CN108754022A - 一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测HBV‑pgRNA的试剂盒，其包括扩增试剂；扩增试剂原料包括：HBV‑pgRNA引物探针序列；保护剂，其包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；灵敏度增强剂，其包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX‑100；扩增酶系，其包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；dNTPS。本发明可将核酸的提取和扩增检测在全封闭环境下一体化整合，高效简便，结果准确。

Description

一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒。
背景技术
以RPA恒温扩增技术为核心，将核酸自动提取过程与RPA恒温扩增检 测过程，构建成为一体化的核酸提取与扩增检测系统，对于进一步提高核 酸诊断分析效率，实现整个核酸诊断分析过程的自动化具有重要的现实意 义。
中国专利申请201611064389.1公开了一种HBV病毒的检测方法,包括 如下步骤：从血清中分离得到核酸提取液，获取待测样本；采用荧光定量 PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针PgRNA-FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。
中国专利申请201510900726.5公开了一种用于检测HBV核酸的引物 组、探针、试剂盒及检测样本中HBV核酸的方法，其涉及乙型肝炎病毒核 酸的检测。
中国专利201310689663.4公开了一种应用于生物医学临床诊断领域中 的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒，试剂盒包括磁珠法核酸提取 试剂盒和HBV核酸扩增试剂盒，其中磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合 液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；HBV核酸扩增试剂盒包括HBV-PCR反应液、 酶混合液、HBV-内标、HBV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控 品、强阳性质控品。
上述技术方案的缺陷在于：
检测过程繁琐，多个环节需要增加手工操作；检测时间长；扩增试剂 效率不高、灵敏度低、保存条件苛刻；检测过程开放，容易引起外部环境 与检测试剂交叉污染。
因此，如何提供一种检测过程简便，检测时间短；扩增试剂高效灵敏、 便于保存；检测过程封闭、可有效避免外部环境与检测试剂交叉污染的试 剂盒成为了业界需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种用于检测 HBV-pgRNA的试剂盒，其检测过程简便，检测时间短；扩增试剂高效灵敏、 便于保存；检测过程封闭、可有效避免外部环境与检测试剂交叉污染。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测HBV-pgRNA的试剂 盒，试剂盒包括扩增试剂；扩增试剂原料包括：
HBV-pgRNA引物探针序列；
保护剂，保护剂包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；
灵敏度增强剂，灵敏度增强剂包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX-100；
扩增酶系，扩增酶系包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和 内切酶；
dNTPS。
本发明中，扩增试剂原料各组分混合在一起，呈液态；经过冻干工艺 处理后得到干粉状的扩增试剂。
本发明中，HBV-pgRNA引物探针序列包括：
引物组：
上游引物F1：5’-TAGACCACCAAATGCCCCTAT-3’
下游引物R1：5’-GTGTCGTGTGTTACGGTGTGAGAA-3’,
荧光探针组：P1：5’-GAAACTACTGTTGTT(dT-FAM)A(dSpacer)G(dT-BHQ)ACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGA-3’BHQ1；
内标引物组：
上游引物F2：5’-GGAAGCGGAAGAACTGAACC-3’
下游引物R2：5’-CTAATTTTTTCAGAATCACGTAA-3’,
