CN108719337A - 一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物，所述枯黄萎病包括枯萎病和/或黄萎病，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分包括尖孢镰刀菌菌体裂解后释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白。本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物可以有效的治疗已患上枯萎病或黄萎病的作物；使得患病作物不再被拔掉而是继续生长、开花结果；提高了作物的产量。
Description
技术领域
本发明涉及农药技术领域，具体涉及一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物及其生产方法。
背景技术
枯萎病和黄萎病，也称为枯黄萎病，是危害小麦、棉花、花生、芝麻、豆类、瓜果类、蔬菜类等粮食作物和经济作物的常见病害；轻者减产，重者绝收。
枯黄萎病的传播力强；患病作物所在地块、患病作物的茎秆、患病作物的果实、患病作物的断根，甚至带菌的肥料、水流、农业工具都可以成为传染源，且枯黄萎病的致病菌存活期上、适应性强、抗逆性强。因此，在当前的作物种植条件下，枯黄萎病的发病面积呈逐年上升趋势。
枯黄萎病的危害不但遍及中国，而且遍及美、亚、非、欧、澳五大洲，是世界性的农作物病害。
对于枯黄萎病，目前尚无有效的治疗手段，因此，枯黄萎病被称为“植物癌症”或“农作物癌症”。
世界范围内防治枯黄萎病的主要措施如下。
实现植物检疫制度，严禁由病区调入带菌的种子；
建立无病留种田和保种基地，生产无病种子；
种子消毒处理；
药液处理病土；
轮作倒茬；
及时清除病残组织，烧毁或深埋；
科学管理，氮磷钾合理配比，开沟排水，降低地下水位，深翻土地，改善作物生态条件；
抗病品种选育；
利用常规消毒药品，例如，高锰酸钾、链霉素等复配。
目前现有技术中的防治枯黄萎病的药物有：黄腐酸盐、枯黄灵丹、萎必克、枯黄草、多菌灵等，这些药物在预防枯黄萎病上有一定效果，但是对于已经患枯黄萎病的作用没有有效的治疗效果，更不能治愈。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物及其生产方法，用于治疗患有枯黄萎病的农作物。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物，所述枯黄萎病包括枯萎病和/或黄萎病，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分包括尖孢镰刀菌菌体裂解后释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白。
在一种可能的实现方式中，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分为尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵后裂解菌体释放的活性蛋白。
在一种可能的实现方式中，所述混合发酵为联合发酵；其中，所述联合发酵的培养基的制备过程为：取100.0g洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液中加入20.0g葡萄糖、2.0g酵母粉、1.0g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁，搅拌，补足水分到1000ml，115℃高压灭菌20分钟。
在一种可能的实现方式中，所述联合发酵包括一级发酵、二级发酵、三级发酵；
其中，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分包括：
将进行菌体破壁后的三级发酵液送入板框压滤机进行压滤，滤掉菌体；使用真菌组蛋白提取试剂盒提取得到的尖孢镰刀菌的活性蛋白、黑白轮枝菌的活性蛋白和大丽轮枝菌的活性蛋白的蛋白混合物；其中，尖孢镰刀菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的蛋白，黑白轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的蛋白，大丽轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:3所示的蛋白。
本发明第二方面提供了一种第一方面所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物的生产方法，包括如下步骤：同时裂解尖孢镰刀菌菌体、黑白轮枝菌菌体和大丽轮枝菌菌体；同时收集尖孢镰刀菌菌体裂解释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白，制备所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物；其中，所述植物为农作物；所述农作物包括棉花。
在一种可能的实现方式中，在所述同时裂解尖孢镰刀菌菌体、黑白轮枝菌菌体和大丽轮枝菌菌体的步骤之前，所述生产方法还包括；混合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌；在所述裂解尖孢镰刀菌菌体、黑白轮枝菌菌体和大丽轮枝菌菌体的步骤包括：裂解尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵得到的发酵液中的菌体。
在一种可能的实现方式中，所述混合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌为联合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌。
