CN108752183B - 一种青葙杂萜化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青葙杂萜化合物、其制备方法及其应用，属于天然药物化学及医药技术领域；本发明的发明人意外地从鸡冠花种子中提取到了一种新的青葙杂萜化合物，并且发现该青葙杂萜化合物能够应用于制备治疗乳腺癌的药物；为乳腺癌候选新药的开发和研究提供了新的方向。

Description

一种青葙杂萜化合物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种青葙杂萜化合物、其制备方法及其应用，属于天然药物化学及医药技术领域。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤。据2017年CA CANCER J CLIN报道，乳腺癌在美国女性中发病率高居首位，致死率为第二位。2017年《中国肿瘤的现状和趋势》会议数据显示，中国女性中乳腺癌发病率为第1位，致死率为第6位。乳腺癌严重威胁着人类的健康，已成为当前社会的重大公共卫生问题，对于乳腺癌的研究也越来越受到重视。

早期乳腺癌的治疗方式主要是手术，进展到中晚期化学药物治疗成为主要方案，与一般肿瘤化疗药物相比，靶向药物具有选择性更佳、效率更高和副作用更小等优点，越来越受到科研和医疗人员的重视。

然而，目前美国食品药品管理局(FDA)针对其分型批准的乳腺癌的靶向药物数量较少，主要针对内分泌治疗的芳香化酶抑制剂和雌激素拮抗剂，针对表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-2，HER2)的曲妥珠单抗，针对血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)的贝伐单抗等，总体疗效有限且价格昂贵。

乳腺癌尚无较好的临床靶向药物，具有我国自主知识产权的靶向化疗药物更为稀缺，研发乳腺癌靶向新药迫在眉睫。筛选和鉴定候选新药(特别是分子量小于500的小分子化合物)抑制乳腺癌的生长和转移，探究其直接作用的分子靶点，研究其靶向分子机制，研发具有我国自主知识产权的乳腺癌一类新药，延长患者生存期具有重要意义。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种青葙杂萜化合物，

所述青葙杂萜化合物具有以下结构式：

本发明另一方面提供了一种从鸡冠花种子中提取上述青葙杂萜化合物的方法，该方法包含以下步骤：

步骤1)获取鸡冠花种子的粉末，所述粉末的粒度小于等于20目；

步骤2)对所述的鸡冠花种子的粉末进行回流提取，将获取的提取液减压浓缩后获得总浸膏；

步骤3)将所述步骤2)获得的总浸膏分散于水中，再采用有机溶剂进行萃取获得萃取物；

步骤4)将所述步骤3)获得的萃取物进行分离纯化，获得如上述的青葙杂萜化合物。

优选的，在所述步骤2)中，回流提取所采用的溶剂为水或浓度为60％的乙醇。

优选的，在所述步骤2)中，回流提取所采用的溶剂为浓度为60％的乙醇。

优选的，在所述步骤3)中，萃取采用的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中的任意一种或几种的混合。

优选的，在所述步骤3)中，依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行等体积萃取，且每种有机溶剂各萃取4次。

优选的，在所述步骤4)中，将石油醚和乙酸乙酯的萃取物合并后依次经过硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析和RP-C18反相柱层析获得如上述的青葙杂萜化合物。

本发明再一方面提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含如上述的青葙杂萜化合物和药学上接受的载体。

本发明还一方面提供了上述青葙杂萜化合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明还一方面提供了上述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明的发明人意外地从鸡冠花种子中提取到了一种新的青葙杂萜化合物，并且发现该青葙杂萜化合物能够应用于制备治疗乳腺癌的药物，为乳腺癌候选新药的开发和研究提供了新的方向。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的黄色粉末的核磁共振分析图谱(¹H NMR谱)；

图2为本发明实施例1获得的黄色粉末的核磁共振分析图谱(¹³C NMR和DEPT-135谱)；

图3为本发明实施例1获得的黄色粉末的核磁共振分析图谱(HSQC谱)；

图4为本发明实施例1获得的黄色粉末的核磁共振分析图谱(HMBC谱)；

图5为本发明实施例1获得的黄色粉末的核磁共振分析图谱(¹H-¹H COSY谱)；

图6为本发明实施例1获得的黄色粉末的核磁共振分析图谱(ROESY谱)；

图7为本发明的青葙杂萜化合物的化学结构式图；

图8为在采用人源乳腺癌细胞MDA-MB-231原位荷瘤模型的效果实验中，各组的肿瘤体积与给药时间的关系图；

图9为在采用人源乳腺癌细胞MDA-MB-231原位荷瘤模型的效果实验中，各组的小鼠体重与给药时间的关系图。

具体实施方式

本发明提供了一种青葙杂萜化合物，所述青葙杂萜化合物具有以下式(I)结构：

在本发明的一个具体实施方案中，一种从鸡冠花种子中提取式(I)结构的青葙杂萜化合物的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1)获取鸡冠花种子的粉末，所述粉末的粒度小于等于20目；