内标荧光探针：P2：5’-ACACACGCCACTCT(dT-HEX)C(dSpacer)G(dT-BHQ)CAATGTCTTGGGCTC-3’BHQ1。
本发明中，保护剂中各组分在扩增试剂原料中的质量分数分别为海藻 糖10％、蔗糖5％和棉子糖2％。
本发明中，灵敏度增强剂中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为苏 氨酸1M、牛血清白蛋白0.1M和TrisX-1000.5M。
本发明中，扩增酶系中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为重组酶 50ng/μl、辅助酶30ng/μl、单键结合蛋白200ng/μl、聚合酶10ng/μl、 内切酶10ng/μl。
本发明中，dNTPS在扩增试剂原料中的浓度为15mM；dNTPS为脱氧核 糖核苷酸，可为扩增反应提供原料。
本发明中，扩增试剂原料进一步包括逆转录酶，其用量为3U。
本发明解决了核酸提取和核酸扩增检测不能一体化、核酸提取和核酸 扩增检测过程操作繁杂的技术问题，高效简便，结果准确。
根据本发明另一具体实施方式，扩增试剂原料进一步包括反应平台， 反应平台包括缓冲系统和供能系统；缓冲系统包括Tris-SO4(PH8.0)、KCl 和MgCl2；供能系统包括ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。
本方案中，Tris-SO4为硫酸盐缓冲液，可使pH值稳定在8.0，这是扩 增酶系的最佳反应条件。
缓冲系统中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为Tris-SO4100mM、KCl 100mM和MgCl250mM。
供能系统可为扩增反应提供能量，其各组分在扩增试剂原料中的浓度 分别为ATP10mM、磷酸肌酸100mM和肌酸激酶8mM；ATP为腺嘌呤核苷三磷 酸。
根据本发明另一具体实施方式，扩增试剂原料进一步包括聚乙二醇； 聚乙二醇在扩增试剂原料中的浓度为10％，优选为PEG-8000。
本方案中，聚乙二醇具有较高黏度，可在扩增反应时将参与反应的各 物质限定在较小区域，缩短反应距离，加强反应效果。
根据本发明另一具体实施方式，扩增试剂原料通过冻干工艺处理，得 到扩增试剂：冻干工艺包括：
步骤S1：将扩增试剂原料在-55℃环境下放置6h；
步骤S2：将扩增试剂原料在-35℃环境下放置12h；
步骤S3：将扩增试剂原料在-25℃环境下放置4h；
步骤S4：将扩增试剂原料在20℃环境下放置6h。
本方案中，扩增试剂需保存于4℃环境中。
保护剂可使扩增试剂原料中其他组分在冻干过程中不受破坏，保证扩 增反应顺利进行。
灵敏度增强剂可使加强扩增试剂的灵敏度，使之可以检测更低浓度的 样本。
经冻干工艺制得的扩增试剂呈干粉状，易于保存，使用方便。
采用冻干工艺将液体试剂冻干成干粉，主要是为了解决液体试剂长期 在-20℃保存，会出现扩增效率下降、灵敏度低等问题；液体试剂一般都会 在-20℃保存，高于-20℃液体试剂的酶系很容易失去活性，保存条件较高； 干粉试剂可在4℃保存较长时间，十分方便。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒包括：
提取仓，提取仓包括按照样本流向依次分布的裂解机构、洗涤机构和 洗脱机构；裂解机构内设有裂解试剂和磁性物质；洗涤机构包括第一油槽 和洗涤槽，洗涤槽内设有洗涤液；第一油槽位于裂解机构和洗涤槽之间； 洗脱机构包括第二油槽和洗脱槽，洗脱槽内设有洗脱液；第二油槽位于洗 涤槽和洗脱槽之间；第一油槽和第二油槽内均设有油相；相邻两槽之间设 有可活动的隔断；裂解机构与第一油槽之间设有可活动的隔断；
驱动机构，驱动机构包括可按照样本流向滑移的滑块；滑块上设有磁 铁；
扩增管，扩增管位于洗脱机构下游；扩增管与洗脱槽连通。本方案中， 提取仓可以由弹性材料制成。
提取仓中，槽的数量根据所承载试剂或固体物质所需而定，容量可不 尽相同。
磁铁位于滑块中心，其为永磁铁或电磁铁；磁性物质可为磁珠。
驱动机构进一步包括用于驱动滑块运行的动力部件，动力部件可为电 机或气缸。
样本裂解后产生的核酸附着在磁性物质上；滑块运动时，通过磁铁带 动磁性物质运动，从而带动核酸运动。
各槽沿直线分布；在使用过程中，提取仓可以水平放置、竖直放置或 者倾斜放置。
当滑块经过隔断时，驱动机构会使隔断失效，隔断两侧的槽相通；部 分隔断永久失效，部分隔断在滑块经过后再度恢复。
根据本发明另一具体实施方式，裂解机构包括按照样本流向依次分布 的磁性槽、裂解槽和结合槽；裂解机构内，相邻两槽之间设有可活动的隔 断；结合槽与第一油槽之间设有可活动的隔断。
