CN108721699A - 一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料及制备方法。内层是将聚乙二醇‑b‑聚(L‑丙交酯‑co‑ε‑己内酯)与聚乙二醇溶于氯仿和N,N‑二甲基甲酰胺的混合溶剂中,以此作为油相。以三甲基化壳聚糖‑g‑聚乙二醇‑REDV包载miRNA‑126的水溶液作为水相进行乳液电纺,制备电纺纤维材料。外层是以聚(乙交酯‑co‑丙交酯)溶于氯仿和N,N‑二甲基甲酰胺的混合溶剂作为油相,以三甲基化壳聚糖‑g‑聚乙二醇‑VAPG包载miRNA‑145的水溶液作为水相,优化电纺过程,制备纤维直径为2～3μm的电纺纤维材料。可以同时有效控制两种miRNAs的释放速率；用于人工血管材料领域。

Description

一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料及制备方法
技术领域
本发明涉及一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料及制备方法,属于组织工程与生物医用材料领域。
背景技术
静电纺丝技术可制备纳米,微米尺度的材料,可以很好地模拟细胞外基质,从而有利于促进细胞的粘附,增殖与生长。同时,电纺纤维可高效地负载基因、蛋白和药物等活性物质以加强对细胞生理功能的调控。因此,电纺材料在组织工程与生物医用材料领域具有极高的实际应用价值。然而,单一的电纺纤维膜在组织工程中的应用仍存在不足,细直径纤维可提高细胞粘附,但不利于细胞向材料内部的生长,粗直径纤维则与此相反。因此根据细胞类型,可采用双层或多层纤维直径不同的电纺纤维膜以满足多种细胞对材料的不同需求,从而促进组织快速恢复(Q.P.Pham,U.Sharma,A.G.Mikos.Electrospun poly(ε-caprolactone)microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds:Characterization of scaffolds and measurement of cellularinfiltration.Biomacromolecules,2006,7(10):2796-2805)。对于人工血管材料而言,血管内皮细胞与血管平滑肌细胞对电纺纤维取向、孔隙大小的要求不同,因此,制备双层材料以满足两种细胞对材料的需求可更好地促进血管重塑(Z.Tan,X.Gao,T.Liu,Y.Yang,J.Zhong,C.Tong,Y.Tan.Electrospun vein grafts with high cell infiltration forvascular tissue engineering.Materials Science&Engineering C,2017,81:407-415)。
脂肪族聚酯材料聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)与聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)均具有良好的生物相容性与力学性能,近年来,被广泛应用于组织工程与生物医用材料领域。MicroRNAs(miRNAs)是非编码的长度约18-25个核苷酸的单链RNA分子,可以与靶mRNA特异性结合影响蛋白质的合成,进而影响细胞的生理特性。miRNA-126可促进血管内皮细胞的迁移与增殖,而miRNA-145可调控血管平滑肌细胞表型,抑制其过度增殖,因此在血管组织工程中具有重要的应用价值。裸露的miRNAs在体内极易失活,在基因治疗领域可通过与阳离子载体复合的方法解决此类问题。中国专利CN 105153430A中公开了一种三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-REDV共聚物的基因载体的制备方法,可以有效地包覆基因和miRNAs。同时,通过血管内皮细胞对小肽REDV的靶向识别,可实现miRNAs的靶向递送(袁晓燕,周芳,赵蕴慧,任丽霞.一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物及制备方法,CN 105153430A,2015)。将REDV置换为其他小肽如VAPG,则可实现miRNAs对血管平滑肌细胞的靶向递送。
在人工血管材料移植至体内后,尚存在一些问题。例如,在血管重塑初期,内皮层尚未形成,血液与生物材料相接触,易引起非特异性蛋白吸附,之后会引起血小板的粘附、活化和堆积,造成血栓；血管重塑中后期,血管平滑肌细胞易过度增殖,造成内皮增生、再狭窄等问题。通过在电纺纤维膜中负载miRNAs可有效地解决上述问题,如将miRNA-126负载至人工血管材料内层,可有效地促进血管内皮层的形成(F.Zhou,X.Jia,Y.Yang,Q.Yang,C.Gao,S.Hu,Y.Zhao,Y.Fan,X.Yuan.Nanofiber-mediated microRNA-126delivery tovascular endothelial cells for blood vessel regeneration.Acta Biomaterialia,2016,43:303-313)。将miRNA-145负载至人工血管材料外层,则可有效地调控血管平滑肌细胞表型,抑制其过度增殖(P.Zhou,F.Zhou,B.Liu,Y.Zhao,X.Yuan.Functionalelectrospun fibrous scaffolds with dextran-g-poly(L-lysine)-VAPG/microRNA-145to specially modulate vascular SMCs.Journal of Materials Chemistry B,2017,5(47):9312-9325)。