步骤2)对所述的鸡冠花种子的粉末进行回流提取，将获取的提取液减压浓缩后获得总浸膏；

步骤3)将所述步骤2)获得的总浸膏分散于水中，再采用有机溶剂进行萃取获得萃取物；

步骤4)将所述步骤3)获得的萃取物进行分离纯化，获得式(I)的青葙杂萜化合物。

本发明的发明人在天然药物的研究过程中意外地从苋科植物鸡冠花种子中分离到了一个新的小分子化合物，即上述式(I)结构的化合物。

关于鸡冠花，学名为Celosia cristata L.，中文别名为鸡髻花、老来红、芦花鸡冠、笔鸡冠、小头鸡冠、凤尾鸡冠、大鸡公花、鸡角根、红鸡冠等，其为一年生苋科(Amaranthcea)草本植，夏秋季开花，花多为红色，呈鸡冠状，故称鸡冠花。原产非洲，美洲热带和印度。喜阳光充足、湿热，不耐霜冻。不耐瘠薄，喜疏松肥沃和排水良好的土壤。鸡冠花子即鸡冠花的成熟种子，始载于《嘉佑本草》。《纲草纲目》载“味甘，凉，无毒。治痔漏下血，赤白下痢，崩中，赤白带下，分赤白用。”《辞海》载“清热止血，主治赤痢，便血，崩漏，带下等症；种子功能清肝明目，主治目赤肿痛，翳障等症；鸡冠花性凉，味甘涩，具有清热除湿、收敛涩肠、凉血止血、止泻止带之功效，适用于赤白痢疾、功能性子宫出血、痔漏下血、吐血、咯血、衄血、血淋、白带过多、崩漏、遗精、乳糜尿等病症。”本草考证鸡冠花子有悠久的药用历史。此外，鸡冠花还是一种可以食用的植物，元代李果编辑、明代李时珍参订、姚可成补辑的《食物本草》中记载了不少人们食用鸡冠花积累的经验。

从鸡冠花种子中分离得到的式(I)结构的化合物从未有过文献报道，发明人对其进行结构鉴定分析后将其命名为青葙杂萜化合物，并在进一步的药效研究过程中意外地发现，式(I)的青葙杂萜化合物对于乳腺癌有明显的治疗作用，具有乳腺癌新药的临床应用前景。

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

以下实施例中采用的仪器与试剂：

熔点仪：天津分析仪器厂RY-2型(温度计未校正)

红外光谱仪：Bruker Vector 22

核磁共振仪：Brucker AVANCE DRX-400，500，600型

质谱仪：Finnigan MAT 95 70eV；

旋光仪：Autopol VI 90079；

高效液相色谱仪：Agilent 1100，带四元泵，自动进样器和DAD检测器；

柱层析填料：柱层析硅胶(200-300，300-400目)与硅藻土均为青岛海洋化工厂产品；Sephadex LH-20，Pharmacia公司；RP-C18反相硅胶柱：

RP-18(40-63μm)，Merck公司；微孔树脂：MCI CHP20P(75-150μm)，三菱化学；层析硅胶板：HSGF254硅胶板，烟台江友硅胶开发有限公司产品；

TLC显色剂：10％H₂SO₄-乙醇溶液，95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇等均为分析纯溶剂(国药集团上海化学试剂公司)、乙腈(色谱纯，Merck公司)。

植物来源

鸡冠花子于2013年9月采自江苏省宿迁市，经上海中医药大学周秀佳教授鉴定为苋科青葙属鸡冠花植物(Celosia cristata L.)成熟的种子，标本存于上海交通大学附属第六人民医院南院中心实验室(标本号2013091212)。

实施例1

步骤1)首先取鸡冠花种子5kg(干重)，将其粉碎至粒度小于等于20目；

步骤2)对步骤1)获取的鸡冠花种子的粉末进行回流提取，具体来说，采用5倍量60％乙醇回流提取两次，每次3小时；将获取的提取液减压浓缩后获得总浸膏；

步骤3)将步骤2)获得的总浸膏分散于水中，再依次采用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每种有机溶剂各萃取4次，减压回收得到各萃取相(石油醚、乙酸乙酯和正丁醇)的浸膏分别为62g、8g和40g；