根据本发明另一具体实施方式，裂解机构进一步包括位于磁性槽上游 的样本槽，样本位于样本槽中；裂解试剂包括裂解增强剂和裂解结合液， 分别设于裂解槽和结合槽内；磁性物质设于磁性槽内。
本方案中，样本槽上设有用于添加样本的进料口，进料口上设有样本 盖，用于样本添加后封闭样本槽。
根据本发明另一具体实施方式，提取仓进一步包括缓冲液槽，缓冲液 槽位于洗脱槽下游，且与洗脱槽之间设有可活动的隔断；缓冲液槽位于扩 增管上游，且与扩增管相通。
本方案中，缓冲液槽与扩增管通过连接头相连，连接头上设有出料口； 样本通过出料口从缓冲液槽流入扩增管。
此外，也可以不设扩增管，而在缓冲液槽内进行扩增反应；此时，无 需设置连接头，在缓冲液槽上直接设置出料口，用于扩增反应后样本的流 出。
根据本发明另一具体实施方式，第一油槽和洗涤槽之间设有可上下移 动的密封片；第二油槽和洗脱槽之间设有可上下移动的密封片。
根据本发明另一具体实施方式，裂解机构内，相邻两槽之间设有可脱 落的固定卡片；结合槽与第一油槽之间设有可脱落的固定卡片；洗涤槽和 第二油槽之间设有可脱落的固定卡片；洗脱槽与缓冲液槽之间设有可脱落 的固定卡片。
根据本发明另一具体实施方式，提取仓进一步包括弹性密封膜，弹性 密封膜位于密封片与固定卡片下方，且被密封片与固定卡片压紧。
根据本发明另一具体实施方式，滑块上设有用于顶起密封片或使固定 卡片脱落的楔形块。
本方案中，试剂盒进一步包括上盖、支架和底盖；支架固定在提取仓 上，二者通过粘接、胶结、热粘结等方式结合；上盖和底盖可拆卸地连接， 二者围成一个空腔，提取仓和支架位于空腔内；支架上设有上盖安装孔， 用于与上盖连接。
提取仓底部采用封膜密封，封膜可封住装于提取仓中各个槽内的液体 或固体；封膜与提取仓可以通过粘接、胶结、热粘结等方式结合；弹性密 封膜位于封膜上方，其在固定卡片及密封片的压紧作用下，与封膜贴合， 对各槽之间的液体或固体形成隔离。
固定卡片用于试剂封堵，防止相邻两槽中的试剂相混，其数量根据反 应要求而定；固定卡片两侧分别通过弱支撑连接上盖底部；弱支撑用于连 接固定卡片和上盖，其很容易被切断。
支架上设有用于限制密封片自由度的限位槽，限位槽与密封片对应设 置；密封片用于防止相邻两槽中的试剂相混；上盖内侧顶部设有弹簧安装 孔，其与密封片对应设置；密封片包括用于压紧弹性密封膜的突起和用于 与弹簧配合的销轴，突起位于密封片底部，销轴位于密封片顶部；弹簧一 侧安装于弹簧安装孔内，另一侧套在销轴上。
楔形块的数目为两个，分别位于磁铁两侧；滑块位于底盖外侧。
底盖中部设有用于磁铁移动的驱动槽，两侧设有用于楔形块移动的滑 道；滑块运动时，提取仓位于两个楔形块之间；楔形块可切断弱支撑，使 固定卡片脱落；或者通过其顶部的斜面顶起密封片。
上盖上设有挤出孔，挤出孔位于缓冲液槽上方；挤出孔上连有可开合 的压板，压板向下移动时可挤压洗脱槽和缓冲液槽。
根据本发明另一具体实施方式，相邻两槽之间设有可旋转的密封轴， 密封轴上设有通道。
根据本发明另一具体实施方式，相邻两槽之间设有与密封轴配合的密 封槽，密封槽与密封轴对应设置。
本方案中，试剂盒进一步包括顶盖，顶盖可拆卸地连接提取仓顶端， 并封闭提取仓各槽；提取仓各槽的大小和形状可按需定制，数量根据反应 需求而定。
密封轴上设有旋钮，旋钮位于通道上方；顶盖设有若干旋转孔，其与 密封轴对应设置；旋钮穿过对应的旋转孔。
顶盖进一步包括两个活塞孔，分别位于洗脱槽和缓冲液槽上方；每一 个活塞孔均有一个活塞穿过。
根据本发明另一具体实施方式，扩增管内设有用于实现核酸增量扩增 的扩增试剂，扩增试剂为PCR平台试剂或恒温扩增试剂。
本发明的操作原理如下(磁铁为电磁铁)：
1、将样本加入样本槽，封闭进料口；同时，滑块置于样本槽下方；此 时，磁铁尚未通电，不具有磁性；2、滑块向扩增管方向移动，隔断失效， 液体流入磁性槽；3、滑块继续移动，隔断失效，液体流入裂解槽；4、滑 块继续移动，隔断失效，液体流入结合槽；5、磁性物质均匀扩散到裂解结 合液中；样本被裂解，释放核酸；核酸跟磁性物质结合在一起；6、磁铁通电，开始具有磁性；滑块继续移动，隔断失效，磁性物质流入第一油槽；7、 滑块继续移动，隔断暂时失效，磁性物质流入洗涤槽；当滑块位于洗涤槽 下方时，第一油槽与洗涤槽之间的隔断恢复，继续隔开第一油槽与洗涤槽； 8、磁铁断电，磁性物质均匀扩散到洗涤液中；磁性物质上的杂质被洗掉， 并转移到洗涤液中；9、磁铁通电，滑块继续移动，隔断失效，磁性物质流 入第二油槽；10、滑块继续移动，隔断暂时失效，磁性物质流入洗脱槽； 当滑块位于洗脱槽下方时，第二油槽与洗脱槽之间的隔断恢复，继续隔开 第二油槽与洗脱槽；11、磁铁断电，磁性物质均匀扩散到洗脱液中；磁性 物质上的核酸被洗掉，并转移到洗脱液中；12、磁铁通电，滑块继续移动， 隔断失效，液体流入缓冲液槽；滑块往回运动，停在洗脱槽下方，使磁性 物质保留在洗脱槽中；核酸留在缓冲液槽中；13、在外界挤压下，缓冲液 槽内的液体流入扩增管，并在扩增管内进行核酸扩增。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明可将核酸提取和核酸扩增检测无缝联合，仅需加入样本，1小 时内即可得到结果；整个过程无需再增加操作步骤，且均在全封闭环境下 进行，可有效避免外部环境与检测试剂交叉污染；裂解液、洗涤液、洗脱 液分别固定在单独的液体储存腔，且用油相将液体两两隔开，液体之间不 会相互直接接触，避免交叉污染；扩增管也是单独设置，更有利于进行扩 增反应。
