CN108753699A - 一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法 - Google Patents

一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及涉及一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法，主要是在猪卵母细胞体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱，所添加的溶血磷脂酰胆碱工作液浓度为10μg/mL，现配现用，每1mL猪卵母细胞体外成熟培养液中加入0.2μL。本发明发现在体外成熟培养液中加入LPC，可以显著提高遭受ZEA毒害的猪卵母细胞成熟率，并能显著提高猪卵母细胞孤雌激活率和促进早期孤雌胚胎卵裂，本发明同时首次给出完整的在猪卵母细胞体外培养中通过添加LPC挽救ZEA毒害的操作步骤。本发明证实了LPC的确对ZEA的毒性有对抗作用，为研究ZEA脱毒的方法提供了与现有技术完全不同的一个研究方向。

Description

一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法
技术领域
本发明涉及生殖生物学和发育生物学领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(ZEA)是由禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌等菌种产生的一种非甾体霉菌毒素。主要存在于易受真菌污染的玉米、小麦、高粱、燕麦等谷物中，且是世界上污染范围最广的一种霉菌毒素。由于我国多数地区，雨量充沛，相对湿度较高，谷物和动物饲料更易受到霉菌毒素污染。研究表明，ZEA具有类雌激素效应，在C8位上的酮基易被还原，生成α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)，它们也都有类雌激素活性，α-ZOL的类雌激素活性是ZEA的3倍，而β-ZOL的类雌激素活性与ZEA相似，ZEA及其代谢物能引起动物流产、死胎和返情等生殖机能异常，还可以导致生长下降、免疫抑制、不育和畸形等。猪相比其它家养动物而言对ZEA更为敏感，归其原因有以下几点：1)ZEA本身的化合物结构稳定性比较强，不能通过粮食加工或饲料加工将其降解；2)ZEA虽为非类固醇化合物，但它的类雌激活性可以使它竞争的结合到两种类型的雌激素受体，同时ZEA及其代谢产物还是参与甾类代谢相关各种酶的底物；3)肝微粒体的实验结果表明，α-ZOL和β-ZOL之间存在着相互转化，且这种转化比率存在着物种的差异性，研究表明猪和人类对α-ZOL的转化率较高，与ZEA相比α-ZOL与17-β-雌二醇的亲和力更强；4)ZEA及其代谢产物可以通过糖脂化作用排出体外，但是研究表明猪体内糖脂化的能力较低，这就意味着将会有更多的ZEA或ZEA代谢物停留在猪体内；5)ZEA代谢主要发生在肠道和肝脏中，有部分ZEA及其代谢产物会随着尿液和胆汁排出体外，但是还有一部分ZEA及其代谢产物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶的作用下与葡萄糖醛酸结合形成共轭化合物，经胆汁排泄后在肠道菌群的作用下发生还原反应，又经肠道黏膜细胞的重吸收再次进入肝脏，这样就构成不断循环的肝-肠循环。因此增加了ZEA及其代谢产物在体内的驻留时间，进一步增加其毒副作用。
目前对于ZEA脱毒方法主要分为三种，第一种是物理法，利用高温、辐射处理杀死菌株并降解ZEA。此外，利用各种吸附剂吸附ZEA也能达到脱毒效果；第二种是化学法，利用化学试剂(碱和氧化剂)降解ZEA；第三种是生物法，利用微生物产生的酶(内酯水解酶、蛋白酶和过氧化物酶)降解ZEA。但这些方法都不够完善，或是成本较高，或是效果较差。
作为生命早期的形式，卵母细胞的发育过程往往更容易受到ZEA的毒害。如果能找到更多途径挽救卵母细胞发育过程中受到的ZEA毒害，就能为进一步开辟ZEA脱毒方法找到值得深入研究的方向。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法，目的在于提供一种与现有ZEA脱毒方法都不同的挽救ZEA对猪卵母细胞体外发育的毒害的方法。
