CN108721217A - 抗肿瘤药物组合物及药物制剂和应用 - Google Patents

抗肿瘤药物组合物及药物制剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物领域，涉及一种抗肿瘤药物组合物及药物制剂和应用。该药物组合物含有雷公藤内酯醇和环巴胺，其中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。本发明使用雷公藤内酯醇和环巴胺作为抗肿瘤的活性药物，以PEG‑PCL或PEG‑PLA为载体材料，采用溶剂挥发法制备同时包载雷公藤内酯醇和环巴胺的聚合物胶束(TP/CPA‑PM)，该聚合物胶束包封率较高，粒径分布均匀，通过体外细胞试验测定其抗肿瘤效果可知，TP和CPA具有协同抗肿瘤作用，可通过多靶点发挥抗肿瘤活性，同时可通过减少用量而降低其毒副反应。

Description

抗肿瘤药物组合物及药物制剂和应用
技术领域
本发明属于药物领域，更具体地，涉及一种抗肿瘤药物组合物、一种抗肿瘤药物制剂、雷公藤内酯醇和环巴胺的联合应用。
背景技术
当今社会，癌症已然成为人类的头号杀手之一，药物治疗仍然是抗肿瘤的主要治疗方法，越来越多的人力及物力被投入到抗肿瘤药物的研发上。在抗肿瘤药物治疗中，存在化疗药物选择性不强、毒副作用大、易产生耐药性、肿瘤易复发和转移等问题，因此寻找新的抗肿瘤药物、降低药物的毒副作用、解决肿瘤的耐药性等问题成为主要的研究方向。
雷公藤内酯醇(triptolide，TP)，又称雷公藤内酯、雷公藤甲素，是从中药雷公藤中提取分离的高效二萜内酯类化合物，具有抗炎、免疫调节、抗生育等药理作用，近年来因其具有广谱、高效的抗肿瘤活性而成为研究的热点。有研究表明TP对包括胰腺癌、直肠癌、胆管癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤有抑制作用，而且能协同增强多种化疗药物的抗肿瘤效应，还可逆转肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)，其逆转机制包括下调MDR1/P‐糖化蛋白(P‐gp)的表达，抑制蛋白激酶B/核转录因子‐κB(Akt/NF‐κB)的活性，提高细胞内活性氧(ROS)水平，诱导细胞凋亡，抑制多药耐药相关蛋白(MRP)表达，调节促凋亡基因/抗凋亡基因(Bax/Bcl‐2)表达，抑制Bcr/abl融合基因T315I点突变等(王海娟等.雷公藤内酯醇逆转肿瘤多药耐药研究进展.中国实验方剂学杂志,2016,22(10):229‐234.)。TP的分子式为C20H24O6，分子量360.4，不溶于水，易溶于二甲亚砜、乙醇、丙酮等有机溶剂，但因其具有的严重毒副反应制约了其临床应用。近年来，美国明尼苏达大学的学者开发出了水溶性的TP前药Minnelide(Chugh R,et al.A Preclinical evaluation of minnelide as atherapeutic agent against pancreatic cancer.Science Translational Medicine,2012,4(156):156ra139.Rivard C,et al.Inhibition of epithelial ovarian cancerby Minnelide,a water‐soluble pro‐drug.Gynecologic Oncology,2014,135:318‐324.)，国内学者也研究出结构修饰的水溶性TP化合物PG490‐88(F6008)，它们在体内均能重新转化为有很强抗肿瘤活性的TP，目前均处于Ⅰ期临床研究阶段(Kitzen JJ,etal.Phase I dose‐escalation study of F60008,a novel apoptosis inducer,inpatients with advanced solid tumours.Eur J Cancer,2009,45(10):1764‐1772.)。
