CN108728564B - 大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的应用 - Google Patents

大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定大白菜WRKY19异构体编码基因Bra029454野生型和突变体的共显性标记，所述共显性标记包括：与野生型相关的标记Bra029454W，片段大小126bp，如SEQ ID No.1所示；与突变体相关的标记Bra029454m，大小121bp，如SEQ ID No.2所示。本发明获得了一对区分大白菜WRKY19异构体编码基因之一Bra029454野生型和突变体的共显性标记，可以将该标记用于筛查大白菜自然群体，提供高效的大白菜抗病R基因位点的检测手段，通过本发明的共显性标记检测出的携带野生型基因的材料可以作为抗病育种的重要材料，用于培育抗病大白菜新品种。

Description

大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的 应用
技术领域
本发明涉及蔬菜育种技术领域，具体涉及一种大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的应用。
背景技术
WRKY是植物转录因子中的一个超大家族，因其编码蛋白中含有高度保守的WRKY结构域而得名(Agarwal P,Reddy MP,Chikara J,2011.WRKY:its structure,evo-lutionaryrelationship,DNA-binding selectivity,role in stress tolerance and developmentof plants.Mol Biol Rep,38,6,pp3883～3896)。WRKY家族各成员之间氨基酸序列差异较大，暗示它们参与植物体各种生命活动，目前对WRKY转录因子的研究主要集中在其应对生物及非生物胁迫中的调控作用(Pandey SP,Somssich IE,2009.The role of WRKYtranscription factors in plant immunity.Plant Physiol,150卷第4期,pp1648～1655；Baksh i M,Oelmuller R(2014).WRKY transcription factors:jack of manytrades in plants.Plant Signal Behav,9卷第1期,e27700)。Noutoshi等(Noutoshi Y,Ito T,Seki M,Nakashita H,Yoshida S,Marco Y,Shirasu K,Shinozaki K.2005.Asingle amino acid insertion in the WRKY domain of the Arabidopsis TIR-NBS-LRR-WRKY-type disease resistance protein SLH1(sensitive to low humidity 1)causes activation of defense responses and hypersensitive cell death.ThePlant Journal,第43卷,pp873～888)在研究一个拟南芥TIR-NBS-LRR-WRKY突变基因slh(sensitive to low humidity)1的功能时，指出其与拟南芥编码WRKY19的基因At4g12020功能类似，都是含有WRKY结构域的抗病基因(Resistance gene)，即R基因。
大白菜(Brassica rapa ssp.Pekinensis)又名结球白菜，为十字花科(Cruciferae)芸薹属一、二年生蔬菜，以叶片为食用部位，富含碳水化合物、蛋白质、纤维素和微量元素，是一种深受人们喜爱的蔬菜。目前从大白菜中鉴定的WRKY TF基因不多，仅有少量的文献报道(Kim SS，Ko YJ，Jang JY，et al.Isolation and expression anal-ysisof Brassica rapa WRKY 7[J].Plant Pathology Journal，2008，24(4):478-481.)。WRKY19及其异构体是WRKY家族的成员之一，有关其野生型和突变体中大白菜中的功能与抗病的关系至今未见报道。
大白菜全基因组虽已经测序完成(Cheng,F.,Liu,S.,Wu,J.,Fang,L.,Sun,S.,Liu,B.,Li,P.,Hua,W.,Wang,X.2011.BRAD,the genetics and genomics database forBrassica plants.BMC plant biology.11:136.)，但在测序完成的大白菜全基因组中，与WRKY转录因子及其异构体相关的编码基因多达上百个，不同编码基因的核酸序列的同源性差异较大，推测其功能也存在较大差异；而且，有关大白菜具有转录因子活性的R基因报道也很少，对于大白菜中具有转录因子活性的R基因鉴定更是属于技术上的空白。
鉴于此，有必要分别对大白菜种质资源中具有转录因子活性的R基因进行广泛筛查，鉴定基因的功能，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发区分野生型与突变体的位点特异性分子标记，为重新评价大白菜资源的应用价值提供借鉴。
发明内容
针对目前大白菜中具有转录因子活性的R基因鉴定方面的空白，本发明的目的是提供大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的应用。
本发明首先获得了一个位于A09染色体上可能编码WRKY19异构体的基因Bra029454的野生型和突变体，其次根据二者的序列差异，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的共显性标记并用于标记辅助选择。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种鉴定大白菜WRKY19异构体编码基因Bra029454野生型和突变体的共显性标记。
