CN108713022A - 免疫刺激佐剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以下式的免疫刺激化合物，其组合，包括其的药物或营养制剂，及其用于调节T辅助细胞(Th)和T调节细胞(Treg)介导的免疫应答的用途。

Description

免疫刺激佐剂及其用途
技术领域
本发明涉及免疫刺激化合物，及其用于调节T辅助细胞(Th)和T调节细胞(Treg)介导的免疫应答的用途。
背景技术
免疫应答通过通常所说的辅助T细胞来调节，基于其分泌的细胞因子，辅助T细胞可以进一步细分成Th1、Th2和调节Treg细胞。Th1细胞产生例如干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)，激活巨噬细胞杀灭通过吞噬作用吸收的微生物。此外，Th1细胞激活细胞毒性T细胞来杀灭受感染的细胞。Th2细胞的不同在于产生白细胞介素(IL)4、5和13，由于它们激活某些免疫细胞(即，嗜碱细胞、肥大细胞和嗜曙红细胞)的能力，这些白细胞介素对于过敏性炎症是重要的。Th1和Th2细胞分泌的细胞因子抑制互补表型的作用。此外，Treg细胞通过分泌抑制Th1和Th2应答的IL-10起到维持免疫系统平衡的作用。
Th2细胞分泌的IL-4引起B细胞分化成浆细胞，其产生抗体，但这些浆细胞产生免疫球蛋白E(IgE)，其刺激嗜碱细胞和肥大细胞来分泌局部介质，如组胺和血清素，这引起过多的粘液分泌以及咳嗽、打喷嚏和腹泻，来除去检测的抗原。另一方面，IL-5激活嗜曙红细胞，其产生在过敏原暴露部位引起炎症反应的细胞因子和趋化因子。
过敏是一种超敏性失调，之前称为I型超敏，其中免疫系统对正常无害的物质过度反应。在健康受试者中，过敏原暴露引起由Treg和Th1细胞支配的T细胞应答，这引起IgG4的分泌，其以无害的方式从体内除去过敏原。然而，在患有过敏症的患者中，所述应答由Th2细胞强烈支配，这导致上述的炎症反应。
可以用重复注射递增含量的特异性抗原来治疗过敏患者。这种类型的特异性免疫治疗(SIT)用于将Th2-型炎症反应朝向保护性Th1和Treg应答的正常化。SIT是目前治疗与过敏相关的基础病理免疫应答的唯一途径。其是给予长效保护的有效方法，但治疗花费3-5年并且注射的大量过敏原可以引起过敏反应，并且在严重的情况中，甚至过敏休克(anaphylaxis)。然而，可以通过使用特定类型的改变免疫应答、其持续时间以及提高正确类型的抗体的产生的佐剂来优化这种治疗。
用于疫苗中的一种常见佐剂是明矾(氢氧化铝)，其不幸地促进Th2-型应答，这引起不理想的IgE产生。然而，存在几种有前景的候选物，如寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，其已经在许多I-II期临床研究中显示出具有前景的结果，以及单磷酰基脂质A(MPL)，其已经被批准用于人使用并且已经显示出使用明显降低量的注射给予对抗过敏反应的保护。然而，这些化合物的治疗使用不是没有问题。CpG-ODN是基因，并且，除了大规模合成是昂贵的以外，还涉及与公众舆论相关的潜在问题(如基因操纵的食品)。对于MPL佐剂，不是简单的化学实体，而是脂肪酸链的数量和长度不同的类似物的混合物。
天然β-(1→2)-连接的甘露糖苷的免疫刺激性质已经知道很长时间了。它们在很多情况中已经显示出刺激对抗白色假丝酵母(Candida albicans)的抗体的产生，白色假丝酵母是可以引起免疫受损人员严重血流感染的机会真菌。然而，大多数人携带白色假丝酵母，因此实际上被认为是正常的人肠道菌群的一部分。
认为这种类别的化合物的生物活性至少部分是由于其独特的三维溶液结构引起的。在溶液中，它们采用扭曲的α-螺旋构象，每个旋转具有3-4个糖单体。由于空间碰撞导致独特构象，这种类别的化合物实际上是非常罕见的，但可以在假丝酵母种类(主要是白色假丝酵母)的几种真菌的细胞表面上找到。