本发明的玉米赤霉烯酮(ZEA)对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法，其特征在于，在猪卵母细胞体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱(LPC)。
进一步，所述在猪卵母细胞体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱的方法包括如下步骤：
1)配制溶血磷脂酰胆碱浓储液：将溶血磷脂酰胆碱溶解于M199培养基中，配制浓度为50mg/mL，溶解后于-20℃保存备用；
2)配制溶血磷脂酰胆碱工作液：将步骤1)所述溶血磷脂酰胆碱浓储液自然融化后用M199培养基稀释5000倍，稀释后浓度为10μg/mL，现配现用；
3)配制猪卵母细胞体外成熟培养液：每10mL猪卵母细胞体外成熟培养液包含的组分为FSH 1mg/mL、LH 200IU/mL、EGF 10ng/mL、L-半胱氨酸3.05mM、猪卵泡液1mL、余量为M199培养基，混匀用0.22μm过滤器过滤分装到1.5mL离心管中，每管分装1mL，现配现用；
4)加入溶血磷脂酰胆碱：在步骤3)所得离心管中加入步骤2)所得溶血磷脂酰胆碱工作液，每管加入0.2μL。
优选地，所述溶血磷脂酰胆碱(LPC)为粉剂，购自Sigma公司，批号为L5254。
本发明的有益效果如下：
1、首次提出利用LPC来对抗ZEA的毒性：本发明另辟蹊径发现LPC能够对抗ZEA的毒害作用。目前没有任何文献和技术探究LPC能否对遭受ZEA损害的卵母细胞体外发育具有挽救效应。本发明经过大量试验发现，在猪卵母细胞体外培养过程中，如果在体外成熟培养液中加入LPC，可以显著提高遭受ZEA毒害的猪卵母细胞成熟率，并且在后期的孤雌激活和早期孤雌胚胎发育中，能显著提高猪卵母细胞孤雌激活率和促进早期孤雌胚胎卵裂，说明LPC的确对ZEA的毒性有对抗作用，为研究ZEA脱毒的方法提供了与现有技术完全不同的一个研究方向。
2、首次给出完整的在猪卵母细胞体外培养中通过添加LPC挽救ZEA毒害的操作步骤：本发明经过大量试验，最终确定了在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加浓度为10μg/mL的LPC，添加量为每1mL猪卵母细胞体外成熟培养液中添加0.2μL，并给出了LPC浓储液、LPC工作液的配制方法。
3、操作简单，便于扩展深入研究：本发明的方法操作简单，只是在常规的动物卵母细胞体外成熟培养操作过程中，在体外成熟培养液中加入一定量的LPC，即可观察到显著的对ZEA毒害的挽救作用，挽救了有ZEA毒害的试验用猪的卵母细胞，不至于完全浪费、或者由于ZEA因素导致试验效果不理想，同时也便于科研人员设计进一步试验验证LPC对ZEA的脱毒作用。
附图说明
图1为实施例1的猪卵丘-卵母细胞体外成熟培养42h的显微镜观察图
图2为实施例1的猪卵母细胞体外成熟培养22h和42h免疫荧光染色图
图3为实施例2的体外成熟的猪卵母细胞孤雌激活免疫荧光染色图
图4为实施例3的孤雌早期胚胎的显微镜观察图
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以实施例为限。
实施例1：LPC对被ZEA毒害的猪卵丘-卵母细胞体外成熟培养挽救效果试验
本实验中所用到的主要试剂：玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA，32935)购自Sigma公司，溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LPC，L5254)够自Sigma公司，二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，D8371)购自北京索莱宝科技公司，M199培养基(Medium，11150067)购自Gibco公司。
猪卵泡液配制：用20mL注射器抽取卵巢直径>6mm有腔卵泡，将卵泡液置于50mL进口离心管中，尽量一次多收集一些，3000rpm离心15分钟保留上清液，然后将上清液依次用0.45和0.22过滤器过滤，分装到1.5mL离心管，-20℃保存。