在一种可能的实现方式中，所述联合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的步骤包括如下子步骤：
菌种活化：在平板上划线接种尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽花轮枝孢；28℃培养4-5天，进行菌种活化；其中，平板的制备过程为：
121℃高压灭菌15分钟，然后分装至培养皿中，得到平板；
摇瓶震荡培养：将活化后的尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌同时接种到摇瓶中，摇瓶中具有液体培养基；在28℃温度下震荡培养48小时，得到发酵菌种；其中，液体培养基的制备过程为：
取100.0g洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液中加入20.0g葡萄糖、2.0g酵母粉、1.0g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁，搅拌，补足水分到1000ml，115℃高压灭菌20分钟，然后分装至摇瓶中；
一级发酵培养：将发酵菌种按照5％的接种量接种到第一发酵罐中，第一发酵罐具有液体培养基；通风量为1:0.5、搅拌速度为220转/分，28℃发酵24-36小时；
二级发酵培养：将一级发酵培养产物按照7.5-8％的接种量接种到第二发酵罐，第二发酵罐具有液体培养基；通风量为1:0.4，搅拌速度为200转/分，28℃发酵28-32小时；
三级发酵培养：将二级发酵培养产物按照8-10％的接种量接种到第三发酵罐，第三发酵罐具有液体培养基；通风量为1:0.3，搅拌速度为160转/分，28℃发酵48-50小时；
终止发酵：在第三发酵罐中加入甲酸，调pH值至5.0，加热至80℃，以终止发酵，得到三级发酵液；
所述同时裂解尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵得到的发酵液中的菌体的步骤包括如下子步骤：
细胞破壁：采用高压匀浆法对三级发酵液中的菌体进行细胞破壁，以释放活性蛋白；
所述同时收集尖孢镰刀菌菌体裂解释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白，制备所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的子步骤包括如下子步骤：
蛋白提取：将进行菌体破壁后的三级发酵液送入板框压滤机进行压滤，滤掉菌体；使用真菌组蛋白提取试剂盒提取蛋白，得到尖孢镰刀菌的活性蛋白、黑白轮枝菌的活性蛋白和大丽轮枝菌的活性蛋白的蛋白混合物；其中，尖孢镰刀菌的活性蛋白包括如SEQ IDNO:1所示的蛋白，黑白轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的蛋白，大丽轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:3所示的蛋白；
药物成形：向蛋白混合物中加入助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。
在一种可能的实现方式中，所述加入助剂，得到所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的步骤包括：加入蛋白混合物九倍重量份的助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。
本发明第三方面提供了第一方面所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物在制备用于治疗黄萎病或枯萎病的药物中的用途。
本发明具有如下优点：
本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物可以有效的治疗已患上枯萎病或黄萎病的作物；使得患病作物不再被拔掉而是继续生长、开花结果；提高了作物的产量；本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物制备过程简单、成本较低，利于工业化生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
植物枯萎病的病原为尖孢镰刀菌(Fusarium spp.)，属半知菌亚门真菌。植物黄萎病病原菌主要为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)和黑白轮枝菌(Verticilliumalboatrum)，大丽轮枝菌和黑白轮枝菌属于半知菌亚门真菌。
需要说明的是，在本发明实施例中，枯黄萎病是对枯萎病和黄萎病的统称，如无特别说明，枯黄萎病可以指枯萎病，也可以指黄萎病，也可以同时指枯萎病和黄萎病。
实施例1
在本实施例中介绍尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌混合培养。
尖孢镰刀菌的菌种购自美国ATCC，货号为1100183。黑白轮枝菌的菌种购自北京北纳创联生物技术研究院，货号为NKCCMRNK3.00088。大丽轮枝菌的菌种为购自上海邦景实业有限公司的大丽花轮枝孢，货号为BJ-0262。
尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵过程具体如下。
菌种活化：在平板上划线接种尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽花轮枝孢；28℃培养4-5天，进行菌种活化；其中，平板的制备过程为：
121℃高压灭菌15分钟，然后分装至培养皿中，得到平板；