国际专利申请WO2006/096970描述了包括多个包含β-D-吡喃甘露糖基-(1→2)-β-D-吡喃甘露糖的寡糖的免疫缀合物，其中每个所述的寡糖经由连接基连接至蛋白质载体。缀合物在疫苗的制备中是有用的，所述疫苗引发对抗假丝酵母种类(特别是白色假丝酵母)的免疫应答，即，引起获得性免疫。
国际专利申请WO2007/010084公开了包含β-(1→2)-连接的链和β-(1→2)-D-寡甘露糖苷的免疫刺激甘露聚糖多糖，及其用于调节Th-介导的免疫应答的用途。然而，与天然粗制的寡糖混合物相比，合成的由多达四个单糖单体组成的β-(1→2)-连接的寡糖链的活性差。因此，需要这些合成的寡糖链的新的修饰。
国际专利申请WO 2012/175813公开了用作Th和Treg介导的免疫应答的调节剂的β-(1→2)寡甘露糖苷。
本领域对于提供免疫刺激特性以及使得相应的药物和/或营养制剂易于配制的良好水溶性的更多免疫刺激化合物存在着需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于调节T辅助细胞(Th)和T调节细胞(Treg)介导的免疫应答的免疫刺激化合物和组合物。
令人惊讶地发现了式(I)的免疫刺激化合物提供了上述Th介导的免疫应答的调节，并且因此可以用于受试者的I型特应性过敏、传染病和癌症的预防或治疗
其中每个n是0至2。
本发明的化合物带有1)完全乙酰化的三价β-(1→2)甘露二糖单体，其2)通过α-键连接至中心核，经由3)基于乙二醇的连接基，将甘露二糖连接至三唑基团。
因此，在一个方面中，本发明提供式(I)的化合物，及其任意组合，以及包括所述化合物的组合物，用于调节Th和Treg细胞介导的免疫应答。
在另一个方面中，本发明提供了式(I)的免疫刺激化合物，用作药物。在再另一个方面中，本发明提供了用作用于治疗哺乳动物(包括人)的药物的免疫刺激化合物，所述哺乳动物患有或易于患有可以通过诱导Treg-和/或Th1-型和/或抑制Th2-型免疫应答来预防或治疗的病症。
Treg-和/或Th1-型免疫应答由T细胞中IFN-γ产生的诱导和/或Th2-型T细胞、肥大细胞、嗜曙红粒细胞和/或嗜碱粒细胞的功能的抑制或遏制来诱导。Th2-型免疫应答通过T细胞中的IL-10产生的诱导和/或Th2-型T细胞、肥大细胞、嗜曙红粒细胞和/或嗜碱粒细胞的功能的抑制或遏制来抑制。Th2-型免疫应答的抑制还基于过敏原诱导的IL-4和/或IL-5产生的遏制。
本发明还提供了根据本发明的免疫刺激化合物，用于I型速发型(即刻)特应性过敏的治疗中。在优选实施方案中，I型速发型特应性过敏选自特应性湿疹/皮炎综合征(AEDS)、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性荨麻疹、食物过敏、毒液过敏和过敏性鼻结膜炎(rhinoconjunctvitis)。在更多实施方案中，本发明提供了本发明的免疫刺激化合物，用于传染病或癌症的治疗中。
本发明的再一个方面提供了式(I)的免疫刺激化合物，用作疫苗的佐剂。
本发明还涉及免疫刺激组合物，其包括一种或多种式(I)的免疫刺激化合物和药物学上可接受的载体。
在再一个方面中，本发明提供了式(I)的免疫刺激化合物，用作食品添加剂。
本发明还提供了一种用于诱导Treg-和/或Th1-型免疫应答的方法，包括将有效量的本发明的组合物施用于受试者，以诱导Treg-和/或Th1-型免疫应答，以及用于抑制Th2-型免疫应答的方法，包括将有效量的本发明的组合物或本发明的食物施用于受试者，以部分或完全抑制Th2-型免疫应答的发展。
从以下附图、详述、实施例和所附权利要求书，本发明的其它目的、方面、细节、优势和特定实施方案将更加清楚。
附图说明
在下文中，将参照附图，通过优选实施方案，更详细地描述本发明，其中
图1说明了使用和未用化合物1、2、3、MPL和CpG-ODN，用Bet v刺激的PBMC的IL-4应答。