环巴胺(cyclopamine，CPA)是从藜芦属植物山藜芦中分离得到的一种异甾体类生物碱，研究表明其对多种肿瘤如母髓质细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等均有显著的抑制活性，作用机制是对hedgehog信号通路有抑制作用，可诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常体细胞的生长无影响(顾文龙等,环巴胺及其类似物的抗肿瘤作用.药学进展,2009,33(2):67‐72.)。美国基因泰克公司(Genetech)已进行环巴胺治疗肿瘤的I期临床试验。CPA的分子式为C27H41NO2，分子量为411.6，不溶于水，溶于甲醇、乙醇、二氯甲烷和氯仿，具有严重的致畸毒性。有学者对环巴胺的结构进行修饰，发现CPA的3位羟基氧化为羰基后，其抑制hedgehog信号通路的活性增强；另外CPA的F环上N原子与L‐鼠李糖以α‐糖苷键连接形成糖苷后，其溶解性加强，抗肿瘤活性亦加强(顾文龙等,环巴胺及其类似物的抗肿瘤作用.药学进展,2009,33(2):67‐72.)。
目前尚未见雷公藤内酯醇和环巴胺联合使用的文献报道。
发明内容
TP和CPA都具有明确的抗肿瘤活性，且抗肿瘤谱广泛，抗肿瘤作用机制各异。但两者均不溶于水、毒副作用很大。如果两者合用有协同作用，则可通过降低两者的给药剂量而降低其毒副反应；另外CPA和TP抗肿瘤机制不同，TP抗肿瘤作用机制多样，可通过抑制细胞周期、激活Caspase信号通路、抑制血管内皮生长因子、抑制NF‐κB活性等发挥抗肿瘤作用，CPA是通过抑制肿瘤细胞的hedgehog信号通路而发挥抗肿瘤作用，两药合用可发挥多靶点抗肿瘤作用，使其抗肿瘤作用增强。
基于上述构思，本发明的目的是提供雷公藤内酯醇(TP)和环巴胺(CPA)制备抗肿瘤的联合用药物中的用途，具体涉及一种高分子化合物制备的载TP和CPA的聚合物胶束(triptolide and cyclopamine loaded in polymeric micelles，TP/CPA‐PM)，在保持TP和CPA各自抗肿瘤活性的前提下，TP/CPA‐PM还可以增加药物的水溶性和靶向性，达到增加疗效、降低毒副作用的目的。
本发明的第一方面提供一种抗肿瘤药物组合物，该药物组合物含有雷公藤内酯醇和环巴胺，其中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。
本发明的第二方面提供一种抗肿瘤药物制剂，所述抗肿瘤药物制剂为聚合物胶束，其含有聚合物胶束载体和活性组分，所述活性组分为上述药物组合物。
本发明中，所述聚合物胶束载体优选为PEG‐PCL和/或PEG‐PLA。
所述聚合物胶束载体的用量可根据需要确定，优选地，所述聚合物胶束载体与雷公藤内酯醇的重量比为50‐100：1。
根据本发明，所述聚合物胶束的平均粒径小于200nm，优选地，所述聚合物胶束的平均粒径为40‐60nm。
本发明中所述聚合物胶束可采用本领域常规的各种作为药物递送体系的聚合物胶束的制备方法制得。优选地，所述药物制剂由包括以下步骤的方法制得：将雷公藤内酯醇、环巴胺与聚合物胶束载体制备成聚合物胶束，再加入冷冻剂冷冻保存。
本发明中，所述冷冻剂优选为蔗糖；所述冷冻剂的用量优选为雷公藤内酯醇重量的40‐60倍。
根据本发明，优选地，制备聚合物胶束的有机相为丙酮或四氢呋喃，优选为丙酮；水相为双蒸水或含0.2‐0.8％PEG‐MeDMA的双蒸水，优选为含0.2‐0.8％PEG‐MeDMA的双蒸水；有机相和水相的体积比优选为1：1‐3。
根据本发明一种优选的具体实施方式，所述药物制剂由包括以下步骤的方法制得：
(1)将雷公藤内酯醇和环巴胺溶于无水乙醇中，然后加入丙酮或四氢呋喃混合，再加入PEG‐PCL或PEG‐PLA，涡旋混合，得到溶液A，其中，雷公藤内酯醇的浓度为0.5‐1.5mg/mL，环巴胺的浓度为0.5‐7.5mg/mL，PEG‐PCL或PEG‐PLA的浓度为50‐100mg/mL，所述无水乙醇与丙酮或四氢呋喃的体积比为1：5‐15；
