CN108753801A - 能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列，并证明了该序列能够用于在农杆菌中直接实现重组克隆的筛选。农杆菌是植物转化系统重要宿主菌，但是构建的重组克隆需要在大肠杆菌中筛选之后转入农杆菌。本发明发现了大豆花叶病毒株系SC15具有抑制农杆菌生长的特性，而株系SC3和SC7没有同样的效果；通过病毒序列截短实验，本发明鉴定出SC15中农杆菌生长抑制相关的序列SC15P；通过利用该序列构建与gateway克隆系统兼容载体并进行LR反应及转化实验，最终本发明实现了利用SC15P直接在农杆菌中进行重组克隆的设想。

Description

能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列及其应用。

背景技术

农杆菌属于细菌界变形菌门根瘤菌目根瘤菌科，是一种革兰氏阴性菌。农杆菌能够将自身的一段DNA序列转移并插入到植物的DNA中，这使其成为一种重要的植物转基因工具，广泛应用于植物的遗传转化和瞬时表达实验中。然而，农杆菌很少直接用作重组克隆筛选的宿主菌。农杆菌侵染实验中所使用的重组克隆通常需要事先在大肠杆菌等其他微生物中筛选鉴定，这不仅使实验过程过于繁琐，更是增加了实验的耗时。

重组克隆筛选技术是现代分子生物科学研究的基础技术，在几十年的发展中得以快速完善。重组克隆构建筛选的常用策略有两类。第一类基于抗生素抗性基因的正筛选，这类基因可以使携带含有抗生素抗性基因质粒的微生物在含有相应的抗生素平板上生长，从而能够筛选到含有重组质粒的单菌落；第二类基于抑制微生物生长的基因的负筛选，这类基因通常预先连接到目标载体上，通过外源片段与之交换形成新的不含有生长抑制基因的重组克隆，从而在生长出的菌落里获得正确重组的克隆。第二类策略需要同第一类策略联用来实现重组克隆的构建筛选，这方面应用比较成功的为英潍捷基的gateway载体构建法(利用ccdb基因实现重组克隆的筛选)，这个方法也是应用较早的不必使用内切酶的载体高效构建方法。但是ccdb基因不能抑制农杆菌的生长，也不能用于在农杆菌中进行重组克隆的筛选。

大豆花叶病毒属于马铃薯Y病毒属病毒，基因组编码11个成熟蛋白(P1,HC-Pro,P3,P3N-PIPO,6K1,CI,6K2,NIa-VPg,NIa-Pro,NIb和CP)，因其能够侵染大豆并在叶片上形成花叶症状而得名。在中国，我们利用10个鉴别寄主将大豆花叶病毒不同分离物划分为SC1-SC21共21个株系。大豆花叶病毒整个生活史大部分阶段为在植物体内进行复制、装配和运输，其传播可以依赖同蚜虫体内受体蛋白的互作来实现。但是，至今没有关于马铃薯Y病毒属病毒与农杆菌互作的报道。

发明内容

本发明的目的是提供能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列。

本发明的另一目的是提供该序列在基因工程方面的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒基因，包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明所述的大豆花叶病毒基因在抑制农杆菌生长中的应用。

所述的大豆花叶病毒基因优选自SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

我们构建了3个SMV的病毒克隆载体。将这3个病毒克隆载体转化到农杆菌EHA105菌株，转化两天之后，转有pCB301-SC3(#SC3)和pCB301-SC7(#SC7)的农杆菌可以正常生长，然而转有pCB301-SC15(#SC15)的农杆菌却未见生长(图1)。为了得到能够抑制农杆菌生长的最短序列，我们构建了一系列包含不完整SC15的克隆载体(图2)并转化农杆菌。我们发现能够抑制农杆菌生长的基因序列包含编码P1,HC-Pro,P3,P3N-PIPO,6K1,CI,6K2,NIa-VPg,NIa-Pro,NIb的序列，截短后会导致抑制能力的下降。

所述的大豆花叶病毒基因在基因工程中的应用。

所述的大豆花叶病毒基因在构建重组克隆受体载体中的应用。

所述的应用，优选将所述的大豆花叶病毒基因预先构建到载体中作为受体载体，然后将目标基因片段与受体载体进行重组反应，实现目标基因片段仅直接转化农杆菌就能够进行重组克隆的目的。