本发明的共显性标记包括：与野生型相关的标记Bra029454W，片段大小126bp，如SEQ ID No.1所示；与突变体相关的标记Bra029454m，大小121bp，如SEQ ID No.2所示。
上述共显性标记在大白菜种质资源鉴定和/或抗病育种中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第二方面，提供用于鉴别上述共显性标记的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，具体如下：
正向引物Bra029454F：5'-ACAACGCATGGAGCCTAAGATT-3'；(SEQ ID No.3)
反向引物Bra029454R：5'-AGAAGAAGGACCTAAGAGATGTGAACT-3'；(SEQ ID No.4)
上述引物组在制备用于鉴定大白菜WRKY19异构体编码基因Bra029454野生型和突变体的试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供一种用于鉴定大白菜WRKY19异构体编码基因Bra029454野生型和突变体的试剂盒，所述试剂盒中包括：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物。
上述试剂盒在大白菜种质资源鉴定和/或辅助育种中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第四方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜品种的方法，包括如下步骤：
(1)利用上述的引物组对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增；
(2)检测扩增片段的大小，如果扩增出126bp的条带，则基因组中含有野生型基因；如果扩增出121bp的条带，则该基因发生了突变。
步骤(1)中，PCR扩增的条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸10秒，35-38个循环；最后72℃延伸5分钟。
上述方法筛选的携带野生型基因的材料可以作为抗病育种的重要材料，用于培育抗病大白菜新品种。
上述技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明获得了一对区分大白菜WRKY19异构体编码基因之一Bra029454野生型和突变体的共显性标记，可以将该标记用于筛查大白菜自然群体，提供高效的大白菜抗病R基因位点的检测手段，通过本发明的共显性标记检测出的携带野生型基因的材料可以作为抗病育种的重要材料，用于培育抗病大白菜新品种。
(2)本发明针对野生型和突变基因开发的共显性标记，可以用于大白菜种质资源筛查和抗病材料的回交转育辅助选择。本发明的共显性标记的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。在培育广谱抗病大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100％。同时也为重新评价大白菜资源的应用价值提供分子检测工具。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：目标基因Bra029454编码区序列在NCBI蛋白数据库中的检索结果，图示同源性较高的前几条序列的注释及中文翻译
图2：基因Bra029454与基因Bra000758的氨基酸序列比对。图示二者中C-端序列差异较大，暗示二者在大白菜基因组中扮演不同的功能。
图3：引物组合Bra029454F/Bra029454R在两份典型大白菜材料冠291和2013-243中的扩增结果，M是DNA分子量标准50bpladder。
图4：两份材料中目的序列比对(A)以及两份材料Bra029454编码基因推导氨基酸序列差异区域的比对(B)。从图A中可以看出突变区域比野生型少五个碱基，导致编码区发生移码突变不能在原终止密码处正常终止，图B显示突变基因氨基酸序列比野生型长。
图5：引物组合Bra029454F/Bra029454R对部分种质资源(A)和以冠291×2011-243为亲本衍生的F2代部分单株(B)的检测情况。图A中ck1是自交系2011-243、ck2是自交系冠291，图B中p1是冠291、p2是2011-243，1-10是十份大白菜资源，11-20是F2群体中的10个单株。从图A可以看出编号4、5的种质资源在Bra029454位点的基因型与ck2相同，其余同ck1；从图B可以看出11、12、13、18的基因型同亲本p2，14、15、16同亲本p1，其余是杂合型。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中尚未有关于WRKY19及其异构体野生型和突变体中大白菜中的功能与抗病的关系的报道。基于此，本发明提出了大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的应用。
本发明首先采用全基因组重测序技术对27份大白菜核心资源进行了重测序分析。在挖掘分析测序数据时，发现大量抗病相关基因发生了序列的变异，其中之一是位于A09染色体上的Bra029454，因为在测序文件提供的“nr_annotation”一栏，该基因注释为diseaseresistant protein，而在“Swissprot_annotation”一栏给出的注释是“Probable WRKYtranscription factor 19，OS＝Arabidopsis thaliana GN＝WRKY19”，经进一步检索，发现在拟南芥基因组并没有对应的直向同源基因，NCBI数据库中检索到了芜菁或大白菜中的同源序列(如图1所示)，注释为抗病基因或WRKY异构体X1/2。进一步序列比对，发现其与拟南芥WRKY19编码基因At4g12020对应的大白菜同源基因Bra000758编码区核酸序列同源性43％，氨基酸序列同源性为41.66％，Bra000758编码1251个氨基酸残基，而Bra029454编码产物仅有902个氨基酸残基，二者主要区别在C端(图2)，由此推测二者功能差异较大，因此有必要分别开发针对各自突变的分子标记。