摇瓶震荡培养：将活化后的尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌同时接种到摇瓶中，摇瓶中具有液体培养基；在28℃温度下震荡培养48小时，待菌丝生长舒展无杂菌时，作为发酵菌种；其中，液体培养基的制备过程为：取100.0g洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入20.0g葡萄糖、2.0g酵母粉、1.0g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁，搅拌使它们溶解，补足水分到1000ml，115℃高压灭菌20分钟，然后分装至摇瓶中。
一级发酵培养：将发酵菌种按照5％的接种量接种到第一发酵罐中，第一发酵罐具有步骤12中的液体培养基；通风量为1:0.5、搅拌速度为220转/分，28℃发酵24-36小时，待菌丝生长舒展无杂菌时，转入二级发酵。
二级发酵培养：将一级发酵培养产物按照7.5-8％的接种量接种到第二发酵罐，第二发酵罐具有步骤12中的液体培养基；通风量为1:0.4，搅拌速度为200转/分，28℃发酵28-32小时，待菌丝生长舒展无杂菌时，转入三级发酵。
三级发酵培养：将二级发酵培养产物按照8-10％的接种量接种到第三发酵罐，第三发酵罐具有步骤12液体培养基；通风量为1:0.3，搅拌速度为160转/分，28℃发酵48-50小时。
终止发酵：在第三发酵罐中加入甲酸，调pH值至5.0，加热至80℃，以终止发酵，得到三级发酵液。
接下来介绍裂解尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵得到的发酵液中的菌体。包括如下子步骤：
细胞破壁：采用高压匀浆法对三级发酵液中的菌体进行细胞破壁，以释放活性蛋白。具体为，使用高压匀浆器进行细胞破壁，其中，压力设置为70MPa。
接下来介绍收集尖孢镰刀菌菌体裂解释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白，制备所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。包括如下子步骤：
蛋白提取：将进行菌体破壁后的三级发酵液送入板框压滤机进行压滤，滤掉菌体；使用真菌组蛋白提取试剂盒提取(购自BestBio贝博生物，货号BB-31174蛋白，得到尖孢镰刀菌的活性蛋白、黑白轮枝菌的活性蛋白和大丽轮枝菌的活性蛋白的蛋白混合物；其中，尖孢镰刀菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的蛋白，黑白轮枝菌的活性蛋白包括如SEQID NO:2所示的蛋白，大丽轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:3所示的蛋白。
具体可以对得到的蛋白混合物进行测序，测序结果提交到NCBI的Protein数据库中比对，得到上述结果。
药物成形：向蛋白混合物中加入助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。在一个示例中，加入上述蛋白混合物的九倍重量份的助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。在一个示例中，助剂包括赋形剂，制备的药物的为颗粒状。
接下来利用温室盆栽对本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物的药效进行说明。
棉花枯黄萎病的防治试验：采用植株喷洒法进行，盆栽棉花，棉花出苗后每盆留苗3棵，待棉花长出3-4片真叶时开始接种病原菌。接种时，每盆喷洒浓度为1×107个孢子/mL的悬浮液30mL。25℃，相对湿度90％以上条件下培养。待病情稳定后，将本实施例制备的治愈植物癌症枯黄萎病的药物按照重量比为1:1000配制使用药液；每盆喷洒用30mL使用药液作为实验组。以多菌灵(购自山东东信生物农药有限公司)10mg﹒mL-1(每盆30mL)作为对照药剂，以施用清水作空白对照，每处理10盆，实验重复3次。每隔3d给药一次，共给药5次，在最后一次给药后的第7d和14d分别调查棉苗生长和发病情况。按以下标准计算病情指数和治疗效果。
枯萎病分级方法：
0级:健株；
1级:病株叶片有10％以下表现典型症状；
3级:病株叶片有11％-25％表现典型症状；
5级:病株叶片有26％-50％显病状，株型矮化；
7级:病株叶片有51％-90％显病状，株型明显矮化；
9级：病株叶片几乎全部显病状，甚至枯焦脱落，枝茎枯死，有时整株出现急性凋萎死亡。
黄萎病分级方法：
0级:健株；
1级:病株叶片有10％以下显病状，叶片表现淡黄色不规则病斑；
3级:病株叶片有11％-25％显病状，叶片主脉间产生淡黄色不规则病斑；
5级:病株叶片有26％-50％显病状，病斑的颜色大部分变成黄色和黄褐色，叶片边缘有卷枯；
7级:病株叶片有51％以上显病状，病斑大多数显黄褐色，叶片边缘卷枯，有少数叶片凋落；
9级:病株叶片脱落成光杆及植株死亡，有时出现急性萎蔫死亡症状。
药效计算方法：
病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/研究总叶数/最高级数值×100
治疗效果(％)＝(空白对照平均病情指数-实验组平均病情指数)/空白对照平均病情指数×100。
温室盆栽实验结果见表1所示。
表1
| 实验组 | 多菌灵组 | |
| 黄萎病 | 96.2％ | 26.7％ |
| 枯萎病 | 95.3％ | 23.8％ |
从表1中可知，对于黄萎病，实验组的治疗效果为96.2％，多菌灵的治疗效果为26.7％。对于枯萎病，实验组的治疗效果为95.3％，多菌灵的治疗效果为23.8％。
接下来在农田实验中对本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物的药效进行说明。
