优异的性能，其中，实施例9的性能最优。对比例1未用石碳酸水清洗固定缸，细胞轮廓和整体形态的分值下降最大，说明用石碳酸水清洗杀菌，有利于保存细胞和整体的完整性。对比例2未采用恒温固定，整体染色和细胞质染色效果最差，对比例3未添加表面活性剂，核染色和整体染色均下降明显，说明恒温固定和表面活性剂协同作用有助于提高染色效果，缺少其中一个，对效果产生较大的影响。对比例4未加入添加剂，红细胞的完整性评分最差，说明添加剂有利于保持红细胞的完整性。对比例5制备固定液过程中，未进行水浴加热，整体综合性能均有降低。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种病理标本的固定方法，其特征在于：包含以下步骤：
S1：将固定缸清洗干净后，用质量分数为6%~8%的石碳酸水清洗干净，常温下晾干；
S2：配制固定液；
S3：将步骤S2得到的固定液加入步骤S1的固定缸中，并将所述固定缸放入恒温箱中，42~48℃恒温保存1.5~2h；
S4：将病理标本放入所述固定液中固定1~1.5h后，取出即可。
2.如权利要求1所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述固定液的组成为：甘油45-52ml，薄荷醇3~4.2g，异噻唑啉酮1.5~2g，氯化钠30~35g，表面活性剂0.5~0.9g，添加剂8~10g，纯水补至1000ml。
3.如权利要求2所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述固定液的组成为：甘油49ml，薄荷醇3.8g，异噻唑啉酮1.7g，氯化钠33g，表面活性剂0.7g，添加剂9g，纯水补至1000ml。
4.如权利要求3所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和脂肪酸失水山梨醇酯中的一种或两种。
5.如权利要求3所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和脂肪酸失水山梨醇酯的混合物，重量比聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯：脂肪酸失水山梨醇酯为2~3:1。
6.如权利要求2或3所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述添加剂由以下重量份的组分制备：甲壳素2~5份、36%的盐酸10~15份、氢氧化钠3~5份、二甲基二硫代氨基甲酸钠5~8份和水20~25份。
7.如权利要求6所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述添加剂由以下步骤制备：称取甲壳素与36%的盐酸混合，置于搅拌电机中进行第一次搅拌20~30min，然后加入氢氧化钠和水，进行第二次搅拌5~10min，最后加入二甲基二硫代氨基甲酸钠，进行第三次搅拌10~15min。
8.如权利要求7所述的一种病理标本的固定方法，其特征在于：所述第一次搅拌的转速为200~300r/min，所述第二次搅拌的转速为500~600r/min，所述第三次搅拌的转速为200~300r/min。
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