根据血管重塑特点,需调控不同miRNAs的释放速率。在血管重塑初期,内层的miRNA-126应快速释放,而外层的miRNA-145应减少初期释放,增加中后期的释放量。控制电纺纤维对基因、药物等生物活性物质的快速释放,可通过引入易流失物质,如明胶、丝素和聚乙二醇等水溶性物质(Y.Yang,X.Li,L.Cheng,S.He,J.Zou,F.Chen,Z.Zhan.Core-sheath structured fibers with pDNA polyplex loadings for the optimal releaseprofile and transfection efficiency as potential tissue engineeringscaffolds.Acta Biomaterialia,2011,7(6):2533)。延缓电纺纤维中生物活性物质的释放,则可通过同轴电纺实现(A.Khalf,SV.Madihally.Recent Advances in MultiaxialElectrospinning for Drug Delivery.European Journal of Pharmaceutics&Biopharmaceutics,2017,112:1-17)。尽管同轴电纺能起到延缓生物活性物质释放的作用效果,但其工艺较为复杂,条件较为苛刻。在油包水乳液电纺体系中,分散于油相中的水相小液滴会在静电场的牵引下被压缩,形成电纺纤维的芯层或分散于纤维内部。通过调整工艺参数,使纤维直径加粗,可使水相中的药物扩散更加困难,达到延缓释放的目的。关于乳液电纺中,加粗电纺纤维直径以延缓生物活性物质释放的研究未见报道。
在血管重塑过程中,根据血管重塑特点,通过优化电纺纤维的性能,合理调控不同miRNAs的释放速率,具有非常高的实际价值。本发明根据血管内皮细胞与血管平滑肌细胞对材料的不同需求,制备了双层人工血管电纺材料。内层材料通过引入聚乙二醇,加快miRNA-126的释放速率。外层材料通过加粗纤维直径,延缓miRNA-145的释放速率。本发明在小口径人工血管材料领域具有很好的应用前景，且目前未见报道。
发明内容
为了解决现有技术的问题,本发明以脂肪族聚酯PELCL和PLGA为原料,制备一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料。该人工血管材料可同时有效负载两种miRNAs,并根据血管重塑的特点,合理地控制其释放速率,具有促进血管内皮细胞粘附、增殖,调控血管平滑肌细胞表型,抑制其过度增殖的功能。
本发明的技术方案如下：
一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料,其特征在于该材料由内外两层材料构成,内层为负载miRNA-126的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇电纺纤维材料,外层为负载miRNA-145的聚(乙交酯-co-丙交酯)电纺纤维材料。
所述内层材料为聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇/三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-REDV/miRNA-126电纺纤维材料,直径为500～800nm,厚度为100～300μm。
所述外层材料为聚(乙交酯-co-丙交酯)/三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-VAPG/miRNA-145电纺纤维材料,直径为1～3μm,厚度为100～300μm。
本发明负载miRNAs的双层人工血管电纺材料的制备方法,其特征是包括以下过程：
(1)将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)与聚乙二醇按质量比10:(1～5)一起溶于体积比为(4～8):1氯仿和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中,配置成浓度为100～200mg/mL溶液作为油相；将载体三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-REDV与miRNA-126按质量比(10～20):1混和,作为水相；将油相与水相按照(20～30):1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液；
(2)将聚(乙交酯-co-丙交酯)溶于体积比为(4～8):1的氯仿和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中,配置成浓度为200～400mg/mL溶液作为油相；将载体三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-VAPG与miRNA-145按质量比(10～20):1混和,作为水相,将油相与水相按照(20～30):1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液；
(3)以直径为1.5mm的铁棒为接收装置,将按步骤(1)所得的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率0.3～0.6mL/h,电压10～15kV,接收距离10～15cm,电纺1～3h,得到直径为500～800nm、厚度为100～300μm的电纺纤维材料；以此材料为接收装置,将按步骤(2)所得的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率4～8mL/h,电压10～15kV,接收距离10～15cm,电纺30min～1h得到直径为1～3μm、厚度为100～300μm电纺纤维材料。