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
附图说明
图1是实施例1的试剂盒的爆炸图；
图2是实施例1的试剂盒的剖视图；
图3是实施例1的支架的结构示意图；
图4是实施例1的上盖的结构示意图；
图5是实施例1的滑块的结构示意图；
图6是实施例1的密封片的结构示意图；
图7是实施例1的试剂盒的整体结构示意图；
图8是实施例2的试剂盒的爆炸图；
图9是实施例2的试剂盒的剖视图；
图10是实施例2的提取仓的结构示意图；
图11是实施例2的顶盖的结构示意图；
图12是实施例2的滑块的结构示意图；
图13是实施例2的密封轴的结构示意图；
图14是实施例2的试剂盒的整体结构示意图；
图15是实施例1的灵敏度检测结果图；
图16是实施例1的重复性检测结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒，如图1-7所示， 其包括提取仓1、裂解机构2、洗涤机构3、洗脱机构4、驱动机构5、扩增 管6、上盖7、支架8和底盖9。
其中，提取仓1由弹性材料制成，其包括按照样本流向依次分布的裂 解机构2、洗涤机构3、洗脱机构4、缓冲液槽101和弹性密封膜104；支 架8固定在提取仓1上，二者通过黏结剂粘合；上盖7和底盖9可拆卸地 连接，二者围成一个空腔，提取仓1和支架8位于空腔内；支架8上设有 上盖安装孔801，用于与上盖7连接。
裂解机构2内设有裂解试剂和磁性物质；磁性物质为磁珠。
洗涤机构3包括第一油槽301和洗涤槽302，洗涤槽302内设有洗涤液； 第一油槽301位于裂解机构2和洗涤槽302之间。
洗脱机构4包括第二油槽401和洗脱槽402，洗脱槽402内设有洗脱液； 第二油槽401位于洗涤槽302和洗脱槽402之间；第一油槽301和第二油 槽401内均设有油相；相邻两槽之间设有可活动的隔断；裂解机构2与第 一油槽301之间设有可活动的隔断。
裂解机构2包括按照样本流向依次分布的样本槽201、磁性槽202、裂 解槽203和结合槽204；裂解机构2内，相邻两槽之间设有可活动的隔断； 结合槽204与第一油槽301之间设有可活动的隔断；样本槽201上设有用 于添加样本的进料口205，进料口205上设有样本盖206，用于样本添加后 封闭样本槽201。
裂解试剂包括裂解增强剂和裂解结合液，分别设于裂解槽203和结合 槽204内；磁性物质设于磁性槽202内。
驱动机构5包括可按照样本流向滑移的滑块501和用于驱动滑块501 运行的动力部件(图中未示)，动力部件为电机；滑块501上设有磁铁502； 磁铁502位于滑块501中心，其为电磁铁。
扩增管6位于洗脱机构4下游；扩增管6与洗脱槽402连通；扩增管 内设有用于实现核酸增量扩增的扩增试剂，扩增试剂为恒温扩增试剂。
扩增试剂原料各组分混合在一起，呈液态；经过冻干工艺处理后得到 干粉状的扩增试剂。
扩增试剂原料包括：HBV-pgRNA引物探针序列、保护剂、灵敏度增强剂、 扩增酶系、dNTPS、反应平台、逆转录酶、聚乙二醇、
HBV-pgRNA引物探针序列包括：
引物组：
上游引物F1：5’-TAGACCACCAAATGCCCCTAT-3’
下游引物R1：5’-GTGTCGTGTGTTACGGTGTGAGAA-3’,
荧光探针组：P1：5’-GAAACTACTGTTGTT(dT-FAM)A(dSpacer)G(dT-BHQ)ACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGA-3’BHQ1；
内标引物组：
上游引物F2：5’-GGAAGCGGAAGAACTGAACC-3’
下游引物R2：5’-CTAATTTTTTCAGAATCACGTAA-3’,
内标荧光探针：P2：5’-ACACACGCCACTCT(dT-HEX)C(dSpacer)G(dT-BHQ)CAATGTCTTGGGCTC-3’BHQ1。
保护剂包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；保护剂中各组分在扩增试剂原料 中的质量分数分别为海藻糖10％、蔗糖5％和棉子糖2％。
灵敏度增强剂包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX-100；灵敏度增强剂 中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为苏氨酸1M、牛血清白蛋白0.1M和 TrisX-1000.5M。