(2)将PEG‐MeDMA溶于水中得到溶液B，其中PEG‐MeDMA的浓度为2‐8mg/mL。
(3)在溶液A处于快速涡旋的条件下，将溶液B快速加入溶液A中，形成溶液C，其中，溶液A与溶液B的体积比为1：1‐3；
(4)将溶液C进行真空旋转蒸发，去除有机溶剂，得到溶液D；所述旋转的条件例如为：温度40‐50℃，压力120‐130mPa，时间为8‐12min；
(5)将溶液D进行透析，透析优选采用3500Da的透析袋，透析温度优选为4℃，透析时间可根据需要确定，收集透析袋内的溶液，离心，所述离心的条件例如为：4℃，5000rpm，10min；收集离心后的上清液，向其中加入占上清液8‐12％体积的、浓度为40‐60％的蔗糖溶液，得到聚合物胶束。
该方法还可包括：(6)将所述聚合物胶束储存于‐80℃冰箱中。
上述PEG‐PCL、PEG‐PLA和PEG‐MeDMA可商购获得，也可以通过本领域公知的方法制得。
本发明的第三方面提供雷公藤内酯醇和环巴胺在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞增殖抑制剂中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。
本发明中，所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胰腺星状细胞；优选地，所述乳腺癌细胞为小鼠乳腺癌细胞株4T1、人乳腺癌细胞株MDA‐MB‐468、人乳腺癌细胞株MDA‐MB‐231；所述人胰腺癌细胞为人胰腺癌细胞株Miapaca‐2、人胰腺癌细胞株Kras*cells；所述胰腺星状细胞为人胰腺星状细胞株HPSC。
本发明的第四方面提供雷公藤内酯醇和环巴胺在制备抗肿瘤的联合用药物中的应用，所述药物中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。
根据本发明，所述肿瘤包括乳腺癌和/或胰腺癌。
本发明使用雷公藤内酯醇和环巴胺作为抗肿瘤的活性药物，以PEG‐PCL或PEG‐PLA为载体材料，采用溶剂挥发法制备同时包载雷公藤内酯醇和环巴胺的聚合物胶束(TP/CPA‐PM)，该聚合物胶束包封率较高，粒径分布均匀，通过体外细胞试验测定其抗肿瘤效果可知，TP和CPA具有协同抗肿瘤作用，可通过多靶点发挥抗肿瘤活性，同时可通过减少用量而降低其毒副反应。
具体地，本发明的载联用雷公藤内酯醇和环巴胺的聚合物胶束具有以下优点：
(1)有效提高了药物的水溶性和被动靶向性，粒径小于100nm，粒子分布均匀，为达到抗肿瘤主动靶向提供了基础制剂；
(2)聚合物胶束对TP和CPA的包封率均较高，可达50％以上；
(3)体外细胞实验结果表明两药合用有协同作用，制成纳米制剂抗肿瘤效果更好，因此可以发挥两药多靶点抗肿瘤作用，同时可通过减少药物用量而达到降低毒副反应的目的；
(4)制备方法简单，易于操作。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为用丙酮制备的混合载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM粒径图(粒径52.8nm，PDI＝0.116)。
图2为用四氢呋喃制备的混合载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM粒径图(粒径107.5nm，PDI＝0.175)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中所用PEG‐PCL和PEG‐MeDMA均为自制，参考文献Zhou J.,etal.Cyclopamine‐loaded core‐cross‐linked polymeric micelles enhance radiationresponse in pancreatic cancer and pancreatic stellate cells[J].MolecularPharmaceutics,2015,12:2093‐2100.