图2说明了使用和未用化合物1、2、3、MPL和CpG-ODN，用Bet v刺激的PBMC的TNF应答。
图3证明了化合物3在小鼠的黑素瘤肿瘤生长抑制中的功效。
图4显示了参照化合物1的ROESY谱。
图5说明了参照化合物1的最多(populated)的构象。
图6显示了参照化合物2的ROESY谱。
图7说明了参照化合物2的最多的构象。
图8说明了化合物3的ROESY谱，具有最重要的关联。
图9说明了化合物3的最多的构象。
发明详述
本发明提供了合成的免疫刺激的式(I)的完全乙酰化的三价β-(1→2)甘露寡糖，以及包含其的组合物，及其用于调节辅助T细胞(Th)-介导的免疫应答的用途，以及在制备用于预防或治疗受试者的I型特应性过敏、传染病或癌症的药品、或药物或营养制剂中的用途。
过敏性炎症的特征在于IgE抗体产生、肥大细胞脱粒和嗜曙红细胞炎症。这些应答是通过分泌细胞因子(如IL-4和IL-5)的过敏原特异性Th2-型免疫细胞介导的。对于其他类型的辅助T细胞，即，Th1-型免疫细胞，分泌细胞因子，如IFN-γ，并且涉及过敏原诱导的Th2-型免疫应答的遏制。此外，调节细胞因子IL-10在Th2-型免疫应答的下调中是重要的。
式(I)的化合物能够调节上述Th介导的免疫应答。所述调节至少可以通过人白血球中的IL-4产生的遏制来发生，如以下实施例中证明的。由于这种活性，式(I)的化合物是Th2-介导的免疫应答的有效抑制剂，并且因此，是用于预防或治疗受试者的I型特异性过敏、传染病和癌症的有效佐剂。
式(I)的化合物带有1)完全乙酰化的三价β-(1→2)甘露二糖单体，其2)通过α-键连接至中心核，经由3)基于乙二醇的连接基，将甘露二糖连接至三唑基团。式(I)的化合物的合成优选基于使用点击化学反应方案。式(I)的化合物的单体的组合的特定选择提供了充足的水溶性。
如果需要，式(I)的化合物可以用于本发明的任何方面或实施方案中的任意组合中。如本文中使用的，术语单数或复数形式的“本发明化合物”及其任何等同物，是可互换的，并且可以指式(I)的一种或多种化合物和/或式(II)的化合物，与术语是单数或复数形式无关。
优选，本发明的化合物带有基于三乙二醇的连接基(即，n是1)，并且因此是根据式(II)的化合物、或其药物学上可接受的盐
式(II)的化合物可以命名为(1,2,3-三(1-{2-[2-(2-[O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→2)-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡吡喃糖基氧]-乙氧基)-乙氧基]乙基}-4-甲氧基-1,2,3-三唑基)丙烷)。在实验部分，将这个化合物称为化合物3。
尽管与之前已知的WO 2012/175813中公开的β-(1→2)寡甘露糖苷相比，长的连接基单位允许三维结构中更柔性和较少可预测折叠，式(I)的化合物能够抑制来自患有桦树过敏的人的PBMC的疣皮桦(Betula verrucosa)诱导的IL-4应答，因此在过敏原免疫治疗中是有前景的佐剂。式(I)的化合物的三维结构似乎是高度特异性的并且是生物活性所需的。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，优选，人个体。其他哺乳动物受试者的非限制性实例包括家畜、农场动物和动物园、运动或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。因此，本发明的化合物和包括其的组合物可以用于人的医学治疗，以及用于兽医目的。
如本文中使用的，术语“免疫刺激剂”或“免疫刺激化合物”是指其活性通过刺激1型T辅助细胞和调节型T细胞应答影响宿主免疫系统功能或在宿主免疫系统功能中起作用的生物活性物质。由于其加强和改变先天性免疫应答及其持续时间的能力，在应用中，适用于用作疫苗或SIT制剂中的佐剂，用于增强对抗与免疫刺激化合物一起共同给药的疫苗或SIT免疫原的体液和细胞免疫应答。