在河南省郑州市郊区选择常年发生黄萎病和枯萎病较重的地块。试验分3个处理,具体处理为：(1)本实施例提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物组，(2)多菌灵组，(3)清水对照组。重复3次,小区面积为50m2,随机区组排列，调查时间为蕾铃期和吐絮期。播种时间为2017年3月30日,棉花品种为新陆中36,土壤为沙壤土,肥力中等,灌溉条件较好。当棉花长至5～6片真叶时，分别对棉苗进行病原真菌灌根处理一次。待病情开始显现时每隔7d施药一次，共施药三次，最后一次施药后的第15d和30d分别调查棉株生长和发病情况。施药方法和调查与计算方法同温室盆栽试验。
农田实验结果见表2所示。
表2
| 药物组 | 多菌灵组 | |
| 黄萎病 | 91.5％ | 14.7％ |
| 枯萎病 | 92.6％ | 13.8％ |
从表2中可知，对于黄萎病，本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物组的治疗效果为91.5％，多菌灵的治疗效果为14.7％。对于枯萎病，实验组的治疗效果为92.6％，多菌灵的治疗效果为13.8％。
本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物可以有效的治疗已患上枯萎病或黄萎病的作物；使得患病作物不再被拔掉而是继续生长、开花结果；提高了作物的产量；本发明提供的治愈植物癌症枯黄萎病的药物制备过程简单、成本较低，利于工业化生产。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 崔明华
<120> 一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物及其生产方法
<130> GG18170574A
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> Fusarium spp
<400> 1
Met Ser Leu His Thr Leu Gln Asn Gly Gln Gln Asp Pro Val Leu Ser
1 5 10 15
Ser Asn Ala Ser Lys Ala Leu Cys Glu Gln Val Ser Arg Ser Leu Gly
20 25 30
Leu Gly Gln Asp Lys Ile Glu Asn Ile Phe Pro Gly Thr Pro Phe Gln
35 40 45
Arg Asp Val Ile Asp Cys Ala Ala Asp Asn Lys Gln Arg Ala Val Gly
50 55 60
His Ala Val Phe Glu Ile Pro Lys Asp Ile Asp Ala Ala Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ala Ala Trp Lys Glu Thr Val Leu His Thr Pro Ala Leu Arg Thr Cys
85 90 95
Thr Phe Thr Ser Lys Ser Gly Asp Val Phe Gln Val Val Leu Arg Asp
100 105 110
Ser Phe Val Phe Ser Trp Met Ser Gly Pro Ser Val Asp Leu Lys Glu
115 120 125
Ala Val Val His Asp Glu Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Pro Arg Cys
130 135 140
Asn Arg Phe Val Leu Leu Glu Asp Pro Asp Thr Lys Glu Arg Gln Leu
145 150 155 160
Ile Trp Thr Phe Ser His Ala Leu Val Asp Ser Thr Phe Gln Glu Arg
165 170 175
Ile Leu Arg Arg Val Leu Lys Ala Tyr Lys Asp Ala Asn Asp Glu His
180 185 190
Pro Arg Gln Leu Glu Thr Pro Asp Ser Ser Gln Ala Thr Pro Glu Glu
195 200 205
Asp Leu Gln Pro Asn Pro Ser Lys Met Leu Lys Ile Pro Gln Ala Ala
210 215 220
Asp Met Glu Arg Ala Val Glu Phe Trp Lys Glu His Leu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Asn Ala Ser Ala Phe Pro His Leu Ser Ser His Leu Ser Met Pro His
245 250 255
Pro Asp Ala Lys Ala Glu His Lys Ile Ser Tyr Ser Ser Ser Ala Gln
260 265 270
Gln Lys Ile Ser Ser Thr Thr Ile Cys Arg Thr Ala Leu Ala Ile Leu
275 280 285
Leu Ser Arg Tyr Thr His Ser Pro Glu Ala Leu Phe Gly Val Val Thr
290 295 300
Glu Gln Thr Pro Met Leu Glu Glu Gln Leu Met Leu Asp Gly Pro Thr
305 310 315 320
Arg Thr Val Val Pro Ile Arg Val Ala Cys Ser Ser Asp Gln Ser Val
325 330 335
Ser Asp Val Met Glu Arg Ile Asp Ser Tyr Asp Gln Thr Met Arg Gln