实施例1
本实施例用于说明载雷公藤内酯醇和环巴胺的聚合物胶束的制备及表征
1、材料
1.1药品和试剂
雷公藤内酯醇(纯度>98％)和环巴胺(纯度>98％)均购于美帝药库医药科技公司。所用其他试剂购于美国Sigma‐Aldrich公司或Fisher公司。
1.2仪器
Brookhaven 90Plus激光粒度仪(美国布鲁克海文仪器公司)，Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，Buchi R205旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)，D‐TubeTM微量透析管(美国密理博公司)，YB‐521往复式恒温水浴摇床(美国Scientific Industries公司)，Vortex‐Genie2涡旋仪(美国Scientific Industries公司)。
2、方法
2.1 TP/CPA‐PM的制备
TP/CPA‐PM制备方法如下：
(1)精密称取1mg TP和1mg CPA溶于0.1mL无水乙醇中，然后加入0.9mL丙酮或四氢呋喃，混合均匀，再加入100mg PEG‐PCL，涡旋混合，使药物和载体充分溶解，得到溶液A；
(2)取0.1ml PEG‐MeDMA(100mg/ml)放入烧杯，滴加入1.9ml超纯水使完全溶解，得到溶液B；
(3)在高速涡旋下，迅速将溶液B加入溶液A中，得到透明的带蓝色乳光的液体；
(4)将步骤(3)得到的溶液在49℃，128mPa的条件下旋转蒸发10min；
(5)将旋转蒸发后的溶液移至分子量为3500Da的透析袋(Slide‐A‐Lyzer 3500，美国Thermo Scientific公司)，在4℃的温度下透析1h；
(6)将步骤(5)得到的溶液，在4℃下以5000rpm的转速离心10min；
(7)在温和涡旋下，将10％(v/v)步骤(6)得到上清液体积的50％蔗糖溶液滴入上述上清液中；
(8)将步骤(7)获得的聚合物胶束储存在‐80℃的冰箱中。
2.2TP/CPA‐PM包封率的测定
2.2.1HPLC条件
采用Agilent Zorbax 300SB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(A相)和乙腈(B相)，以5％B至95％B(v/v)的梯度运行30min以上，检测波长为210nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，注射体积为20μL。TP保留时间为12min左右，CPA保留时间为15min左右，两药分离度良好，溶剂峰不干扰药品。
2.2.2线性范围及回归方程
分别精密称取一定量TP对照品和CPA对照品，用无水乙醇溶解定容配制成一定浓度母液，精密量取一定量母液，用乙醇配制成TP浓度为366μg/mL、183μg/mL、91.5μg/mL、46μg/mL、23μg/mL，对应CP浓度为410μg/mL、205μg/mL、102.5μg/mL、51μg/mL、25.5μg/mL的系列准溶液，分别进样20μL进行色谱分析。以响应值峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，分别得到TP的标准曲线方程为A＝42.30C‐876.71，相关系数R2＝0.9984，CPA标准曲线方程为A＝28.59C+54.90，相关系数R2＝0.9998。
2.2.3包封率测定
量取制备的载药聚合物胶束20μL溶于180μL的乙醇中，在4℃以5000rpm的速度离心5min。取20μL上清液通过HPLC检测其中的TP、CPA含量，代入标准曲线计算聚合物胶束包裹TP、CPA的量，经换算后按下式计算包封率(EE，％)：
包封率(EE％)＝W1/W2×100
式中W1为聚合物胶束包裹的TP或CPA的量(mg)，W2为加入的TP或CPA的量(mg)。
2.2.4聚合物胶束的粒径测定
室温条件下称取适量聚合物胶束，用超纯水稀释100倍，超声分散均匀之后，用激光粒度仪测定空白聚合物胶束和载药聚合物胶束的粒径。
2.2.5聚合物胶束体外释放特性研究