洗液配制：用无菌超纯水配制500mL猪卵巢清洗液，需要的成分为：氯化钙二水化合物150mg、氯化钾118mg、氯化镁六水化合物50mg、磷酸二氢钠24mg、Nalactic Acia 705μL、氯化钠3330mg、碳酸氢钠84mg、HEPES1190mg、丙酮酸钠500μL、聚乙烯醇500mg、青霉素-链霉素500μL、酚红适量，PH：7.2-7.4，最后用无菌超纯水定容至500mL，过滤分装，4℃保存。
ZEA工作液配制：ZEA的工作液浓度为10μM。用DMSO配制ZEA的浓储液(20000μM)，溶解后避光-20℃保存，每次使用时将浓储液按相应工作液浓度进行稀释2000倍。
LPC浓储液配制：将LPC溶解于M199培养基中，配制浓度为50mg/mL，溶解后于-20℃保存备用。
LPC工作液配制：将上述LPC浓储液自然融化后用M199培养基稀释5000倍，稀释后浓度为10μg/mL，现配现用。
猪卵母细胞体外成熟培养液配制：每10mL猪卵母细胞体外成熟培养液包含的组分为FSH 1mg/mL、LH 200IU/mL、EGF 10ng/mL、L-半胱氨酸3.05mM、猪卵泡液1mL、余量为M199培养基，混匀用0.22μm过滤器过滤分装到1.5mL离心管中，每管分装1mL，现配现用。
操作步骤如下：
1、取卵：于青岛万福肉类食品加工厂获得青春期母猪卵巢，保存在30-37℃的0.9％生理盐水中，并在2h内运送到实验室，用常规取卵方式捡取卵母细胞周围颗粒细胞尽量多的卵丘-卵母细胞(COCs)。
2、平衡猪卵母细胞体外成熟培养液：将猪卵母细胞体外成熟培养液分装到1.5mL无菌离心管，每管分装1mL，一共分装4个离心管。第一个离心管作为LPC-/ZEA-组，添加ZEA工作液0μL，LPC工作液0μL，DMSO 0.5μL；第二个离心管作为LPC-/ZEA+组，添加ZEA工作液0.5uL，LPC工作液0uL，DMSO 0uL；第三个离心管作为LPC+/ZEA-组，添加ZEA工作液0μL，LPC工作液0.2μL，DMSO 0.5μL；第四个离心管作为LPC+/ZEA+组，添加ZEA工作液0.5μL，LPC工作液0.2μL，DMSO 0μL。将四个组的培养液混匀，用1mL的移液枪分别吸取700μL培养液放到24孔板，每孔加入6滴石蜡油，接下来将24孔板放到39℃培养箱，0.5％CO2平衡至少5h。此外，接着从剩余的6mL猪卵母细胞体外成熟培养液中吸取700uL添加到另一个24孔板中，一共添加4个孔(此24孔板用来洗COCs)，每孔加入6滴石蜡油，同样将此24孔板放到39℃培养箱，0.5％CO2平衡至少5h。
3、体外培养COCs：从步骤1分离获得的COCs中挑选出160个COCs，每40个COCs一组，先用洗液洗3遍，再用平衡好的猪卵母细胞体外成熟培养液洗一遍，最后转移到平衡好的猪卵母细胞体外成熟培养液中。经过观察，此时COCs中的卵母细胞处于GV期，即卵母细胞中细胞核膜没有破裂，分别于体外培养22h和42h时通过免疫荧光法观察统计卵母细胞生发泡破裂率和第一极体排出率，并于体外培养42h时通过显微镜观察卵母细胞形态。
4、试验结果：见图1、图2和表1
表1 LPC对被ZEA毒害的猪卵丘-卵母细胞体外成熟培养的挽救效果
注：表中的数字是具体的卵母细胞个数，括号内数字是所占比例
图1表明，与LPC-/ZEA-对照组和LPC+/ZEA-组相比，LPC-/ZEA+组中COCs卵丘扩展差，COCs整个体积小，颗粒细胞之间间距紧密。与LPC-/ZEA+组相比，LPC+/ZEA+组COCs的卵丘扩展效果好，COCs整个体积变大，颗粒细胞之间间距变大。
从表1的数据可见，与LPC-/ZEA-对照组相比，ZEA+/LPC-实验组卵母细胞排第一极体率明显下降由80.3±1.1％下降到62.0±5.0％，ZEA+/LPC+实验组细胞排第一极体率显著增加到75.6±6.9％。
从图2可见，卵母细胞体外成熟培养22h时，四组都发生细胞核膜破解(即生发泡破解)，培养到42h时LPC-/ZEA-、LPC+/ZEA-、LPC+/ZEA+三组均卵母细胞排出第一极体，可以看到两套染色体组，极体一套染色体组和卵母细胞一套染色体组，唯独LPC-/ZEA+没有排出第一极体。