所述聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)数均分子量为(5～19)×104。
所述聚乙二醇数均分子量为1000～5000。
所述的聚(乙交酯-co-丙交酯)的数均分子量为(4～10)×104。
所述的载体三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-REDV(TMC-g-PEG-REDV)与三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-VAPG(TMC-g-PEG-VAPG)是根据中国专利CN 105153430A制备的。
由于靶向肽的存在,TMC-g-PEG-REDV可将miRNA-126靶向运输至血管内皮细胞,TMC-g-PEG-VAPG可将miRNA-145靶向运输至血管平滑肌细胞。
本发明的负载miRNAs的双层人工血管电纺材料用于小口径血管移植材料领域。本发明的优点在于,该双层人工血管电纺材料可同时有效控制两种miRNAs的释放速率。内层电纺纤维直径为500～800nm,其中掺杂聚乙二醇,可加快miRNA-126释放速率。外层电纺纤维直径为1～3μm,乳液电纺使miRNA-145复合粒子分散于电放纤维内部,加粗直径使粒子扩散更加困难,延缓miRNA-145的释放过程。
附图说明
图1：实施例1制备的负载miRNAs的双层人工血管电纺材料的SEM照片,内层材料为聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇/TMC-g-PEG-REDV/miRNA-126电纺纤维材料,外层材料为聚(乙交酯-co-丙交酯)/TMC-g-PEG-VAPG/miRNA-145电纺纤维材料；两层界限以虚线表示。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述,以下实施案例是对本发明的进一步说明,并不限制本发明的适用范围。
负载miRNAs的双层人工血管电纺材料,由内外两层材料构成,内层材料为负载有miRNA-126的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇电纺纤维材料,由直径为500～800nm的电纺纤维构成,其厚度为100～300μm。外层材料为负载有miRNA-145的聚(乙交酯-co-丙交酯)电纺纤维材料,由直径为1～3μm的电纺纤维构成,其厚度为100～300μm。
上述聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇,其聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)数均分子量为(5～19)×104,其聚乙二醇数均分子量为(1～5)×103。聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)和聚乙二醇质量比为10:(1～5)。
上述聚(乙交酯-co-丙交酯)的数均分子量为(4～10)×104。
上述的负载miRNAs的双层人工血管电纺材料的制备方法,包括以下过程：
(1)将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)与聚乙二醇按质量比10:(1～5)一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,(4～8):1)混合溶液中,配置成浓度为100～200mg/mL溶液作为油相,将载体TMC-g-PEG-REDV与miRNA-126按质量比(10～20):1混和,作为水相,将油相与水相按照(20～30):1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
(2)将聚(乙交酯-co-丙交酯)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,(4～8):1)混合溶液中,配成浓度为200～400mg/mL溶液作为油相,将载体TMC-g-PEG-VAPG与miRNA-145按质量比(10～20):1混和作为水相,将油相与水相按照(20～30):1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
(3)以直径为1.5mm的铁棒为接收装置,将按步骤(1)所得的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率0.3～0.6mL/h,电压10～15kV,接收距离10～15cm,电纺1～3h,得到直径为500～800nm、厚度为100～300μm的电纺纤维材料；以此材料为接收装置,将按步骤(2)所得的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率4～8mL/h,电压10～15kV,接收距离10～15cm,电纺30min～1h得到直径为1～3μm、厚度为100～300μm双层电纺纤维膜材料。
所述的载体TMC-g-PEG-REDV与TMC-g-PEG-VAPG的制备方法是根据中国专利CN105153430A制备的,其制备方法特征包括以下步骤：
(1)原料邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸醋和三甲基化壳聚糖(TMC)的质量比为3:1,三甲基化壳聚糖的浓度为10mg/ml,去离子水作为溶剂,室温下反应6h。产物使用去离子水透析,最后冻干得到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶。