由于大白菜基因组中有各种R基因，每个位点的R基因有可能抵御不同病源，由于R基因呈显性遗传，只要具有该基因，即使是杂合状态，则某材料就能抗特定病源。如果能够分别在不同位点鉴定出各自的R基因野生型状态，开发针对各自R基因野生型和突变体检测的位点特异性分子标记，则可以通过聚合杂交并结合分子标记辅助选择，将多个野生型位点聚合在同一份材料中、创造广谱抗病大白菜新种质。
在本发明的一种实施方案中，利用特异引物克隆技术发现了野生型材料“2011-243”中的基因Bra029454为野生型状态、而感病材料“冠291”中的基因Bra029454为突变状态，开发了鉴定二者的共显性标记，所述共显性标记包括：与野生型相关的标记Bra029454W，片段大小126bp，如SEQ ID No.1所示；与突变体相关的标记Bra029454m，大小121bp，如SEQ ID No.2所示。
利用该标记可以对转育后代以及大白菜种质资源在该位点的基因型进行准确选择，以探明大白菜资源在该位点的序列状况，且可以创造遗传背景更加丰富的抗病材料。
作为优选的方案，所述标记的筛选过程如下：
(1)根据全基因组重测序数据提供的突变信息，在突变区域两侧保守区设计特异引物；
(2)采用CTAB法，提取了两份典型材料的基因组DNA，一份为野生型材料“2011-243”，一份为突变体材料“冠291”；
(3)对目标区域进行PCR扩增和PAGE电泳检测，得到了预计大小的两个片段；
(4)分别对扩增产物进行克隆及测序验证，发现与重测序数据符合，确认得到的扩增产物就是所需的标记。
(5)进一步用所得标记对部分核心资源和一个F2群体进行了PCR扩增和电泳检测，验证了标记的实用性，且进一步确认了有关材料在Bra029454位点的变异状况以及该标记在育种选择中的应用。
本申请的共显性标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育。在本申请的另一种实施方案中，选择含有2011-243中野生型状态的种质材料或转育后代。具体应用方式为：利用该共显性标记的一对引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的大小，如果扩增出126bp的条带、则基因组中含有野生型基因，扩出121bp的条带、则该基因发生了突变。
需要说明的是，由于目前对于大白菜种质资源中WRKY及其异构体的编码基因研究很少，而位于A09染色体上的Bra029454基因其野生型和突变体在大白菜中的功能与抗病的关系至今未见报道。本发明系首次发现Bra029454基因中存在突变区域，并进一步发现该突变区域与大白菜抗病能力相关。我们知道，突变均是偶然因素造成的，突变位点在何处进行了怎样的突变，对所属领域技术人员而言，是不可预知的，突变之后是否产生了新的功能，是否影响基因的功能，同样是不可预知的，特别是对于位于大白菜A09染色体上的Bra029454基因而言，由于目前对其在大白菜种质资源鉴定方面的研究尚属技术上的空白，因此，本发明发现的Bra029454基因的突变区域以及该突变区域的功能具有突破性的意义。
本发明针对上述发现的突变区域，根据其两侧保守区设计特异引物，而对于引物的设计也并非是常规的引物设计方法所能得到的，因为本发明的突变区域比野生型少五个碱基，导致编码区发生移码突变，翻译过程不能在原终止密码处正常终止，因此，如何通过引物设计，使扩增片段包含上述突变区是难点所在；而且，本发明的突变区域比野生型只少五个碱基，如何对扩增后的片段实现有效的分离和鉴定是本发明的另一难点所在。基于上述因素，本发明在设计引物时特别考虑退火温度介于60-65℃、GC含量不少于40％、没有错配，扩增片段介于80-200bp，同时结合8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，有效实现了对Bra029454基因野生型和突变型两种基因型的鉴定。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1两种典型大白菜自交系材料2011-243和冠291中Bra029454目标序列的克隆
1.1大白菜基因组DNA提取
(1)将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入0.6ml预热至65℃的CTAB提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65℃水浴放置40-60分钟使细胞裂解；
(3)裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿(chloroform)，轻轻颠倒使混匀，室温放置10分钟；
(4)室温，12000rpm离心15分钟；
(5)用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温沉淀10min；
(6)4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；
(7)DNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；
(8)重复用75％乙醇洗涤一次DNA沉淀；
(9)去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，DNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的10mM的Tris.HCl(pH8.0)使沉淀溶解(可放于4℃冰箱溶解过夜)；
(10)紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测DNA浓度及质量。
1.2Bra029454目标序列的克隆及检测
(1)根据测序文件给出的信息，发现变异区域位于A09的17378768处，此处的“CGTTTT”突变为“C”，即缺失五个碱基，该区域位于基因Bra029454的编码区靠近终止密码子处，造成移码突变。拷贝数据库中大白菜A09染色体上17378768bp两侧各100bp的保守序列，在变异位点两侧保守区设计引物，引物的设计特别考虑退火温度介于60-65℃、GC含量不少于40％、没有错配，因插入缺失仅有5个碱基，只能通过聚丙烯酰胺电泳加以检测区分，所以特别考虑扩增片段大小须介于80-200bp。经过筛选，最终确定上下游引物序列如下：Bra029454F：5'ACAACGCATGGAGCCTAAGATT-3'和Bra029454R：5'AGAAGAAGGACCTAAGAGATGTGAACT-3'，如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