图2和表1数据表明，与LPC-/ZEA-对照组相比，ZEA-/LPC+实验组和ZEA+/LPC+实验组GVBD率相似，表明ZEA对卵母细胞由GV期发育到GVBD期没有影响，但是ZEA影响了卵母细胞由GVBD发育到排第一极体。
图1、图2和表1表明，LPC挽救了ZEA对COCs卵丘扩展的影响，促进了猪卵丘-卵母细胞在体外成熟培养发育到排出第一极体。
实施例2：LPC对被ZEA毒害的体外成熟的猪卵母细胞孤雌激活的挽救效果试验
CB配制：细胞松弛素B(Cytochalasin B，CB)，用DMSO配制CB浓储液为1000倍，浓度为5mg/mL的溶液，用无菌离心管分装，每管1μL，-20℃避光保存。
透明质酸酶配制：透明质酸酶(Hyaluronidase)溶解到PBS中或操作液、M2中都可，透明质酸酶的工作液浓度0.003g/mL。-20℃保存。
卵母细胞激活液配制：激活液的配制在PEM-5溶液的基础上添加0.6mML-半胱氨酸、4mg/mL BSA、7.5μg/mL CB，0.22过滤器过滤，现配现用。
电激活液配制(孤雌激活)：电激活液用超纯水配制，需要的成分为甘露醇260mM、氯化钙或乙酸钙0.1mM、硫酸镁0.15mM、HEPES 0.1mM、BSA 0.001％，0.22过滤器过滤，4℃保存使用。
成熟卵母细胞操作液：用无菌超纯水配制1000mL成熟卵母细胞操作液，成分为，TCM-M199 1PKg、碳酸氢钠0.05g、HEPES 0.75g、氯化钠1.855g、BSA 3g、适量酚红，PH：7.2-7.4,最后用无菌超纯水定容至1000mL，0.22过滤器过滤，4℃保存。
具体操作步骤：
1、平衡卵母细胞激活液和预热成熟卵母细胞操作液、电激活液：在3.5cm无菌培养皿中将卵母细胞激活液每50μL做一个滴，3mL石蜡油覆盖，39℃培养箱，0.5％CO2平衡2h。此外，在3.5cm无菌培养皿中将成熟卵母细胞操作液每50μL做一个滴，做6个滴，一共准备四个皿，每个皿加入3mL石蜡油，37℃热台预热。此外将电激活液分装到6个1.5mL无菌离心管中，每管1.4mL(在用的过程中不够时可以再预热一部分)热台预热。
2、成熟卵母细胞孤雌激活：用1mL枪将实施例1获得的成熟COCs连同培养液一起吸取到3.5cm无菌培养皿中，添加10μL透明质酸酶，用200μL枪轻轻吹打去掉颗粒细胞，将去掉颗粒细胞的卵母细胞用口吸管转移到卵母细胞操作液中，在体视镜下捡取成熟卵母细胞(排出第一极体的卵母细胞)，接着用电激活液将卵母细胞洗5次，在电融合仪下激活60us，110V/mm。将激活的卵母细胞再转移到卵母细胞激活液中，每个滴放置25-30个卵母细胞，培养3h，通过免疫荧光染色法观察孤雌激活率。
3、试验结果：见图3、表2
图3是成熟卵母细胞孤雌激活的免疫荧光染色图，因为肉眼无法看到孤雌激活卵母细胞内的两个细胞核，所以必须染色才能观察卵母细胞是否被孤雌激活。从图3中可以看出LPC-/ZEA+实验组卵母细胞没有被孤雌激活(没有两个原核)，但是LPC+/ZEA+实验组卵母细胞被孤雌激活(有两个原核)，因此我们可以推断LPC挽救了ZEA对卵母细胞孤雌激活的毒害作用。
表2 LPC对被ZEA毒害的体外成熟的猪卵母细胞孤雌激活的挽救效果
注：表中的数字是具体的卵母细胞个数，括号内数字是所占比例
从表2的数据可见，与LPC-/ZEA-对照组组相比，LPC+/ZEA-实验组卵母细胞孤雌激活率相似，但是LPC-/ZEA+实验组卵母细胞孤雌激活显著地受到抑制，卵母细胞孤雌激活率由77.7±8.9％下降到58.9±2.3％且P<0.05与LPC+/ZEA+实验组相比较，LPC-/ZEA+实验组卵母细胞孤雌激活率由58.9±2.3％增加到72.6±9.3％，且P<0.05，这表明单独添加LPC对卵母细胞孤雌激活可能没有影响，但是却能挽救ZEA对卵母细胞孤雌激活的抑制作用。
实施例3：LPC对被ZEA毒害的猪的孤雌早期胚胎的挽救效果试验
猪孤雌早期胚胎体外培养液配制(PEM-5)：用无菌超纯水配制500mL猪孤雌早期胚胎体外培养液，成分包括：氯化钠(108mM)、氯化钾(10mM)、磷酸二氢钾(0.35mM)、硫酸镁七水化合物(0.4mM)、碳酸氢钠(25.07mM)、丙酮酸钠(0.2mM)、乳酸钙五水化合物(2.0mM)、谷氨酰胺(2.0mM)、亚牛磺酸(5.0mM)、适量酚红，PH：7.2-7.4，用无菌超纯水定容500mL，0.22过滤器过滤并4℃保存。