步骤4)再将步骤3)获得的石油醚萃取浸膏与乙酸乙酯萃取浸膏合并后进行层析分离，依次经过两次硅胶柱层析，SephadexLH-20凝胶柱层析和RP-C18反相柱层析；具体来说，第一次硅胶柱层析的洗脱剂采用石油醚/乙酸乙酯体系，且以不同的比例进行梯度洗脱，即采用石油醚/乙酸乙酯体系以80:20、60:40、40:60(体积比，以下洗脱剂的溶剂比例均为体积比)的不同比例进行梯度洗脱；第二次硅胶柱层析也采用梯度洗脱，依次采用石油醚/丙酮(60:40)、正己烷/二氯甲烷(50:50)和二氯甲烷/甲醇(70:30)进行洗脱分离；SephadexLH-20凝胶柱层析，依次采用二氯甲烷/甲醇(1:1)和甲醇体系进行洗脱分离；RP-C18反相柱层析所采用的洗脱剂为乙腈/水系统(添加0.1％三氟乙酸)；最后减压蒸干获得一黄色粉末。

产品鉴定

将上述实施例1获得的黄色粉末进行电喷雾质谱法分析(ESI-MS)和高分辨电喷雾质谱法分析(HR-ESI-MS)，从而确定其分子式为C₁₈H₂₅O₃，不饱和度为7。

之后，再进行了一系列核磁共振分析，结果参见图1至图6。其中，参见图1，¹H NMR谱在δ11.89(1H,s)处显示1个螯合羟基信号，在δ9.80(1H,s)处显示1个醛基氢，在δ6.96(1H,s),6.83(1H,s)处显示一对间位偶合芳氢，在δ5.30(2H,t,J＝7.1Hz),5.10(2H,t,J＝6.7Hz)处显示两个烯氢，在δ1.69(3H,s),1.68(3H,s)和1.60(3H,s)处显示有3个与烯键相连的甲基质子信号,推测结合该化合物为带不饱和侧链的芳香醛类化合物。

参见图2，¹³C NMR和DEPT-135谱可知化合物中含有3个甲基(δ25.7,17.7,16.1)，3个亚甲基，5个次甲基(δ196.1,125.2,124.2,120.8,115.2)，6个季碳(δ154.1,148.1,137.7,132.1,131.6,119.7)，从碳的数量和类别结合推测该化合物含有一个苯环，一个醛基，以及一个含有11个碳包括3个甲基和两个双键的侧链。该化合物的氢谱、碳谱信号与已知化合物3-Farnesyl-2,5-dihydroxy-benzaldehyde非常相似，但相比之下氢谱少了一个烯氢，一个甲基和两个亚甲基信号，碳谱少了一对烯碳，一个甲基碳和两个亚甲基碳信号。由此推测青葙杂萜为已知化合物3-Farnesyl-2,5-dihydroxy-benzaldehyde减少1个异戊烯基单元之结构。

之后经过2DNMR实验验证，参见图3至图6，HMBC谱中，芳氢δH 6.83(1H,s,H-6)与醛基碳相关表明δH 6.83(1H,s,H-6)在醛基邻位。δH 3.35(H-1’)与δc 120.8(C-2’),125.2(C-4),132.2(C-3),137.3(C-3’),154.1(C-2)相关，表明侧链连在3位与一个羟基和一个芳香质子相邻。¹H-¹H COSY谱可以观测到δH 5.30(H-2’)与δH 3.35(H-1’)的相关信号以及与δH 2.07(H-4’)和δH 1.69(10’-CH3)的远程相关信号，同样可以观测到δH 2.12(H-5’)与δH2.07(H-4’)和δH 5.10(H-6’)的相关信号以及与δH 1.68(H-9’)和δH 1.60(H-8’)的远程相关信号。

产品鉴定的数据信息如下：ESI-MS m/z 275[M+H]⁺,273[M-H]^-。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ10.89(1H,s,2-OH),9.80(1H,s,1-CHO),6.96(1H,s,H-4),6.83(1H,s,H-6),5.30(2H,t,J＝7.1Hz,H-2’),5.10(2H,t,J＝6.7Hz,H-6’),3.35(d,J＝7.3Hz,2H,H-1’),2.12(3H,q,J＝7.1Hz,H-5’),2.07(3H,m,H-1’),1.69(3H,s,10’-CH₃),1.68(3H,s,9’-CH₃),1.60(3H,s,8’-CH₃)；¹³C NMR(151MHz,CDCl₃)δ196.1(d,1-CHO),154.1(s,C-2),148.1(s,C-5),137.7(s,C-3’),132.1(s,C-3),131.6(s,C-7’),125.2(d,C-4),124.2(d,C-6’),120.8(d,C-2’),119.7(s,C-1),115.2(d,C-6),39.7(t,C-4’),27.0(t,C-1’),26.6(t,C-5’),25.7(q,C-9’),17.7(q,C-9’),16.1(q,C-10’)。

通过以上鉴定过程，从而获得了该化合物(黄色粉末)的结构式以及HMBC、1H-1HCOSY关键信号，参见图7(其中，HMBC表示远程偶合的碳氢关系，COSY表示相邻碳氢的偶合关系)，发明人将其命名为式青葙杂萜化合物(式(I)结构)。