340 345 350
Phe Ala His Ala Gly Leu Arg Asn Ile Ala Ser Thr Gly Asp Asp Gly
355 360 365
Ser Ala Ala Cys Gly Phe Gln Thr Val Leu Leu Ser Gln Met Glu Lys
370 375 380
Pro Ser Gln Leu Leu Leu Gly Asp Ser Val
385 390
<210> 2
<211> 368
<212> PRT
<213> Verticillium dahliae Kleb
<400> 2
Met Leu Thr Asn Val Ile Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ser Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Asn Pro Leu Pro Ala Lys Phe Glu Val Ile Glu Ala Arg Ala
20 25 30
Thr Ala Cys Thr Phe Thr Asn Thr Ala Asp Leu Ala Lys Ser Lys Lys
35 40 45
Thr Cys Asp Ser Ile Thr Leu Asn Asn Ile Pro Ala Gly Thr Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Ser Ser His Lys Ser Gly Ala His Val Val Phe Gln Gly Lys
65 70 75 80
Thr Thr Phe Gly Tyr Lys Glu Trp Glu Gly Pro Leu Ile Gln Ile Ser
85 90 95
Gly Glu Lys Ile Thr Val Glu Gly Ala Ser Gly His Ile Ile Asp Ala
100 105 110
Asp Gly Ala Arg Trp Trp Asp Gly Gln Gly Gly Asn Gly Gly Lys Thr
115 120 125
Lys Pro Lys Leu Leu Ala Val Lys Gly Leu Asn Asn Ser Ile Val Lys
130 135 140
Gly Leu Asn Phe Lys Asp Gln Pro Val His Gly Ile Ser Val Asn Thr
145 150 155 160
Val Asn Asn Leu Gln Leu Ile Asp Val Thr Leu Asp Ala Ser Ala Gly
165 170 175
Asp Ser Lys Gly Gly His Asn Thr Asp Gly Phe Asp Val Gly Asn Ala
180 185 190
Gln Asn Ile Leu Ile Ser Gly Ala Ile Val Lys Asn Gln Asp Asp Cys
195 200 205
Leu Ala Ile Asn Ser Gly Thr Asn Ile Thr Phe Thr Gly Gly Asn Cys
210 215 220
Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Asn Arg Ser Asn
225 230 235 240
Asn Val Val Lys Thr Ile Arg Ile Asn Asn Ser Lys Ile Ser Asn Ser
245 250 255
Asp Asn Gly Val Arg Ile Lys Thr Ile Ser Gly Ala Thr Gly Ser Val
260 265 270
Ser Asp Val Ile Tyr Asp Thr Ile Thr Leu Ser Asn Ile Ala Lys Asn
275 280 285
Gly Ile Val Ile Glu Gln Asp Tyr Glu Asn Gly Ser Pro Thr Gly Thr
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Ala Cys Ser Asn Trp Lys Trp Ser Gly Val Asn Val Thr Gly Gly
340 345 350
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<210> 3
<211> 415
<212> PRT
<213> Verticillium alboatrum
<400> 3
Met Arg Glu Ile Val His Leu Gln Thr Gly Gln Cys Gly Asn Gln Ile
1 5 10 15
Gly Ala Ala Phe Trp Gln Asn Ile Ser Gly Glu His Gly Leu Asp Ser
20 25 30
Asn Gly Val Tyr Asn Gly Thr Ser Glu Leu Gln Leu Glu Arg Met Asn
35 40 45
Val Tyr Phe Asn Glu Ala Ser Gly Asn Lys Tyr Val Pro Arg Ala Val
50 55 60
Leu Val Asp Leu Glu Pro Gly Thr Met Asp Ala Val Arg Ala Gly Pro
65 70 75 80
Phe Gly Gln Leu Phe Arg Pro Asp Asn Phe Val Phe Gly Gln Ser Gly
85 90 95
Ala Gly Asn Asn Trp Ala Lys Gly His Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu
100 105 110
Val Asp Gln Val Leu Asp Val Val Arg Arg Glu Ala Glu Gly Cys Asp
115 120 125
Cys Leu Gln Gly Phe Gln Ile Thr His Ser Leu Gly Gly Gly Thr Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Asp Arg Met Met Ala Thr Phe Ser Val Val Pro Ser Pro Lys Val Ser
165 170 175
Asp Thr Val Val Glu Pro Tyr Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gln Leu
180 185 190
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195 200 205
Asp Ile Cys Ile Arg Thr Leu Lys Leu Ser Asn Pro Ser Tyr Gly Asp
210 215 220
Leu Asn His Leu Val Ser Ala Val Met Ser Gly Val Ser Thr Ser Leu
225 230 235 240
Arg Phe Pro Gly Gln Leu Asn Ser Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val Asn
245 250 255
Met Val Pro Phe Pro Arg Leu His Phe Phe Met Val Gly Phe Ala Pro
260 265 270
Leu Thr Ser Arg Gly Ser His Ser Phe Arg Ala Val Ser Val Pro Glu
275 280 285
Leu Thr Gln Gln Met Phe Asp Pro Lys Asn Met Met Ala Ala Ser Asp
290 295 300
Phe Arg Asn Gly Arg Tyr Leu Thr Cys Ser Ala Ile Phe Arg Gly Lys
305 310 315 320
Val Ala Met Lys Glu Val Glu Asp Gln Met Arg Asn Val Gln Ser Lys
325 330 335
Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile Pro Asn Asn Val Gln Thr Ala
340 345 350
Leu Cys Ser Ile Pro Pro Arg Gly Leu Lys Met Ser Ser Thr Phe Val
355 360 365
Gly Asn Ser Thr Ala Ile Gln Glu Leu Phe Lys Arg Ile Gly Glu Gln
370 375 380
Phe Thr Ala Met Phe Arg Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly
385 390 395 400
Glu Gly Met Asp Glu Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met
405 410 415
Claims (10)
1.一种治愈植物癌症枯黄萎病的药物，所述枯黄萎病包括枯萎病和/或黄萎病，其特征在于，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分包括尖孢镰刀菌菌体裂解后释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白。
2.根据权利要求1所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物，其特征在于，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分为尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵后裂解菌体释放的活性蛋白。
3.根据权利要求2所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物，其特征在于，所述混合发酵为联合发酵；其中，所述联合发酵的培养基的制备过程为：取100.0g洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液中加入20.0g葡萄糖、2.0g酵母粉、1.0g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁，搅拌，补足水分到1000ml，115℃高压灭菌20分钟。
4.根据权利要求3所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物，其特征在于，所述联合发酵包括一级发酵、二级发酵、三级发酵；
其中，所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的有效成分包括：
将进行菌体破壁后的三级发酵液送入板框压滤机进行压滤，滤掉菌体；使用真菌组蛋白提取试剂盒提取得到的尖孢镰刀菌的活性蛋白、黑白轮枝菌的活性蛋白和大丽轮枝菌的活性蛋白的蛋白混合物；其中，尖孢镰刀菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的蛋白，黑白轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的蛋白，大丽轮枝菌的活性蛋白包括如SEQID NO:3所示的蛋白。