本发明所述的大豆花叶病毒基因优选自SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明设计了基于LR反应的克隆重组及筛选实验。首先我们构建了含有SC15P的用于LR反应的载体pCB301-attL-SC15P(图3A)，随后，我们将pCB301-attL-SC15P分别和pDonor-CI及pDonor-Avh241进行LR反应。反应液直接转化农杆菌，两天后对长出的单菌落进行菌液PCR检测，检测结果表明所有挑取的单菌落含有的都是正确重组的克隆(图3B)。证明SC15P能够用于在农杆菌中直接实现重组克隆的筛选。

有益效果：

本发明公开的能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列是首次有关病毒序列能够抑制农杆菌生长的发现，并且该序列对农杆菌的抑制能力极其显著，具有很大的潜在应用价值。

本发明提出并以实验证实了能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列能够用于在农杆菌中直接实现重组克隆的筛选，并且筛选正确重组克隆的效率达到100％，实用性表现优异。

利用本发明直接在农杆菌中实现对重组克隆的筛选，有助于我们在农杆菌相关的遗传转化实验中跳过利用大肠杆菌筛选重组克隆的步骤，实现实验进程的快速推进。

附图说明

图1 pCB301-SC15对农杆菌生长的抑制现象；A：病毒克隆载体的结构，显示LB与RB之间的元件；B：转化pCB301-SC3、pCB301-SC7和pCB301-SC15后的农杆菌生长状况，标尺长度为4mm；

图2#SC15截短后转化农杆菌后的生长情况；A：#SC15截短位置及转化农杆菌后的生长情况图示，+表示农杆菌能够生长，—表示农杆菌无法生长；B：截短SC15病毒克隆载体转化农杆菌生长情况照片，#S1至#SC15中标尺长度为4mm，#S4L图为#S4细节图，标尺长度为0.4mm；

图3SC15农杆菌生长抑制序列在筛选重组克隆中的应用；A：pCB301-attL-SC15P载体图示，显示LB与RB之间的元件；B：各载体转化农杆菌后的生长情况照片。其中a为pCB301-attL-SC15P，b、d分别为pDonor-CI和pDonor-Avh241，c、e分别为pDonor-CI和pDonor-Avh241与pCB301-attL-SC15P进行LR反应之后的产物转化农杆菌生长结果，标尺长度为4mm；C：农杆菌菌落PCR检测，c为B中c平板菌落PCR结果，e为B中e平板菌落PCR结果，其中泳道M为DNA marker DL5000，泳道N为阴性对照，其它泳道为不同单菌落为模板的菌落PCR结果。

具体实施方式

实施例1：大豆花叶病毒中农杆菌生长抑制序列的发现

1、大豆花叶病毒克隆载体的构建

我们从新鲜的SMV侵染的大豆叶片中使用trizol提取总RNA；总RNA使用TAKARA的primescript^TMii 1st strand cdna synthesis kit反转录为cDNA。使用cDNA为模板，我们将SMV分为5段扩增并纯化回收。回收后的上述各个PCR片段(如1a、2a、3a、4a、5a五个片段)直接与使用StuI和SmaI线性化的pCB301载体共同转化Clontech公司的酵母菌株Y2Hgold，并使用SD/-Trp培养基筛选重组克隆。从酵母单菌落中提取的质粒使用PCR及测序进行验证后进行质粒的扩繁。构建成功的病毒克隆分别命名为pCB301-SC3(#SC3)、pCB301-SC7(#SC7)和pCB301-SC15(#SC15)。各PCR片段获得策略如下：1a、2a、3a、4a、1b、2b、3b、4b、1c、2c、3c和4c片段的获得：使用相应的大豆花叶病毒SC3\SC7\SC15的cDNA为模板使用表1中对应引物进行普通PCR程序进行即可；5a片段的获得：首先使用SC3的cDNA为模板，使用引物SMV-frag5a-F和SMV-frag5a-R-1进行PCR得到第一次PCR产物，然后使用第一次PCR产物作为模板，使用SMV-frag5a-F和SMV-frag5a-R-2进行PCR得到第二次PCR产物，最后使用第三次PCR产物作为模板，使用SMV-frag5a-F和SMV-frag5a-R-3进行PCR得到5a片段；5b片段的获得：方法与5a片段的获得一致，只需将第一次的模板换成SC7的cDNA；5c片段的获得：方法与5a片段的获得一致，需要将第一次的模板换成SC15的cDNA，且第一次PCR引物换成SMV-frag5a-F(6067)和SMV-frag5a-R-1。构建各载体所用引物的序列见表1。