(2)三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物和REDV小肽或VAPG小肽的质量比为10:1,加入2ml去离子水为溶剂,室温反应2h。未参加反应的小肽通过离心过滤并透析除去,制得TMC-g-PEG-REDV与TMC-g-PEG-VAPG。
实施例1：
在装有磁力搅拌的三口瓶中,将壳聚糖和2.4g碘化钠加入到5.6ml质量分数为15％的NaOH与N-甲基-2-吡咯烷酮的混合溶液中,并加入6ml碘甲烷,在60℃下回流反应45min。再加入5.6ml质量分数为15％的NaOH溶液和3ml的碘甲烷,搅拌反应。之后加入40ml乙醇来终止反应,将产物过滤并使用乙醚洗涤。最后,将产物溶解在质量分数为10％NaCl溶液中,搅拌3h。产物使用去离子水透析72h,冻干得到三甲基化壳聚糖(TMC)。取20mgTMC与60mg的邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯加入2ml去离子水作为溶剂,在室温下反应6h,反应产物使用去离子水透析,最后冻干得到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物。在10mg的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物和1mg REDV-Cys或1mg VAPG-Cys中,加入2ml的去离子水作为溶剂,室温下反应2h。未参加反应的小肽通过离心过滤并透析除去,制得TMC-PEG-REDV与TMC-PEG-VAPG共聚物。
将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)与聚乙二醇按质量比10:1一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,4:1)混合溶液中,配置成浓度为150mg/mL溶液作为油相,以载体将80μg的载体TMC-g-PEG-REDV与4μg的miRNA-126混和作为水相,将油相与水相按照20:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。将聚(乙交酯-co-丙交酯)(LA:GA＝3:1,)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,4:1)混合溶液中,配置成浓度为300mg/mL溶液作为油相,将80μg的载体TMC-g-PEG-VAPG与4μg的miRNA-145作为水相,将油相与水相按照20:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
将上述所得的乳液依次进行电纺,内层聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇的乳液电纺条件为:注射速率0.45mL/h,电压10～13kV,接收距离13～15cm,电纺2h得到直径为600～700nm、厚度为200μm电纺纤维材料。之后,将聚(乙交酯-co-丙交酯)的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率6mL/h,电压为13～15kV,接收距离13～15cm,电纺45min得到直径为2～2.5μm、厚度为200μm电纺纤维材料。该双层人工血管材料的横截面SEM照片,如图1所示。本例中,内层材料中的miRNA-126的释放速率明显加快,与未加聚乙二醇的样品相比,9天时,累积释放量提高了34％；在样品上培养血管内皮细胞时,本例中的内层材料与未加聚乙二醇的样品相比,细胞增殖速率明显加快,在3天,6天,9天,细胞数分别为未加聚乙二醇样品的1.19倍,1.31倍,1.43倍。外层材料中的miRNA-145的释放速率明显得到延缓,1d时的突释量为8％,与普通细直径样品(直径为600～700nm)相比,突释量降低了60％,10d时,累积释放量降低了45％,且在20-30天时,释放速率提高了50％。
实施例2：
TMC-PEG-REDV与TMC-PEG-VAPG共聚物的制备方法与例1相同。
将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)与聚乙二醇按质量比10:5一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,6:1)混合溶液中,配置成浓度为100mg/mL溶液作为油相,将60μg的载体TMC-g-PEG-REDV与4μg的miRNA-126混和作为水相,将油相与水相按照30:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。将聚(乙交酯-co-丙交酯)(LA:GA＝3:1,)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,6:1)混合溶液中,配置成浓度为200mg/mL溶液作为油相,将60μg的载体TMC-g-PEG-VAPG与4μg的miRNA-145作为水相,将油相与水相按照30:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
将上述所得的乳液依次进行电纺,内层聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇的乳液电纺条件为:注射速率0.3mL/h,电压为13～15kV,接收距离10～13cm,电纺1h得到直径为500～600nm、厚度为100μm电纺纤维材料。之后,将聚(乙交酯-co-丙交酯)的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率4mL/h,电压10～13kV,接收距离10～13cm,电纺30min得到直径为1～2μm、厚度为100μm电纺纤维材料。