如本文中使用的，术语“先天性免疫系统”，也称为“非特异性免疫系统”是指免疫系统的两个不同组成部分中的一个。先天性免疫系统由非特异性防御机制组成，其总是存在于脊椎动物体内并准备在体内出现抗原时立即或几小时内对抗外源抗原，而没有之前的感染或疫苗接种。这些机制包括物理屏障，如皮肤，血液中的化学物质和攻击体内的外源细胞的免疫系统细胞。先天性免疫应答通过抗原的化学性质来激活。
如本文中使用的，术语“获得性免疫系统”，也称为“适应性(后天性)免疫系统”是指免疫系统的其他不同的组分，即，抗原特异性免疫应答。获得性免疫应答比先天性的更复杂，并且其需要对抗已经逃避或客服先天性免疫防御的外源抗原。获得性免疫系统正常是沉默的，但在所述外源抗原的存在下变成激活的。首先，抗原必须被加工和识别。一旦被识别，获得性免疫系统形成特异性设计来攻击抗原的免疫细胞的军队。获得性免疫还包括形成将来更有效地对抗特异性抗原的应答的“记忆”。获得性免疫系统的体液组分由B淋巴细胞产生的抗体来介导，同时其他的细胞介导的组分通过T淋巴细胞作用。
如本文中使用的，术语“免疫原”是指刺激对抗免疫原自身的特异性获得性免疫应答的物质。这与免疫刺激剂相反，免疫刺激剂刺激免疫系统的非特异性激活，以增强对抗共同给药的免疫原的特异性免疫应答。
因此，本发明的免疫刺激化合物适宜用作疫苗的佐剂。因此，可以将其作为佐剂加入疫苗中，以刺激免疫系统对靶抗原的应答，但其自身没有给予免疫性。尤其是，本发明的化合物适宜用作脱敏或过敏原特异性免疫治疗注射中的佐剂。此外，本发明的化合物可以用作对抗传染病或癌症的疫苗中的佐剂。优选，用作佐剂时，根据本发明的免疫刺激化合物可以与主成分(所讨论的免疫原)共同给药。然而，根据本发明的免疫刺激化合物可以任选被加工来键合或进一步连接至所述免疫原或疫苗组合物的另一个组分。
本发明还包括用于诱导Treg-和/或Th1-型免疫应答的方法。所述方法涉及将有效量的本发明的化合物或其组合物施用于受试者，以诱导Treg-和/或Th1-型细胞因子的合成。在优选实施方案中，所述方法涉及但不限于诱导T细胞中的IFN-γ合成。
本发明进一步涉及用于抑制Th2-型免疫应答的方法。所述方法涉及将有效量的本发明的化合物、其任意组合、或包含其的组合物施用于需要的受试者，以部分或完全抑制对免疫原的Th2-型免疫应答的进展。在优选实施方案中，抑制机制包括，但不限于，T细胞中IL-10产生的诱导、和/或IL-4和/或IL-5产生的遏制。所述方法还涉及通过Th2-型T细胞、肥大细胞以及嗜曙红粒细胞和嗜碱粒细胞的功能的抑制或遏制来遏制Th2-型免疫应答。
更具体地，本发明的免疫刺激化合物或其组合物特别适用于其中通过以下情况来诱导Treg-和/或Th1-型免疫应答的应用中：
a)T细胞中IFN-γ产生的诱导，和/或
b)Th2-型T细胞、肥大细胞、嗜曙红粒细胞和/或嗜碱粒细胞的功能的抑制或遏制。
此外，本发明的免疫刺激化合物或其组合物特别适用于其中通过以下情况来抑制Th2-型免疫应答的应用中：
a)T细胞中IL-10产生的诱导，
b)T细胞中IL-4和/或IL-5产生的遏制，和/或
c)Th2-型T细胞、肥大细胞、嗜曙红粒细胞和/或嗜碱粒细胞的功能的抑制和遏制。
本发明还提供了用于调节Th介导的免疫应答的方法。优选，根据本发明刺激的免疫应答是偏向Th1-型应答并远离Th2-型应答。在一个方面中，所述方法涉及将有效量的本发明的化合物、其任意组合或包括其的组合物施用于受试者，以刺激Th1-型细胞因子的产生。在优选实施方案中，所述方法涉及但不限于诱导T细胞中的IFN-γ合成。在其他方面中，所述方法涉及将有效量的式(I)的化合物，其任意组合或包括其的组合物施用于受试者，以部分或完全抑制对免疫原的Th2-型免疫应答的进展。在优选实施方案中，抑制机制包括，但不限于，T细胞中IL-10产生的诱导、和/或IL-4和/或IL-5产生的遏制。所述方法还可以涉及通过Th2-型T细胞、肥大细胞以及嗜曙红粒细胞和嗜碱粒细胞的功能的抑制或遏制来遏制Th2-型免疫应答。