从酵母单菌落中提取的质粒的PCR验证方法：使用质粒为模板，使用构建相应病毒载体时扩增5个片段所用的引物进行PCR(5a、5b和5c片段的扩增使用第三次PCR的引物，即SMV-frag5a-F和SMV-frag5a-R-3)，所有片段大小符合预期即可。

PCR体系及程序：每个反应50μl：模板1μl，上下游引物各1μl(浓度10μM)，双蒸水9.5μl，Prime STAR Max DNA Polymerase(Takara公司)25μl。程序：预变性：95℃，2min；30个循环：变性98℃，5sec，退火57℃，15sec，延伸72℃，1min 30sec；最后降温到12℃。

本实例所用的SMV保存于国家大豆改良中心，其基因组序列分别对应GenBank中的SC3(JF833015.1)、SC7(KT285170.1)和SC15(JF833015.1)。

表1构建载体所用引物

2、各克隆载体转化农杆菌及农杆菌生长抑制现象的发现

我们使用上述构建成功的大豆花叶病毒克隆载体转化农杆菌菌株EHA105，转化方法为冻融法，转化后的菌液于28℃复苏2小时后涂板于直径9cm的YEP培养基平板上(含有50ng/ml的kan和25ng/ml的Rif)在28℃的恒温箱中培养48小时，并使用体视显微镜拍照。观察发现，转有pCB301-SC3(#SC3)和pCB301-SC7(#SC7)的农杆菌可以正常生长，然而转有pCB301-SC15(其中#SC15基因序列如SEQ ID NO.1所示)的农杆菌却未见生长(图1)。

pCB301-SC15中抑制农杆菌生长的具体序列的明确

为了得到能够抑制农杆菌生长的最短序列，我们构建了一系列包含不完整SC15的克隆载体(#S1至#S12)(图2A)。#S1构建过程：首先以#SC15的质粒作为模板，使用引物HCPRO-recF和pCB301-REC-R进行PCR扩增获得片段1g并纯化回收，然后将回收后的1g片段与使用StuI和SmaI线性化的pCB301载体进行同源重组反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α并涂含有卡那霉素的LB平板培养基上培养16小时。最后挑取单菌落摇菌提取质粒，使用引物HCPRO-recF和pCB301-REC-R检测片段是否正确插入。#S2至#S12的构建过程和#S1一致。同源重组所用的试剂盒为南京诺唯赞公司的ClonExpress- II One Step Cloning Kit试剂盒，操作说明见说明书。构建各载体所用引物见表2。观察转化#S1与#S2转化结果发现只要P1序列被删除，克隆载体就不能再抑制农杆菌生长，这进一步验证了上面的实验结果(图2B)。观察转化#S3、#S10、#S11、#S12的农杆菌发现，UTR序列和CP序列的删除并没有影响到克隆载体对农杆菌的抑制，说明UTR和CP序列不是抑制农杆菌生长所必须的。观察转化#S4至#S9，我们发现随着3’端病毒序列的截短，农杆菌生长越来越明显，抑制能力显著下降(图2B)。我们将#S3中能够够抑制农杆菌生长的较小序列命名为SC15P，序列如SEQ ID NO.2所示。