取0.5mL聚合物胶束置于微量透析管中(截留分子量为3500Da)，放入装有10mLPBS缓冲液(pH＝7.4)或醋酸钠缓冲液(10mM，pH＝5.2)或醋酸钠缓冲液(10mM，pH＝6.0)的试管中，在37℃、100r/min恒温搅拌下温育。分别在不同时间点取样0.5mL，并补加0.5mL对应缓冲溶液。0.5mL样品加入450mL无水乙醇涡旋后，在4℃下5000rpm离心5min，取20μL上清液进样进行HPLC测定。带入标准曲线方程计算不同时间点收集液中药物的浓度，经推算得累积释药百分数。
3、结果
3.1聚合物胶束的粒径和包封率
3.1.1有机相为丙酮制备聚合物胶束
选择丙酮为有机相，有机相:水相(v/v)＝1:2，当PEG‐PCL分别为100mg左右和50mg左右时制备载TP的聚合物胶束(TP‐PM)和空白聚合物胶束(Blank‐PM)，测得聚合物胶束的粒径和多分散系数(PDI)结果见表1，可见载体多时粒径较大，载药胶束粒径小于空白胶束，所有聚合物胶束的PDI均小于0.2，说明聚合物胶束粒子分布均匀、大小比较一致。
表1有机相为丙酮时聚合物胶束的粒径
样品 TP(mg) PEG‐PCL(mg) 粒径(nm) PDI
TP‐PM(n＝3) 1.6±0.4 98.7±1.4 94.4±8.2 0.14±0.04
TP‐PM(n＝2) 0.9±0.1 51.7±1.0 75.8±12.5 0.15±0.05
Blank‐PM 0 100 105.9 0.131
Blank‐PM 0 50.9 90.1 0.143
选择丙酮为有机相，有机相:水相(v/v)＝1:2，固定PEG‐PCL为100mg左右，分别制备载TP、CPA、TP/CPA(w/w＝1:1)、TP/CPA(w/w＝1:2)的聚合物胶束，TP/CPA(1:1)‐PM对TP和CPA的包封率分别为(48.7±7.7)％和(58.9±6.0)％，TP/CPA(1:2)‐PM对TP和CPA的包封率分别为(57.1±5.1)％和(61.3±25.6)％。所有载药聚合物胶束的粒径均小于100nm，PDI均小于0.2，而且载CPA的聚合物胶束粒径(55.4±3.0nm)明显小于载TP聚合物胶束粒径(95.3±2.2nm)，混合载药的聚合物胶束的粒径也明显小于载TP聚合物胶束粒径，结果见表2。用丙酮制备的混合载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM粒径图见图1。
表2有机相为丙酮时聚合物胶束的粒径和包封率(n＝3)
3.1.2有机相为四氢呋喃制备聚合物胶束
选择四氢呋喃为有机相，有机相:水相(v/v)＝1:2，固定PEG‐PCL为(100±10)mg左右，分别精密称取不同重量的TP、CPA，分别制备载TP或CPA或TP+CPA的聚合物胶束。聚合物胶束TP‐PM、CPA‐PM、TP/CPA(1:1)‐PM、TP/CPA(1:3)‐PM、TP/CPA(1:4)‐PM的粒径均大于100nm，粒径要大于用丙酮制备的聚合物胶束，一半的PDI小于0.1，说明用四氢呋喃制备的聚合物胶束粒子分布更加均匀。但TP/CPA(1:7)‐PM的粒径小于100nm，说明载CPA较多后可使粒径变小。所有聚合物胶束对药物的包封率大于用丙酮制备的聚合物胶束，与粒径大包封率较大有关。结果见表3。用四氢呋喃制备的混合载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM粒径图见图2。
表3有机相为四氢呋喃时聚合物胶束的粒径和包封率
3.2载药聚合物胶束的体外释放特性
载药聚合物胶束在不同溶出介质中的累积释放百分率结果见表4～表12，结果表明在pH＝5.2的溶出介质中的累积释放百分率大于在pH＝6.0的溶出介质中的百分率，而在pH＝7.4的溶出介质中的累积释放百分率最小，说明聚合物胶束的体外释放与周围环境的酸碱度有关，在酸性环境中释放多，肿瘤所处的环境为酸性环境，因而该聚合物胶束适合用于抗肿瘤治疗。TP从聚合物胶束释放的速度较快，而CPA从聚合物胶束的释放速度比较慢，表明TP可能吸附在聚合物胶束的表面，而CPA则包裹在聚合物胶束内部，释放速度不同，也便于发挥协同抗肿瘤作用。用丙酮制备的聚合物胶束与用四氢呋喃制备的聚合物胶束的体外释放特性相似。但理论上丙酮的毒性小于四氢呋喃。因此在体外抗肿瘤实验中用丙酮为有机相制备的聚合物胶束进行实验。
表4用丙酮制备的聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM的体外溶出特性