本发明进一步涉及本发明的化合物用于制备用于预防或治疗I型即刻特应性过敏(变态反应)的药品、或药物或营养制剂的用途。在优选实施方案中，I型即刻特应性过敏选自特应性湿疹/皮炎综合征(AEDS)、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性荨麻疹、食物过敏、毒液过敏和过敏性鼻结膜炎。在更多实施方案中，本发明的化合物可以用于预防和治疗由传染性病原体引起的传染病。在再更多实施方案中，本发明的化合物可以用于预防或治疗癌症。
如本文中使用的，术语动词或名词形式的“预防”等是指完全或部分抑制患有所述疾病或处于产生所述疾病的高风险中的受试者的疾病的进展或发作。
如本文中使用的，术语动词或名词形式的“治疗”等是指将有效量的本发明的化合物、其任意组合或包含其的组合物施用于需要这样治疗的受试者，以防止疾病的发作、缓解疾病的症状或停止疾病的进展或治愈疾病。
如本文中使用的，术语“有效量”是指对于获得所需治疗结果或至少改善Th2介导的事件的有害作用足够有效的含量。用于给药本发明的化合物、其任意组合或包含其的组合物的含量和方案可以通过治疗I型超敏性、传染病或癌症的临床领域中的普通技术人员来容易地确定。通常，根据组成尤其是给药方式，治疗有效量可以为约1μg至几克。例如，用于非肠道给药本发明的三价乙酰化β-(1→2)连接的甘露二糖的典型含量为约1μg至100μg，优选2μg至30μg，最优选3μg至10μg，并且对于口服给药，典型含量可以更高，并且可以从几mg至高达几克。
在更多实施方案中，本发明的药品或药物制剂可以通过本领域已知的任何途径施用于受试者，包括肠、粘膜、非肠道和局部途径。肠途径包括口服和涉及从胃肠道吸收的任何途径。粘膜途径包括，但不限于，口、鼻、舌下、颊、肺、经皮和眼途径。非肠道途径包括，但不限于，静脉内、皮内、肌内和皮下途径。
在一些实施方案中，本发明的化合物、其任意组合或包含其的组合物可以结合药物学上可接受的载体来使用。根据本发明的免疫刺激组合物通常包括至少一种式(I)的免疫刺激化合物和药物学上可接受的载体。术语“药物学上可接受的载体”是指活性成分与其结合以有利于施用于受试者并且对接受者是生理上可接受的载体物质。药物学上可接受的载体是本领域容易获得的并且根据计划的给药途径，可以选自但不限于经皮载体、经粘膜载体、口服载体、非肠道载体、用于储库(长效，depot)制剂的载体和用于延迟释放制剂的载体。
本发明的免疫刺激化合物、其任意组合或包含其的组合物可以制成胶囊、结合或溶解于基质中，其可以提供延迟的释放全身性递送。其可以任选适用于在局部组织区域内提供延迟递送，例如，在过敏反应部位、感染部位或疫苗接种部位内。这样的持续释放或受控释放打算用来包括作为储库制剂或其组分在体内生物降解的结果、或作为代谢转化或分解释放所述免疫刺激化合物的结果而发生的释放。例如，在皮下注射中，其中将免疫刺激化合物作为佐剂与免疫原一起使用，其自身可以起到储库制剂的作用，将随着时间漏出至血液/周围组织。
或者，本发明的免疫刺激化合物可以从核心单位或载体直接缀合至脂质基团，其随后可以提供储库制剂。这样的脂质介导的或脂化的(lipidated)免疫刺激化合物可以用于形成悬浮液、结合至乳液、脂质膜、脂质囊泡、脂质体中等。
在更多实施方案中，本发明的药物组合物可以包括另一种治疗化合物。如本文中使用的术语“治疗化合物”优选是过敏药物、哮喘药物、抗微生物剂或癌症药物。
在其他实施方案中，本发明的药物组合物包括抗原。术语“抗原”宽泛地包括被宿主免疫系统识别并且能够引发特异性免疫应答的任何类型的分子(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、核酸，或其组合)。本发明的用于刺激针对该抗原的免疫应答的组合物中使用的抗原可以是合成的、天然产生的或分离的分子或其片段，并且可以包括单个或多个表位。因此，本发明的组合物可以刺激针对一个或多个抗原的单个或多个表位的免疫应答。涉及本发明的组合物时，术语“抗原”和“免疫原”可以互换使用。