表2构建载体所用引物

实施例2：SC15农杆菌生长抑制序列在高效筛选重组克隆中的应用

1、pCB301-attL-SC15P载体的构建

我们将pCB301载体LB和RB之间的序列替换成attL1及attL2序列，并在attL1和attL2序列之间插入能够抑制农杆菌生长的较小片段SC15P，构建成为的载体命名为pCB301-attL-SC15P(图3A，pCB301-attL-SC15P全序列见SEQ ID NO.3)。pCB301-attL-SC15P的构建过程如下：首先用pGWB5质粒为模板，使用引物attL1-301REC和attL2-301REC进行PCR扩增获得片段1s，用pCB301质粒为模板，使用引物301-frag-F和301-frag-R进行PCR扩增获得片段2s，将纯化后的1s和2s片段通过南京诺唯赞公司的ClonExpress- II OneStep Cloning Kit试剂盒进行连接并转化大肠杆菌DH5α，然后挑取单菌落摇菌并提取质粒获得载体pCB301-attL-ccdB；然后用pCB301-attL-ccdB质粒为模板，使用引物attR1和attR2进行PCR扩增获得片段1t，用#SC15质粒为模板，使用引物NIb-attr2-recR和P1-attr1-recF进行PCR扩增获得片段2t，将纯化后的1t和2t片段通过南京诺唯赞公司的ClonExpress- II One Step Cloning Kit试剂盒进行连接并转化大肠杆菌DH5α，然后挑取单菌落摇菌并提取质粒获得载体pCB301-attL-SC15P。转化农杆菌表明，pCB301-attL-SC15P依然能成功抑制农杆菌的生长(图3B)。

2、pCB301-attL-SC15P与pDonor-CI、pDonor-Avh241之间的LR反应

各取pCB301-attL-SC15P体积2μl分别和pDonor-CI及pDonor-Avh241各2μl混匀，然后加入LR重组酶，放入25℃金属浴中1小时进行LR反应，反应产物待用。其中pDonor-CI和pDonor-Avh241为使用载体pDonor-zeocin分别与SMV株系SC4的CI蛋白序列和大豆疫霉菌的Avh241效应因子序列进行BP重组反应构建的载体。pDonor-CI和pDonor-Avh241具体构建过程如下：分别取被SC4株系及大豆疫霉菌侵染的大豆组织提取总RNA，然后分别反转录为cDNA得到用于PCR的模板。其中1u片段的扩增使用引物attB1-CI-F及attB1-CI-R；1v片段的扩增使用引物attB1-Avh241-F及attB2-Avh241-R。扩增后的1u及1v分别纯化回收后与载体pDonor-zeocin进行BP重组反应。反应产物转化大肠杆菌DH5α后涂含有Zeocin的LB平板，培养16小时候挑取单菌落摇菌并提取质粒，最后使用M13通用引物进行PCR验证及测序验证。上述SMV株系SC4及大豆疫霉菌保存于国家大豆改良中心，构建各载体所用引物见表3。

表3构建载体所用引物

3、LR反应产物转化农杆菌及单菌落的检测

我们将LR反应产物取出3μl加入农杆菌感受态EHA105中进行转化实验，没有进行LR反应的各质粒转化农杆菌作为对照。转化使用冻融法，转化后的菌液于28℃复苏2小时后涂板于直径9cm的YEP培养基平板上(含有50ng/ml的kan和25ng/ml的Rif)在28℃的恒温箱中培养48小时，并使用体视显微镜拍照(图3B)。从长出的单菌落中各挑取20个单菌落用于菌落PCR扩增(所用引物为表3中的attL1-301REC及attL2-301REC)，扩增产物跑胶检测。检测结果表明所有挑取的单菌落含有的都是正确重组的克隆(图3B)。这一结果也通过测序验证。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒序列及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16295

<212> DNA

<213> 大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)

<400> 1

gtctggccgt ccttctcgta cttggtattc cgaatcttgc cctgcacgaa taccagcgac 60

cccttgccca aatacttgcc gtgggcctcg gcctgagagc caaaacactt gatgcggaag 120

aagtcggtgc gctcctgctt gtcgccggca tcgttgcgcc acatctaggt actaaaacaa 180

ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc 240

aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa 300

ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac 360

tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc 420

ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggggt 480

gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa 540

ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg 600

aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc 660

atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc 720

atgccgttca aggtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat 780

gtccttttcc cgttccacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa 840

atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt 900

atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt 960

agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat 1020

tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaactttaa ataccagaaa 1080

acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt 1140

ttgaaaccac aattatgggt gatgctgcaa ctcgagcggg ccgggagggt tcgagaaggg 1200

ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg cgcagccctg gttaaaaaca 1260

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gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg acagcccctc aaatgtcaat 1380

aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg tcaaggatcg cgcccctcat 1440

ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg cacttatccc caggcttgtc 1500

cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt cgccgatttg cgaggctggc 1560

cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat ctgtcaacgc cgcgccgggt 1620

gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt cagtgagggc caagttttcc 1680

gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac acggcttcga cggcgtttct 1740

ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg cgagggcaac cagcccggtg 1800

agcgtctcta gtggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc 1860

ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc 1920

ttagacaact taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctggggtggt tttaagcttg 1980

catgcctgca ggtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 2040

atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 2100

acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 2160

aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 2220

ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 2280

acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 2340

cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 2400

cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 2460

actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 2520

aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 2580

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tgtgatgccg gttcaagcag ttcagatggc aaaacaagtg ccttccgctc gaggggtgtt 3000

atacacactt aaaagagagg gcaacacgca agtgcataag cacgaggagg cgttgcgcaa 3060

atttcaagaa gcattcgacc aagatgttga cattcagcga aggcttttgg taaacaagca 3120

tagttccata caatccacaa agaagaatgg tttaaccttg cgtcgcttaa ctttagagca 3180

ggctcgagca aaagaagcgg caattgcaag gcgaaggcaa gaagaggaag actttctcaa 3240

tgggaaatat gaacagcaat tttatgctgg tgtttccgct acaaagtcca tgaaatctga 3300

aggagggagt gttggattca gaacaaaata ctggagacca actccaaaga agactaaaga 3360

aaggcgtgca acatcgcagt gtaggaaacc aacatatgtt ttggaggagg ttctttccat 3420

agcttcaagg agtggtaagc tggttgaatt tatcacagga ggcaaaggaa agagagtcaa 3480

aatctgttat gtgcgcaagc atggcgcaat attgcccaag ttctccctcc cgcatgaaga 3540

aggcaaatat atccatcagg agcttcagta tgcaagcaca tatgagtttc ttccttatat 3600

ttgcatgttt gcaaaatata agagcataaa tgcggatgat ataacttatg gagatagtgg 3660

tttactgttt gatgagcgat catctttaac cacaaatcat actaagttac cgtactttgt 3720

cgttcgggga aggaagaatg ggaagcttgt taacgctctt gaagtggttg aaaacatgga 3780

tgatattcag cactactccc aaaatcctga agctcagttt ttccgtggtt ggaaaaaggt 3840

gtttgataaa atgcctcctc atgtggagaa tcatgaatgc accattgatt tcacaaatga 3900

gcaatgtggt gaattggcag cggctataag ccaatcaatt tttccagtta agaaactatc 3960

atgtaagcaa tgtcggcagc acattaagca cctcagttgg gaagagtata aacaattcct 4020

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cattaataag gccctgatga agggtccatc ggtaacacag agcgagctgg agcaagcttc 4260

caagcagctg ctcgcaatga cacaatggtg gaagaatcac atggctttga ctgatgaaga 4320

tgcacttaaa gtgttcagga ataagagatc ttccaaagca ctactcaacc caagtttact 4380

ttgtgataac cagttggaca agaatggtaa ttttgtttgg ggagagcgtg gcaggcattc 4440

aaagcgattc tttgcgaatt attttgaaga ggtggttcct tctgaagggt atagtaagta 4500

tgtgatcaga aagaatccaa acggacaaag ggagttggca attgggtcac ttattgtacc 4560

gttgaatttc gagcgcgctc gaatggcatt acagggcaag agcgtaccaa gaaagccaat 4620

tacactgtca tgtatctcaa gacaagacgg aaactttgta tatccttgtt gttgtgtcac 4680

acatgatgat ggaaaagctt tctattctga gctcaagagt cctacaaagc gccatttggt 4740

tattggaacg tcaggtgacc cgaagtacat tgatctacca gccactgatg cagacaggat 4800

gtacatagct aaagaaggat tttgttatct taacatcttc ttggcaatgt tggttaatgt 4860

aaatgaagat gaggccaagg acttcacaaa gatggtgagg gatgttatta taccacagtt 4920

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ccctgagacc aggaatgccg agctcccacg tattttagtt gaccatgcgt gtcaaaccat 5040

gcatgtgatt gactcttttg gatccttgac agttgggtac catgttctta aagctggtac 5100

agtgaatcaa ttaattcaat ttgcttctaa tgaccttcag agtgagatga aattctacag 5160

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ggtttcacct tctatcttga ttcacatgta tcgtatgaag cattttgaga aaggggtgga 5340