实施例3：
TMC-PEG-REDV与TMC-PEG-VAPG共聚物的制备方法与例1相同。
将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)与聚乙二醇按质量比10:3一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,8:1)混合溶液中,配置成浓度为200mg/mL溶液作为油相,将40μg的载体TMC-g-PEG-REDV与4μg的miRNA-126混和作为水相,将油相与水相按照25:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。将聚(乙交酯-co-丙交酯)(LA:GA＝3:1,)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,8:1)混合溶液中,配置成浓度为300mg/mL溶液作为油相,将40μg的载体TMC-g-PEG-VAPG与4μg的miRNA-145作为水相,将油相与水相按照25:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
将上述所得的乳液依次进行电纺,内层聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇的乳液电纺条件为:注射速率0.6mL/h,电压为13～15kV,接收距离13～15cm,电纺3h得到直径为700～800nm、厚度为300μm电纺纤维材料。之后,将聚(乙交酯-co-丙交酯)的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率8mL/h,电压10～13kV,接收距离13～15cm,电纺1h得到直径为2.4～3μm、厚度为300μm电纺纤维材料。
实施例4：
TMC-PEG-REDV与TMC-PEG-VAPG共聚物的制备方法与例1相同。
将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)与聚乙二醇按质量比10:1一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,8:1)混合溶液中,配置成浓度为200mg/mL溶液作为油相,将60μg的载体TMC-g-PEG-REDV与4μg的miRNA-126混和作为水相,将油相与水相按照25:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。将聚(乙交酯-co-丙交酯)(LA:GA＝3:1,)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,6:1)混合溶液中,配置成浓度为300mg/mL溶液作为油相,将60μg的载体TMC-g-PEG-VAPG与4μg的miRNA-145作为水相,将油相与水相按照25:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
将上述所得的乳液依次进行电纺,内层聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇的乳液电纺条件为:注射速率0.3mL/h,电压10～13kV,接收距离13～15cm,电纺2h得到直径为700～800nm、厚度为200μm电纺纤维材料。之后,将聚(乙交酯-co-丙交酯)的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率6mL/h,电压10～13kV,接收距离10～12cm,电纺45min得到直径为2.2～2.6μm、厚度为200μm电纺纤维材料。
实施例5：
TMC-PEG-REDV与TMC-PEG-VAPG共聚物的制备方法与例1相同。
将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)与聚乙二醇按质量比10:1一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,4:1)混合溶液中,配置成浓度为150mg/mL溶液作为油相,以载体将80μg的载体TMC-g-PEG-REDV与4μg的miRNA-126混和作为水相,将油相与水相按照30:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。将聚(乙交酯-co-丙交酯)(LA:GA＝3:1,)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,4:1)混合溶液中,配置成浓度为300mg/mL溶液作为油相,将60μg的载体TMC-g-PEG-VAPG与4μg的miRNA-145作为水相,将油相与水相按照25:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
将上述所得的乳液依次进行电纺,内层聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇的乳液电纺条件为:注射速率0.45mL/h,电压10～13kV,接收距离13～15cm,电纺2h得到直径为600～700nm、厚度为200μm电纺纤维材料。之后,将聚(乙交酯-co-丙交酯)的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率6mL/h,电压为13～15kV,接收距离13～15cm,电纺30min得到直径为2～2.5μm、厚度为100μm电纺纤维材料。