效果数据

发明人对上述式(I)结构的青葙杂萜化合物的生物活性进行检测。

具体来说，检测上述式(I)结构的青葙杂萜化合物抑制人源三阴性乳腺肿瘤原位生长和转移的效果。

为了进一步验证式(I)结构的青葙杂萜化合物对体内乳腺癌的抑制作用，我们采用了人源乳腺癌细胞MDA-MB-231原位荷瘤模型。实验步骤大致如下，将标记了荧光素酶报告基因的MDA-MB-231-luc细胞接种到裸鼠乳腺脂肪垫中，根据裸鼠毒性预实验结果，将各组给药方案调整为药物剂量相同，每两天腹腔注射一次。

具体实验操作如下：1)将对数生长期的MDA-MB231-Luciferase细胞用胰酶消化，离心后用PBS清洗细胞并再次离心；2)用适当的PBS重悬细胞调整至100μL细胞悬液中含10⁶个细胞；3)在6-8周龄的Balb/c雌性裸鼠的第4对乳腺脂肪垫上原位注射100μL细胞；4)一周后可观察到小鼠乳腺脂肪垫上形成约100mm³原位肿瘤。此时，小鼠腹腔注射3mg荧光素底物D-Luciferin，作用5min后，气体麻醉系统麻醉小鼠3min，利用小动物活体成像系统(IVIS)检测小鼠乳房垫上肿瘤的生物发光值。以此为分组依据，将小鼠均分为4组，每组8只；5)小鼠每天腹腔注射50μL对应药物；

其中，治疗组分别腹腔注射2.5mg/kg/天和5mg/kg/天的式(I)结构的青葙杂萜化合物；其中，注射剂量为2.5mg/kg/天的为治疗组1，注射剂量为5mg/kg/天的为治疗组2；阴性对照组注射等量溶剂(DMSO)，阳性对照组注射5mg/kg/天的紫杉醇；

6)实验期间每4天测量并统计小鼠原位肿瘤大小(V＝L×W²×0.52)以及小鼠体重；实验持续26天后，利用IVIS检测并统计小鼠乳腺癌的生长和转移情况；小鼠活体成像后立即处死，在15分钟内剥离其主要组织器官，如原位实体瘤、肺、肝、脾、肾，心和后肢胫骨，放置在培养皿中。通过IVIS观察并统计肿瘤细胞向小鼠各个组织器官转移情况。

结果表明，参见图8，治疗组1和治疗组2、阴性对照组和阳性对照组均可明显抑制肿瘤体积，同等浓度下式(I)结构的青葙杂萜化合物和紫杉醇的抑制效果无显著差异。

参见图9，实验持续26天，期间治疗组1和治疗组2、阴性对照组和阳性对照组的小鼠体重均无明显下降。

因此，可以看出，式(I)结构的青葙杂萜化合物能达到紫杉醇同样的抗人源乳腺癌肿瘤生长的作用效果，为乳腺癌候选新药的开发和研究提供了新的方向。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种青葙杂萜化合物，其特征在于：

所述青葙杂萜化合物具有以下结构式：

2.一种从鸡冠花种子中提取如权利要求1所述青葙杂萜化合物的方法，其特征在于：

所述方法包含以下步骤：

步骤1)获取鸡冠花种子的粉末，所述粉末的粒度小于等于20目；

步骤2)对所述的鸡冠花种子的粉末进行回流提取，采用60％乙醇回流提取，将获取的提取液减压浓缩后获得总浸膏；

步骤3)将所述步骤2)获得的总浸膏分散于水中，再依次采用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压回收得到各萃取相的浸膏；

步骤4)再将步骤3)获得的石油醚萃取浸膏与乙酸乙酯萃取浸膏合并后进行层析分离，依次经过两次硅胶柱层析，SephadexLH-20凝胶柱层析和RP-C18反相柱层析；所述第一次硅胶柱层析的洗脱剂采用石油醚/乙酸乙酯体系，以体积比为80:20、60:40、40:60的不同比例进行梯度洗脱；所述第二次硅胶柱层析也采用梯度洗脱，依次采用体积比为60:40的石油醚/丙酮、体积比为50:50的正己烷/二氯甲烷和体积比为70:30的二氯甲烷/甲醇进行洗脱分离；所述SephadexLH-20凝胶柱层析，依次采用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇体系和甲醇体系进行洗脱分离；所述RP-C18反相柱层析所采用的洗脱剂为添加了0.1％三氟乙酸的乙腈/水系统；最后减压蒸干获得如权利要求1所述的青葙杂萜化合物。

3.一种药物组合物，其特征在于：

所述药物组合物包含如权利要求1所述的青葙杂萜化合物和药学上接受的载体。

4.如权利要求1所述的青葙杂萜化合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

5.如权利要求3所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

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