在一些实施方案中，抗原是针对特定过敏原免疫治疗(过敏原疫苗接种或舌下免疫治疗)的过敏原制剂。如本文中使用的，术语“过敏原”是指可以诱导易感受试者的过敏或哮喘应答的物质，并且包括但不限于花粉、昆虫毒液、动物鳞屑、真菌孢子和屋尘螨。如本文中使用的，术语“特定过敏原免疫治疗”也称为过敏原免疫治疗、脱敏治疗或免疫脱敏，是指通过任一种已知途径给药逐渐递增含量的过敏原来诱导对过敏原的耐受，以防止进一步的过敏反应，从而治疗患有过敏疾病的受试者。因此，本发明的组合物还可以包括用于特定过敏原免疫治疗的过敏原制剂和/或其他过敏或哮喘药物。
或者，本发明的药物组合物可以进一步包括用于对抗传染病的疫苗接种或免疫的微生物特异性抗原制剂和/或抗微生物剂。术语“传染病”是指由体内存在的外源微生物或传染病原体引起的疾病。术语“传染性病原体”，即，微生物，是指病毒、细菌和寄生物。因此，术语传染病原体还包括不合需要的正常菌群。在一个方面中，本发明的药物组合物和微生物抗原的联合给药对于刺激增强的对病原体的免疫应答是有用的。如本文中使用的术语“微生物抗原”包括完整微生物，及其天然分离物和片段或衍生物，并且还包括合成的化合物，其与天然微生物抗原相同或相似。在其他实施方案中，本发明的药物组合物可以包括特异性地结合或识别微生物抗原的抗体或抗体片段。
在一些进一步的实施方案中，本发明的药物组合物可以包括用于引发对抗表达抗原的癌细胞的特异性免疫应答的癌抗原。如本文中使用的，术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”是可互换的，并且它们是指由癌细胞或肿瘤细胞表达的并且能够引起免疫应答的化合物，如肽。更具体地，“肿瘤特异性抗原”是与肿瘤细胞特异性相关但与正常细胞无关的抗原。肿瘤特异性抗原的非限制性实例是由突变细胞基因(如致癌基因、遏制基因)编码的那些，以及从内部删除或染色体易位产生的融合蛋白。“肿瘤相关抗原”存在于肿瘤细胞和正常细胞中，但以不同含量或不同形式存在于肿瘤细胞中。此外，其他癌抗原由病毒基因编码，如RNA和DNA病毒上携带的那些基因。可以利用正常细胞和癌细胞中癌抗原的不同表达，以靶向癌细胞。
在一些实施方案中，待通过本发明的方法、化合物和组合物治疗的癌症包括，但不限于，癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状上皮细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、神经内分泌癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、脑癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、食管癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌，及其组合。待根据本发明治疗的优选癌类型是黑素瘤。
不同癌症的特异性癌抗原或与不同癌症相关的癌抗原是本领域公知的。因此，本领域技术人员可以根据待治疗的癌症类型容易地选择待包含在本发明的组合物中的癌抗原。癌抗原可以通过本领域公知的方法来制备。例如，可以通过制备癌细胞的粗提物、通过部分纯化抗原、通过重组技术或通过已知抗原的从头(de novo)合成，从癌细胞制备这些抗原。此外，抗原可以是完整抗原，或其可以是包括至少一个表位的完整抗原的片段。
在其他实施方案中，本发明的化合物可以用作食品添加剂。本发明的化合物还可以是营养制剂。营养制剂优选是通过肠内可给药的，例如，粉末、片剂、胶囊、液体浓缩物、固体产品或即饮饮料。或者，将营养制剂结合适宜作为常见食品的添加剂的基质。在其他实施方案中，本发明的营养制剂用于丰富婴儿配方食品或其他功能性食品。包含本发明的组合物的再一个实施方案可以是口香糖。