表5用丙酮制备的聚合物胶束TP/CPA(1:2)‐PM的体外溶出特性
表6用丙酮制备的聚合物胶束CPA‐PM的体外溶出特性
表7用四氢呋喃制备的聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM的体外溶出特性
表8用四氢呋喃制备的聚合物胶束TP/CPA(1:3)‐PM的体外溶出特性
表9用四氢呋喃制备的聚合物胶束TP/CPA(1:4)‐PM的体外溶出特性
表10用四氢呋喃制备的聚合物胶束TP/CPA(1:7)‐PM的体外溶出特性(n＝2)
表11用四氢呋喃制备的聚合物胶束CPA‐PM的体外溶出特性
表12用四氢呋喃制备的聚合物胶束TP‐PM的体外溶出特性
实施例2
本实施例用于说明载药聚合物胶束的体外抗肿瘤活性
1、材料
1.1药品和试剂
雷公藤内酯醇(纯度>98％)和环巴胺(纯度>98％)均购于美帝药库医药科技公司。DMEM培养液、胎牛血清、双抗溶液、胰蛋白酶、PBS缓冲液液等均购于美国HyClone公司。
1.2细胞株
小鼠乳腺癌细胞株(4T1)、人乳腺癌细胞株(MDA‐MB‐468，MDA‐MB‐231)、人胰腺癌细胞株(Miapaca‐2，Kras*cells)、人胰腺星状细胞株(HPSC)均购于美国典型培养物保存中心。
2、方法
将购得的各种细胞进行培养、传代、冻存、复苏，将装有细胞的培养瓶放入CO2培养箱中，待细胞完全贴壁后，分种，进行试验。精确制备各种浓度的TP溶液和CPA溶液，以及不同药物浓度的以丙酮为有机相制备的TP/CPA(1:1)‐PM聚合物胶束溶液，备用。
MTS为新型四氮唑蓝盐化合物，其还原产物‐Formazan水溶性高，稳定性强，因此显色更快。活细胞线粒体中含多种脱氢酶，可使MTS还原成有色的甲瓒产物，且还原物颜色的深浅与活细胞数呈正相关，因此可测定吸光度反应细胞活力，而死细胞没有这种功能。用MTS测定细胞活力，以Miapaca‐2细胞为例，具体方法如下：
①培养胰腺癌Miapaca‐2细胞到对数生长期；
②取出96孔细胞培养板，每个孔加含10％小牛血清的DMEM培养液(每0.1ml含1x104个Miapaca‐2个细胞)；
③设立空白组、终浓度为5nM、10nM、20nM、50nM、100nM的游离TP/CPA药物组，终浓度为5nM、10nM、20nM、50nM、100nM的TP/CPA(1:1)‐PM聚合物胶束药物组，每组6复孔。
④将接种后的的细胞培养板放入CO2培养箱中，分别培养24h、48h、72h；
⑤分别在三个时间段取出培养板，每孔中加入20μl PBS与MTS(5mg/ml)的混合液，继续培养2～4h显色；
⑥取出细胞培养板，摇晃10min，使显色均匀，在波长490nm处，使用酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值OD并按下式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(实验孔OD值/空白组OD平均值)*100。
3、结果
采用以丙酮为有机相制备的聚合物胶束进行体外抗肿瘤实验。在不同培养时间对胰腺癌细胞株存活率影响的实验结果见表13～15，与游离混合药物相比，载药聚合物胶束对三种胰腺癌细胞存活均有明显抑制作用，两者有统计学差异。而且在低浓度时聚合物胶束的抑制作用即很明显，抑制肿瘤的作用表现出浓度依赖性和时间依赖性。游离混合药物和载药混合药物对三种乳腺癌细胞株存活率影响的实验结果见表16，4T1‐Cp20为对铂类药物耐药的小鼠乳腺癌细胞株，结果表明游离混合药物对肿瘤细胞的存活无明显影响，而载混合药物的聚合物胶束有明显抑制作用，浓度越大，抑制作用越强，载药聚合物胶束对MDA‐MB‐231和MDA‐MB‐468存活的抑制作用强于游离药物，有统计学差异和浓度依赖性，但对三种乳腺癌细胞的作用的敏感性有差异，对MDA‐MB‐468敏感性高于4T1‐Cp20，而MDA‐MB‐231对游离药物和聚合胶束的敏感性较差。设立了空白聚合物胶束组，用丙酮和用四氢呋喃制备的聚合物胶束对肿瘤细胞的存活率有降低，但与空白组比较无统计学差异。
表13游离药物(TP/CPA)和载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM对Miapace‐2细胞存活率的影响(n＝6)