扩增酶系包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；扩 增酶系中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为重组酶50ng/μl、辅助酶 30ng/μl、单键结合蛋白200ng/μl、聚合酶10ng/μl、内切酶10ng/μl。
dNTPS在扩增试剂原料中的浓度为15mM；dNTPS为脱氧核糖核苷酸，可 为扩增反应提供原料。
逆转录酶用量为3U。
反应平台包括缓冲系统和供能系统；缓冲系统包括Tris-SO4(PH8.0)、 KCl和MgCl2；Tris-SO4为硫酸盐缓冲液，可使pH值稳定在8.0；缓冲系统 中各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为Tris-SO4100mM、KCl 100mM和 MgCl250mM。
供能系统包括ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶；供能系统可为扩增反应提供 能量，其各组分在扩增试剂原料中的浓度分别为ATP10mM、磷酸肌酸100mM 和肌酸激酶8mM；ATP为腺嘌呤核苷三磷酸。
聚乙二醇为PEG-8000，其在扩增试剂原料中的浓度为10％；聚乙二醇 具有较高黏度，可在扩增反应时将参与反应的各物质限定在较小区域，缩 短反应距离，加强反应效果。
扩增试剂原料通过冻干工艺处理，得到扩增试剂：冻干工艺包括：
步骤S1：将扩增试剂原料在-55℃环境下放置6h；步骤S2：将扩增试 剂原料在-35℃环境下放置12h；步骤S3：将扩增试剂原料在-25℃环境下 放置4h；步骤S4：将扩增试剂原料在20℃环境下放置6h。
扩增试剂需保存于4℃环境中。
保护剂可使扩增试剂原料中其他组分在冻干过程中不受破坏，保证扩 增反应顺利进行。
灵敏度增强剂可使加强扩增试剂的灵敏度，使之可以检测更低浓度的 样本。
经冻干工艺制得的扩增试剂呈干粉状，易于保存，使用方便，可减少 扩增反应时间。
为检测扩增试剂效果，进行灵敏度检测和重复性检测；实验结果如图 15和16所示,图15为10000copies、1000copies、100copies、10copies、 5copies灵敏度检测结果。从图中看出，浓度检测限为10copies。图16为 100copies重复性检测结果，从图中看出，试剂重复性良好。
缓冲液槽101位于洗脱槽402下游，且与洗脱槽402之间设有可活动 的隔断；缓冲液槽101位于扩增管6上游，且与扩增管6相通；缓冲液槽 101与扩增管6通过连接头102相连，连接头102上设有出料口103；样本 通过出料口103从缓冲液槽101流入扩增管6；上盖7上设有挤出孔701， 挤出孔701位于缓冲液槽101上方；挤出孔701上连有可开合的压板702，压板702向下移动时可挤压洗脱槽402和缓冲液槽101。
第一油槽301和洗涤槽302之间设有可上下移动的密封片11；第二油 槽401和洗脱槽402之间设有可上下移动的密封片11；支架8上设有用于 限制密封片11自由度的限位槽802，限位槽802与密封片11对应设置；密 封片11用于防止相邻两槽中的试剂相混；上盖7内侧顶部设有弹簧安装孔703，其与密封片11对应设置；密封片11包括用于压紧弹性密封膜104的 突起1101和用于与弹簧13配合的销轴1102，突起1101位于密封片11底 部，销轴1102位于密封片11顶部；弹簧13一侧安装于弹簧安装孔703内， 另一侧套在销轴1102上。
裂解机构2内，相邻两槽之间设有可脱落的固定卡片12；结合槽204 与第一油槽301之间设有可脱落的固定卡片12；洗涤槽302和第二油槽401 之间设有可脱落的固定卡片12；洗脱槽402与缓冲液槽101之间设有可脱 落的固定卡片12；固定卡片12用于试剂封堵，防止相邻两槽中的试剂相混； 固定卡片12两侧分别通过弱支撑1201连接上盖7底部。
弹性密封膜104位于密封片11与固定卡片12下方，且被密封片11与 固定卡片12压紧。
滑块501上设有用于顶起密封片11或使固定卡片12脱落的楔形块503； 楔形块503的数目为两个，分别位于磁铁502两侧；滑块501位于底盖9 外侧；底盖9中部设有用于磁铁502移动的驱动槽901，两侧设有用于楔形 块503移动的滑道902；滑块501运动时，提取仓1位于两个楔形块503之 间；楔形块503可切断弱支撑1201，使固定卡片12脱落；或者通过其顶部 的斜面顶起密封片11。