(2)PCR扩增：在20μl反应体系中，包含1×PCR masterMIX(含染料)，20ng的基因组DNA；0.4μM正/反向引物。PCR循环条件：95℃预变性5分钟；接着是95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸10秒，35-38个循环，最后72℃延伸5分钟。
(3)PCR产物的电泳检测：
PCR结束后，取1μl PCR扩增产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后硝酸银染色，数码相机拍照。结果见图3。从两份材料中扩增出的片段介于100bp-150bp之间，两材料中的扩增产物在片段大小上有区别，可以用作分子标记。
(4)PCR产物的测序验证
电泳确认目的条带被扩增后，再用高保真酶对目的区段进行扩增，取1μl PCR扩增产物加1μl pEasy-Blunt载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在含50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。对所得序列进行比对，结果与重测序数据一致见图4A所示，经过与Bra029454全基因编码区比对，发现缺失区域位于基因的3'-端靠近终止密码子处，移码突变导致突变基因不能正常终止，在原终止密码下游24bp处发现了另一个终止密码，即突变基因比野生型基因长8个氨基酸残基，如图4B所示。
由于引物组合Bra029454F/Bra029454R在自交系材料2011-243中能够扩增出126bp的条带，在冠291中能扩出121bp的条带，且能够通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(如图3所示)，则这对引物就能用于区分Bra029454基因在检测区域是否发生了突变，在2011-243中的扩增产物就是与检测野生型基因直接相关的标记，命名为Bra029454W，序列如SEQ ID No.1，在冠291中的扩增产物就是与突变基因检测直接相关的标记，命名为Bra029454m，序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2标记的应用
为了验证标记的实用性，我们用Bra029454F/Bra029454R引物组合检测了发明人课题组创制的部分种质资源，同时用大白菜自交系2011-243和冠291为亲本构建了F2群体，用该引物组合检测了F2群体的部分单株，进一步验证了标记的实用性。具体实施细则如下：
(1)部分种质资源和F2群体各单株基因组DNA提取如实施例1中“1.1”所述。
(2)PCR扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如实施例1中“1.2”第(2)步所述。
(3)PCR产物的检测如实施例1中“1.2”第(3)步所述。检测结果如图5所示，A是部分种质资源的检测结果，其中ck1是自交系2011-243、ck2是自交系冠291，1-10是十份大白菜资源。从图A可以看出编号4、5的种质资源在Bra029454位点的基因型与ck2相同，其余资源的基因型同ck1；B是对F2代部分单株的检测情况，p1是冠291、p2是2011-243，11-20是F2群体中的10个单株。从图中可以看出11、12、13、18的基因型同亲本p2，14、15、16同亲本p1，其余单株是杂合型。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 大白菜Bra029454移码突变检测标记及其在抗病育种中的应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> DNA
<213> 大白菜
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caaaacgaaa ctgtggaata gattagattg gctcaaaaaa gttcacatct cttaggtcct 120
tcttct 126
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> 大白菜
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acaacgcatg gagcctaaga ttcaaggttg aattccgtca gattgataca gagaagtttt 60
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t 121
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaacgcatg gagcctaaga tt 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agaagaagga cctaagagat gtgaact 27

Claims (4)

1.一种鉴定大白菜WRKY19异构体编码基因Bra029454SEQ ID No.1的第62-67bp处的野生型和突变体的共显性标记，其特征在于，其中第62-67bp处的“AAAACG”突变为“G”，所述共显性标记包括：与野生型相关的标记Bra029454W，片段大小126bp，如SEQ ID No.1所示；与突变体相关的标记Bra029454m，大小121bp，如SEQ ID No.2所示。
2.用于鉴别权利要求1所述的共显性标记的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
3.权利要求2所述的引物组在制备用于鉴定权利要求1所述的共显性标记的试剂盒中的应用。
4.一种用于鉴定权利要求1所述的共显性标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物。
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