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tgagaggttc atgagtatct tagaggattg ccctcaagca ccacattcat acaagacggc 5520

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tggttttgta gatatgaatg acaaattgta catggcatat gaaaaaatct actcagatcg 5640

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cgcatcttca ggaaactttg cgagtgtgtg cttcatgaat gcccagtcac acctaagaaa 5820

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tgtgaggttc ataatttcaa cacttcacag atgctacagt gatatagttt atctggtgaa 5940

catctgtata atcttttcat tgctcgtcca aatgactagt gtgcttcaga acattgtcaa 6000

cacagcaagg agagacaaag cactcttgaa tggatggaaa aggaaagaag atgaggaggc 6060

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<210> 2

<211> 8406

<212> DNA

<213> 大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)

<400> 2

atggcaacaa tcatgattgg aagcatggcg atctctgtgc caaacactca cgtcttgtgc 60

gcatcgaatt ctgtgatgcc ggttcaagca gttcagatgg caaaacaagt gccttccgct 120

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gttctttcca tagcttcaag gagtggtaag ctggttgaat ttatcacagg aggcaaagga 600

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ccgtactttg tcgttcgggg aaggaagaat gggaagcttg ttaacgctct tgaagtggtt 900

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gtgagcatga caggacaatc agaggatgtc tccgcacagg ccaaaacagt aactcaatta 3360

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agtgatgcgg ttttcaaagt attgagtaag ttgaaggcat ttttcagcac aatgggtgag 3480

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<210> 3

<211> 14217

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagcaccaat tgacacacta cttggagcca aggtttgtgt tgatgatttc aacaatcagt 9540

tctacagcct caaccttaca tgtccatgga cagttggtat gaccaaattt tacagaggtt 9600

gggacaagtt gatgagaagt ttacctgatg gatgggttta ttgtcatgca gatggctcac 9660

aatttgatag ttccttgaca cccttattac tgaacgcagt tcttgatgtt aggagcttct 9720

tcatggaaga ctggtgggtc ggaagagaaa tgcttgaaaa tctctatgct gaaatagtct 9780

acacaccaat cttagcacct gacggcacaa tttttaaaaa gttcagagga aacaacagtg 9840

ggcaaccatc cacagttgtg gacaatacct tgatggtggt cattgccatg tactactcgt 9900

gttgtaagca agggtggtca gatgaggaca tccaagaaag gttggtgttt ttcgccaatg 9960

gtgatgatat tatcctggca gttagtgata gagatacatg gttatatgac actcttagca 10020

tttcgttcgc tgagcttggc ctcaactaca actttgatga acggacaaag agaagagagg 10080

agttatggtt catgtcacac aaagccatgt tagttgatgg gatctacatt ccaaaacttg 10140

aacctgagag aattgtctct attctagagt gggacaggag caaagagctt atgcatcgca 10200

ctgaggcgat atgtgcagca atgattgagg catggggata cactgagttg ctacaagaga 10260

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agacaagtga gctacaaaga tatcttgagg tactggactt taaccatgct gatgattgtt 10440

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ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggttcgatct 10620

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ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg agacaaatgg tgtaaaagac 12480

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ctgaaccccc agccggaact gaccccacaa ggccctagcg tttgcaatgc accaggtcat 12900

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cgatcttggc cgtagcttgc tgggccatcg agccgacgga ctggaaggtt tcgcggggcg 13920

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tggtgtccag ataatccacc ttatcggcaa tgaagtcggt cccgtagacc gtctggccgt 14160

ccttctcgta cttggtattc cgaatcttgc cctgcacgaa taccagcgac cccttgc 14217

Claims (7)

1.能够抑制农杆菌生长的大豆花叶病毒基因，其特征在于包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的大豆花叶病毒基因在抑制农杆菌生长中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的大豆花叶病毒基因选自SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的大豆花叶病毒基因在基因工程中的应用。

5.权利要求1所述的大豆花叶病毒基因在构建重组克隆受体载体中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将权利要求1中所述的大豆花叶病毒基因预先构建到载体中作为受体载体，然后将目标基因片段与受体载体进行重组反应，实现目标基因片段仅直接转化农杆菌就能够进行重组克隆的目的。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求1中所述的大豆花叶病毒基因选自SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。