本实施例中，提取仓1底部采用封膜105密封，封膜105可封住装于 提取仓1中各个槽内的液体或固体；封膜105与提取仓1通过黏结剂粘合； 弹性密封膜104位于封膜105上方，其在固定卡片12及密封片11的压紧 作用下，与封膜105贴合，对各槽之间的液体或固体形成隔离。
本实施例的使用方法如下：
1、取下样本盖206，向样本槽201加入样本，盖上样本盖206；2、在 动力部件驱动下，滑块501往扩增管6方向移动；当滑块501经过固定卡 片12时，楔形块503切断固定卡片12两侧的弱支撑1201；固定卡片12脱 落，密封作用失效；被固定卡片12顶紧密封的弹性密封膜104在自身弹性 作用下弹起，且永不恢复密封状态；此时形成通路，位于通路两侧槽内的 液体连通；3、样本流入磁性槽202，磁性物质携带样本信息；在磁铁502 作用下，携带样本信息的磁性物质随滑块501继续移动；经过固定卡片12 时，重复步骤2；4、当滑块501经过密封片11时，密封片11在楔形块503 经过时弹起，被密封片11顶紧密封的弹性密封膜104在自身弹性作用下弹 起；磁性物质随滑块501通过；在楔形块503通过后，密封片11在弹簧13作用下再次压紧弹性密封膜104，重新阻断其两侧液体；5、当磁性物质保 留在洗脱槽402中，而核酸留在缓冲液槽101中时，压板702向下移动， 挤压洗脱槽402和缓冲液槽101；缓冲液槽101内的液体流入扩增管6，并 在扩增管6内进行PCR扩增。
实施例2
本实施例提供了一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒，如图8-14所示， 其包括提取仓21、裂解机构22、洗涤机构23、洗脱机构24、驱动机构25、 扩增管26和顶盖27。
其中，提取仓21包括按照样本流向依次分布的裂解机构22、洗涤机构 23、洗脱机构24和缓冲液槽2101。
裂解机构22内设有裂解试剂和磁性物质；磁性物质为磁珠。
洗涤机构23包括第一油槽2301和洗涤槽2302，洗涤槽2302内设有洗 涤液；第一油槽2301位于裂解机构22和洗涤槽2302之间。
洗脱机构24包括第二油槽2401和洗脱槽2402，洗脱槽2402内设有洗 脱液；第二油槽2401位于洗涤槽2302和洗脱槽2402之间；第一油槽2301 和第二油槽2401内均设有油相；相邻两槽之间设有可活动的隔断；裂解机 构22与第一油槽2301之间设有可活动的隔断。
裂解机构22包括按照样本流向依次分布的样本槽2201、磁性槽2202、 裂解槽2203和结合槽2204；裂解机构22内，相邻两槽之间设有可活动的 隔断；结合槽2204与第一油槽2301之间设有可活动的隔断；样本槽2201 上设有用于添加样本的进料口2205，进料口2205上设有样本盖2206，用 于样本添加后封闭样本槽2201。
裂解试剂包括裂解增强剂和裂解结合液，分别设于裂解槽2203和结合 槽2204内；磁性物质设于磁性槽2202内。
驱动机构25包括可按照样本流向滑移的滑块2501和用于驱动滑块 2501运行的动力部件(图中未示)，动力部件为电机；滑块2501上设有磁 铁2502；磁铁2502位于滑块2501中心，其为电磁铁。
扩增管26位于洗脱机构24下游；扩增管26与洗脱槽2402连通；扩 增管内设有用于实现核酸增量扩增的扩增试剂，扩增试剂为恒温扩增试 剂。
缓冲液槽2101位于洗脱槽2402下游，且与洗脱槽2402之间设有可活 动的隔断；缓冲液槽2101位于扩增管26上游，且与扩增管26相通；缓冲 液槽2101与扩增管26通过连接头2102相连，连接头2102上设有出料口 2103；样本通过出料口2103从缓冲液槽2101流入扩增管26。
本实施例中，相邻两槽之间设有可旋转的密封轴28，密封轴28上设有 通道2801和旋钮2802，旋钮2802位于通道2801上方；顶盖27可拆卸地 连接提取仓21顶端，并封闭提取仓21各槽；相邻两槽之间设有与密封轴 28配合的密封槽29，密封槽29与密封轴28对应设置。
顶盖27设有若干旋转孔2701和两个活塞孔2702，其与密封轴28对应 设置；旋钮2802穿过对应的旋转孔2701；两个活塞孔2702分别位于洗脱 槽2402和缓冲液槽2101上方；每一个活塞孔2702均有一个活塞2703穿 过。
本实施例的使用方法如下：
1、取下样本盖2206，加入样本，盖上样本盖2206；此时，通道2801 与其两侧槽之间的连线垂直，防止两槽内的物质流通，起到隔离的作用；
2、在动力部件驱动下，滑块2501往扩增管26方向移动；当滑块2501 经过密封轴28时，密封轴28旋转90°，通道2801将相邻两槽连通；
3、样本经通道2801流入磁性槽2202，磁性物质携带样本信息；在磁 铁2502作用下，携带样本信息的磁性物质随滑块2501继续移动；经过密 封轴28时，重复步骤2；第一油槽2301和洗涤槽2302之间的密封轴28以 及第二油槽2401和洗脱槽2402之间的密封轴28在滑块2501经过后，旋 转90°，重新封闭两侧槽；其余密封轴28不再旋转；