与TP/CPA比较，*P<0.05，**P<0.01
表14游离药物(TP/CPA)和载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM对Kras*细胞存活率的影响(n＝6)
与TP/CPA比较，*P<0.05，**P<0.01
表15游离药物(TP/CPA)和载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM对HPSC细胞存活率的影响(n＝6)
与TP/CPA比较，*P<0.05，**P<0.01
表16游离药物(TP/CPA)和载药聚合物胶束TP/CPA(1:1)‐PM对乳腺癌细胞株存活率的影响(n＝6)
与TP/CPA比较，*P<0.05，**P<0.01
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有雷公藤内酯醇和环巴胺，其中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。
2.一种抗肿瘤药物制剂，其特征在于，所述抗肿瘤药物制剂为聚合物胶束，其含有聚合物胶束载体和活性组分，所述活性组分为权利要求1所述的药物组合物。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤药物制剂，其中，所述聚合物胶束载体为PEG-PCL和/或PEG-PLA；所述聚合物胶束载体与雷公藤内酯醇的重量比为50-100：1；所述聚合物胶束的平均粒径小于200nm，优选地，所述聚合物胶束的平均粒径为40-60nm。
4.根据权利要求2所述的抗肿瘤药物制剂，其中，所述药物制剂由包括以下步骤的方法制得：将雷公藤内酯醇、环巴胺与聚合物胶束载体制备成聚合物胶束，再加入冷冻剂冷冻保存；所述冷冻剂优选为蔗糖；所述冷冻剂的用量优选为雷公藤内酯醇重量的40-60倍。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物制剂，其中，制备聚合物胶束的有机相为丙酮或四氢呋喃；水相为双蒸水或含0.2-0.8％PEG-MeDMA的双蒸水；有机相和水相的体积比为1：1-3。
6.根据权利要求4或5所述的抗肿瘤药物制剂，其中，所述药物制剂由包括以下步骤的方法制得：
(1)将雷公藤内酯醇和环巴胺溶于无水乙醇中，然后加入丙酮或四氢呋喃混合，再加入PEG-PCL或PEG-PLA，涡旋混合，得到溶液A，其中，雷公藤内酯醇的浓度为0.5-1.5mg/mL，环巴胺的浓度为0.5-7.5mg/mL，PEG-PCL或PEG-PLA的浓度为50-100mg/mL，所述无水乙醇与丙酮或四氢呋喃的体积比为1：5-15；
(2)将PEG-MeDMA溶于水中得到溶液B，其中PEG-MeDMA的浓度为2-8mg/mL；
(3)在溶液A处于快速涡旋的条件下，将溶液B快速加入溶液A中，形成溶液C，其中，溶液A与溶液B的体积比为1：1-3；
(4)将溶液C进行真空旋转蒸发，去除有机溶剂，得到溶液D；
(5)将溶液D进行透析，收集透析袋内的溶液，离心，收集离心后的上清液，向其中加入占上清液8-12％体积的、浓度为40-60％的蔗糖溶液，得到聚合物胶束。
7.雷公藤内酯醇和环巴胺在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞增殖抑制剂中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胰腺星状细胞；优选地，所述乳腺癌细胞为小鼠乳腺癌细胞株4T1、人乳腺癌细胞株MDA-MB-468、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231；所述人胰腺癌细胞为人胰腺癌细胞株Miapaca-2、人胰腺癌细胞株Kras*cells；所述胰腺星状细胞为人胰腺星状细胞株HPSC。
9.雷公藤内酯醇和环巴胺在制备抗肿瘤的联合用药物中的应用，其特征在于，所述药物中，雷公藤内酯醇和环巴胺的重量比为1:1～1:7。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述肿瘤包括乳腺癌和/或胰腺癌。
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