具体操作步骤：
1、平衡猪孤雌早期胚胎体外培养液：用24孔板，每孔加入700μL猪孤雌早期胚胎体外培养液，6滴石蜡油覆盖，39℃培养箱，0.5％CO2平衡2h。
2、猪孤雌早期胚胎体外培养：将实施例2中获得的在猪卵母细胞激活液中培养3h后的孤雌早期胚胎转移到步骤1平衡好的猪孤雌胚胎体外培养液中，培养38h，显微镜观察卵裂情况，培养7天观察囊胚生长状态。
3、试验结果：见图4、表3
表3 LPC对被ZEA毒害的猪的孤雌早期胚胎的挽救效果
注：表中的数字是具体的卵母细胞个数，括号内数字是所占比例
从表3的数据可见，与LPC-/ZEA-对照组相比，LPC+/ZEA-实验组中LPC能促进孤雌早期胚胎卵裂，卵裂率由66.1±10.5％增加到75.0±14.6％和囊胚发育由39.2±4.1％增加到47.2±11.9％；与LPC-/ZEA-对照组相比，LPC-/ZEA+实验组卵裂率从66.1±10.5％下降到63.4±10.4％，囊胚率从39.2±4.1％下降到29.4±9.1％，说明ZEA对猪孤雌早期胚胎的发育有毒害抑制作用；而添加了LPC后，LPC+/ZEA+实验组卵裂率提高到73.4±11.0％，囊胚率提高到31.2±12.1％，说明LPC可以挽救ZEA对猪孤雌早期胚胎的毒害作用。
从图4可看出，38h时，LPC-/ZEA+实验组卵母细胞卵裂的少，其余三个组(LPC-/ZEA-，LPC+/ZEA-，LPC+/ZEA+)卵母细胞卵裂的多(结合表3数据)，特别是加入LPC的卵裂率增加了约10个百分点。7d时，LPC-/ZEA+实验组囊胚形成的数量少，且囊胚的体积小，LPC+/ZEA-实验组囊胚数量多，且囊胚体积大，LPC+/ZEA+实验组囊胚的体积也大，但囊胚的数量和LPC-/ZEA+实验组类似(结合表3数据)，而且LPC-/ZEA-实验组的囊胚体积要比LPC+/ZEA-实验组中囊胚体积小一些。从图4和表3可以看出LPC有利于孤雌激活的卵母细胞卵裂和囊胚发育。注：LPC-/ZEA-实验组的囊胚其中有一个囊胚体积大，但是中间细胞皱缩成一团，这样的囊胚也是正常囊胚，因为体外拍照时间长囊胚会出现皱缩现象，但是LPC+/ZEA-实验组的囊胚体积、数量都是最好的。
以上对本发明所提供的一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法进行了详细介绍。本文通过具体实施方式对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法，其特征在于，在猪卵母细胞体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱。
2.根据权利要求1所述玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法，其特征在于，所述在猪卵母细胞体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱的方法包括如下步骤：
1)配制溶血磷脂酰胆碱浓储液：将溶血磷脂酰胆碱溶解于M199培养基中，配制浓度为50mg/mL，溶解后于-20℃保存备用；
2)配制溶血磷脂酰胆碱工作液：将步骤1)所述溶血磷脂酰胆碱浓储液自然融化后用M199培养基稀释5000倍，稀释后浓度为10μg/mL，现配现用；
3)配制猪卵母细胞体外成熟培养液：每10mL猪卵母细胞体外成熟培养液包含的组分为FSH 1mg/mL、LH 200IU/mL、EGF 10ng/mL、L-半胱氨酸3.05mM、猪卵泡液1mL、余量为M199培养基，混匀用0.22μm过滤器过滤分装到1.5mL离心管中，每管分装1mL，现配现用；
4)加入溶血磷脂酰胆碱：在步骤3)所得离心管中加入步骤2)所得溶血磷脂酰胆碱工作液，每管加入0.2μL。
3.根据权利要求1或2所述玉米赤霉烯酮对猪卵母细胞体外发育危害的挽救方法，其特征在于，所述溶血磷脂酰胆碱为粉剂，购自Sigma公司，批号为L5254。
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