4、当磁性物质保留在洗脱槽2402中，而核酸留在缓冲液槽2101中时， 向下推动活塞2703，挤压缓冲液槽2101；缓冲液槽2101内的液体流入扩 增管26，并在扩增管26内进行PCR扩增。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：不设扩增管，而在缓冲液槽内进行 扩增反应；此时，无需设置连接头，在缓冲液槽上直接设置出料口，用于 扩增反应后样本的流出。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于：提取仓竖直放置。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：缓冲液槽和扩增管之间设有第三油 槽，第三油槽内设有油相；缓冲液槽与第三油槽之间设有可脱落的固定卡 片，扩增管与第三油槽之间设有可脱落的固定卡片。
虽然本发明以较佳实施例揭露如上，并非用以限定本发明实施的范围。 任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许 的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。

Claims (10)

1.一种用于检测HBV-pgRNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括扩增试剂；所述扩增试剂原料包括：
HBV-pgRNA引物探针序列；
保护剂，所述保护剂包括海藻糖、蔗糖和棉子糖；
灵敏度增强剂，所述灵敏度增强剂包括苏氨酸、牛血清白蛋白和TrisX-100；
扩增酶系，所述扩增酶系包括重组酶、辅助酶、单键结合蛋白、聚合酶和内切酶；
dNTPS。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述扩增试剂原料进一步包括反应平台，所述反应平台包括缓冲系统和供能系统；所述缓冲系统包括Tris-SO4(PH8.0)、KCl和MgCl2；所述供能系统包括ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述扩增试剂原料进一步包括聚乙二醇。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述扩增试剂原料通过冻干工艺处理，得到所述扩增试剂：所述冻干工艺包括：
步骤S1：将所述扩增试剂原料在-55℃环境下放置6h；
步骤S2：将所述扩增试剂原料在-35℃环境下放置12h；
步骤S3：将所述扩增试剂原料在-25℃环境下放置4h；
步骤S4：将所述扩增试剂原料在20℃环境下放置6h。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
提取仓，所述提取仓包括按照样本流向依次分布的裂解机构、洗涤机构和洗脱机构；所述裂解机构内设有裂解试剂和磁性物质；所述洗涤机构包括第一油槽和洗涤槽，所述洗涤槽内设有洗涤液；所述第一油槽位于所述裂解机构和所述洗涤槽之间；所述洗脱机构包括第二油槽和洗脱槽，所述洗脱槽内设有洗脱液；所述第二油槽位于所述洗涤槽和所述洗脱槽之间；所述第一油槽和所述第二油槽内均设有油相；相邻两槽之间设有可活动的隔断；所述裂解机构与所述第一油槽之间设有可活动的隔断；
驱动机构，所述驱动机构包括可按照样本流向滑移的滑块；所述滑块上设有磁铁；
扩增管，所述扩增管位于所述洗脱机构下游；所述扩增管与所述洗脱槽连通。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，所述裂解机构包括按照样本流向依次分布的磁性槽、裂解槽和结合槽；所述裂解机构内，相邻两槽之间设有可活动的隔断；所述结合槽与所述第一油槽之间设有可活动的隔断。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述裂解机构进一步包括位于所述磁性槽上游的样本槽，样本位于所述样本槽中；所述裂解试剂包括裂解增强剂和裂解结合液，分别设于所述裂解槽和所述结合槽内；所述磁性物质设于所述磁性槽内。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，所述提取仓进一步包括缓冲液槽，所述缓冲液槽位于所述洗脱槽下游，且与所述洗脱槽之间设有可活动的隔断；所述缓冲液槽位于所述扩增管上游，且与所述扩增管相通。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述第一油槽和所述洗涤槽之间设有可上下移动的密封片；所述第二油槽和所述洗脱槽之间设有可上下移动的密封片；所述裂解机构内，相邻两槽之间设有可脱落的固定卡片；所述结合槽与所述第一油槽之间设有可脱落的固定卡片；所述洗涤槽和所述第二油槽之间设有可脱落的固定卡片；所述洗脱槽与所述缓冲液槽之间设有可脱落的固定卡片；所述提取仓进一步包括弹性密封膜，所述弹性密封膜位于所述密封片与所述固定卡片下方，且被所述密封片与所述固定卡片压紧；所述滑块上设有用于顶起所述密封片或使所述固定卡片脱落的楔形块。