实施例6：
将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)与聚乙二醇按质量比10:5一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,6:1)混合溶液中,配置成浓度为100mg/mL溶液作为油相,将40μg的载体TMC-g-PEG-REDV与4μg的miRNA-126混和作为水相,将油相与水相按照20:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。将聚(乙交酯-co-丙交酯)(LA:GA＝3:1,)溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺(v/v,6:1)混合溶液中,配置成浓度为200mg/mL溶液作为油相,将60μg的载体TMC-g-PEG-VAPG与4μg的miRNA-145作为水相,将油相与水相按照30:1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液。
将上述所得的乳液依次进行电纺,内层聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇的乳液电纺条件为:注射速率0.3mL/h,电压13～15kV,接收距离10～13cm,电纺1h得到直径为500～600nm、厚度为100μm电纺纤维材料。之后,将聚(乙交酯-co-丙交酯)的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率4mL/h,电压为10～13kV,接收距离是10～13cm,电纺45min得到直径为1～2μm、厚度为200μm电纺纤维材料。

Claims (9)

1.一种负载miRNAs的双层人工血管电纺材料,其特征在于该材料由内外两层材料构成,内层为负载miRNA-126的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇电纺纤维材料,外层为负载miRNA-145的聚(乙交酯-co-丙交酯)电纺纤维材料。
2.权利要求1所述电纺材料,其特征是内层材料为聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚乙二醇/三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-REDV/miRNA-126电纺纤维材料,电纺纤维材料由直径为500～800nm的电纺纤维构成,其厚度为100～300μm。
3.权利要求1所述电纺材料,其特征是外层是聚(乙交酯-co-丙交酯)/三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-VAPG/miRNA-145电纺纤维材料,电纺纤维材料由直径为1～3μm的电纺纤维构成,其厚度为100～300μm。
4.权利要求1负载miRNAs的双层人工血管电纺材料的制备方法,其特征是包括以下过程：
(1)将聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)与聚乙二醇按质量比10:(1～5)一起溶于体积比为(4～8):1氯仿和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中,配置成浓度为100～200mg/mL溶液作为油相；将载体三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-REDV与miRNA-126按质量比(10～20):1混和,作为水相；将油相与水相按照(20～30):1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液；
(2)将聚(乙交酯-co-丙交酯)溶于体积比为(4～8):1的氯仿和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中,配置成浓度为200～400mg/mL溶液作为油相；将载体三甲基化壳聚糖-g-聚乙二醇-VAPG与miRNA-145按质量比(10～20):1混和,作为水相,将油相与水相按照(20～30):1体积比混和,搅拌,制备成稳定的乳液；
(3)以直径为1.5mm的铁棒为接收装置,将按步骤(1)所得的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率0.3～0.6mL/h,电压10～15kV,接收距离10～15cm,电纺1～3h,得到直径为500～800nm、厚度为100～300μm的电纺纤维材料；以此材料为接收装置,将按步骤(2)所得的乳液进行电纺,电纺条件为:注射速率4～8mL/h,电压10～15kV,接收距离10～15cm,电纺30min～1h得到直径为1～3μm、厚度为100～300μm电纺纤维材料。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是所述聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)数均分子量为(5～19)×104。
6.如权利要求4所述的方法，其特征是所述聚乙二醇数均分子量为1000～5000。
7.如权利要求4所述的方法，其特征是所述的聚(乙交酯-co-丙交酯)的数均分子量为(4～10)×104。
8.负载miRNAs的双层人工血管电纺材料应用血管移植领域。
9.负载miRNAs的双层电纺材料应用于小口径人工血管材料。
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