5.一种权利要求1-4任一项所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
同时裂解尖孢镰刀菌菌体、黑白轮枝菌菌体和大丽轮枝菌菌体；
同时收集尖孢镰刀菌菌体裂解释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白，制备所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，在所述同时裂解尖孢镰刀菌菌体、黑白轮枝菌菌体和大丽轮枝菌菌体的步骤之前，所述生产方法还包括；
混合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌；
在所述裂解尖孢镰刀菌菌体、黑白轮枝菌菌体和大丽轮枝菌菌体的步骤包括：
裂解尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵得到的发酵液中的菌体。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述混合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌为联合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述联合发酵尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的步骤包括如下子步骤：
菌种活化：在平板上划线接种尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽花轮枝孢；28℃培养4-5天，进行菌种活化；其中，平板的制备过程为：
121℃高压灭菌15分钟，然后分装至培养皿中，得到平板；
摇瓶震荡培养：将活化后的尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌同时接种到摇瓶中，摇瓶中具有液体培养基；在28℃温度下震荡培养48小时，得到发酵菌种；其中，液体培养基的制备过程为：取100.0g洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液中加入20.0g葡萄糖、2.0g酵母粉、1.0g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁，搅拌，补足水分到1000ml，115℃高压灭菌20分钟，然后分装至摇瓶中；
一级发酵培养：将发酵菌种按照5％的接种量接种到第一发酵罐中，第一发酵罐具有液体培养基；通风量为1:0.5、搅拌速度为220转/分，28℃发酵24-36小时；
二级发酵培养：将一级发酵培养产物按照7.5-8％的接种量接种到第二发酵罐，第二发酵罐具有液体培养基；通风量为1:0.4，搅拌速度为200转/分，28℃发酵28-32小时；
三级发酵培养：将二级发酵培养产物按照8-10％的接种量接种到第三发酵罐，第三发酵罐具有液体培养基；通风量为1:0.3，搅拌速度为160转/分，28℃发酵48-50小时；
终止发酵：在第三发酵罐中加入甲酸，调pH值至5.0，加热至80℃，以终止发酵，得到三级发酵液；
所述同时裂解尖孢镰刀菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌混合发酵得到的发酵液中的菌体的步骤包括如下子步骤：
细胞破壁：采用高压匀浆法对三级发酵液中的菌体进行细胞破壁，以释放活性蛋白；
所述同时收集尖孢镰刀菌菌体裂解释放的活性蛋白、黑白轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白和大丽轮枝菌菌体裂解后释放的活性蛋白，制备所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的步骤包括如下子步骤：
蛋白提取：将进行菌体破壁后的三级发酵液送入板框压滤机进行压滤，滤掉菌体；使用真菌组蛋白提取试剂盒提取蛋白，得到尖孢镰刀菌的活性蛋白、黑白轮枝菌的活性蛋白和大丽轮枝菌的活性蛋白的蛋白混合物；其中，尖孢镰刀菌的活性蛋白包括如SEQ IDNO:1所示的蛋白，黑白轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的蛋白，大丽轮枝菌的活性蛋白包括如SEQ ID NO:3所示的蛋白；
药物成形：向蛋白混合物中加入助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述加入助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物的步骤包括：加入蛋白混合物的九倍重量份的助剂，制成所述治愈植物癌症枯黄萎病的药物。
10.权利要求1-4任一项所述的治愈植物癌症枯黄萎病的药物在制备用于治疗黄萎病或枯萎病的药物中的用途。
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| CN115413678A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-02 | 中捷四方生物科技股份有限公司 | 一种含大丽轮枝孢激活蛋白的可湿性粉剂和应用 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN102558320A (zh) * | 2010-12-17 | 2012-07-11 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 大丽轮枝菌分离的蛋白质多核苷酸及其应用 |
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