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其中，相邻两槽之间设有可旋转的密封轴，所述密封轴上设有通道；相邻两槽之间设有与所述密封轴配合的密封槽，所述密封槽与所述密封轴对应设置。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118222A (zh) * 2020-02-26 2020-05-08 珠海丽珠试剂股份有限公司 Hbv检测试剂盒及其使用方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966323A (zh) * 2014-04-25 2014-08-06 广州迪澳生物科技有限公司 可常温运输的干粉化恒温扩增检测试剂及其制备方法
CN104673621A (zh) * 2013-11-29 2015-06-03 精工爱普生株式会社 核酸扩增反应用容器、核酸扩增反应用筒及核酸扩增反应用筒试剂盒
CN106755414A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测dna遗传标记的方法
CN107058623A (zh) * 2016-04-01 2017-08-18 北京大学 一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法
CN107151700A (zh) * 2017-06-08 2017-09-12 杭州遂真生物技术有限公司 一种基因检测方法及基因检测试剂盒和基因检测设备
WO2017198863A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Roche Diagnostics Gmbh Cell surface marker-depletion in a sample processing device
CN107916296A (zh) * 2017-12-29 2018-04-17 苏州点晶生物科技有限公司 弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104673621A (zh) * 2013-11-29 2015-06-03 精工爱普生株式会社 核酸扩增反应用容器、核酸扩增反应用筒及核酸扩增反应用筒试剂盒
CN103966323A (zh) * 2014-04-25 2014-08-06 广州迪澳生物科技有限公司 可常温运输的干粉化恒温扩增检测试剂及其制备方法
CN107058623A (zh) * 2016-04-01 2017-08-18 北京大学 一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法
WO2017198863A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Roche Diagnostics Gmbh Cell surface marker-depletion in a sample processing device
CN106755414A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测dna遗传标记的方法
CN107151700A (zh) * 2017-06-08 2017-09-12 杭州遂真生物技术有限公司 一种基因检测方法及基因检测试剂盒和基因检测设备
CN107916296A (zh) * 2017-12-29 2018-04-17 苏州点晶生物科技有限公司 弓形虫核酸快速检测引物组、试剂盒和检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOSAM ZAGHLOUL等: "Recombinase polymerase amplication as promising tool in hepatits C virus diagnosis", 《WORLD J HEPATOL.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118222A (zh) * 2020-02-26 2020-05-08 珠海丽珠试剂股份有限公司 Hbv检测试剂盒及其使用方法和应用

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