具体实施方案
概述
用于合成工作的所有试剂购自Sigma-Aldrich，至少是试剂级的，并且没有进一步纯化就使用。通过CaH2上的蒸馏获得无水CH2Cl2，并且干的DMF同样是购买的，并且储存在分子筛上。在用硅胶60F254(Merck)预涂的铝片上进行TLC，并且通过UV观察斑点，并通过用MeOH中的H2SO4(20％v/v)处理接着加热来炭化。使用硅胶60(0.040-0.060mm Merck)进行柱色谱。在589nm下使用钠的D-线，用Perkin-Elmer 241偏振计测量了旋光度。在BrukerMicroToF-Q上记录了HRMS，使用以阳性模式操作的电喷雾离子化。在600.13Hz或500.13(1H)和150.90Hz或125.77Hz(13C)下运行的Bruker Avance分光计上记录NMR谱。通过记录NMR实验的标准设定，1H NMR、13C NMR、DQF-COSY、HSQC(偶合的和去偶的)和HMBC，进行了质子和碳谱的完整评价。通过使用1D-TOCSY，将谱的复杂性降至单糖水平。使用ROESY和DOSY方法来帮助构象研究。化学位移参照内标(四甲硅烷，在1H和13C中，δ＝0.0ppm)或残留溶剂信号(CDCl3，在1H中，δ＝7.26ppm，并且在13C中，δ＝77.16ppm)，并且对于1H NMR，用两位小数记录，对于13C NMR，用一位小数。在这不足以分离信号的情况中，记录另外的小数。在可能的情况中，用NMR模拟软件PERCH测定准确的偶合常数，并用一位小数记录。为了避免不必要的NMR数据的膨胀，只在第一次遇到时记录每个偶合常数。
在Maestro进行了分子建模和观察，并且在Maestro中使用嵌入式界面，通过Desmond进行了计算。最初，在Maestro中构建分子，此后使用经由Maestro中的嵌入式界面控制的Desmond进行了计算。为了获得用于分子动力学模拟的良好起始点，在构建分子后进行了超过1000步的快速最小化测序，并且视觉检查结果，以观察是否是合理的。用模拟退火工艺开始分子动力学模拟，其中首先将温度升至600K，随后缓慢降至最终模拟温度，在我们的情况中，低于环境温度，以转换溶剂信号，使得它们不与NMR谱中的重要信号重叠。此外，较低温度引起一些重叠的质子信号分开，使其更容易从ROESY谱提取信息。重复退火，以确保分子没有停止在高能量局部最小值。退火后，将分子动力学模拟运行2ns，在该过程中，每1ps存储结构。从这些结构，测量了质子之间的平均距离，并且由于NOE作用与1/r6成比例，计算平均距离时，将这个因子用作权重。在产生的结构中，分析了最多的构象家族，并使用记录的ROESY谱中看到的关联来证实。
式(I)的化合物的实验合成
例如，可以通过以下反应方案来合成式(I)的化合物：
例如，可以通过以下反应方案来合成式(II)的化合物：
2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙基2-O-乙酰基-4,6-O-苯亚甲基-3-O-(4-甲氧基苯甲基)-α-D-吡喃甘露糖苷(5)：
向在-40℃下无水CH2Cl2(40ml)中的苯基2-乙酰基-4,6-O-苯亚甲基-3-O-(4-甲氧基-苯甲基)-硫-α-D-吡喃甘露糖苷(1000mg，1.92mmol，1当量)和2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙醇(403mg，2.30mmol，1.2当量)溶液中加入分子筛NIS(517mg，2.30mmol，1.2当量)和TMSOTf(83μl，0.23mmol，0.24当量)。将反应混合物在-40℃下搅拌2h，并随后通过添加饱和NaHCO3溶液(20ml)来淬灭。使反应混合物至室温，并用CH2Cl2(50ml)稀释，并用饱和NaHCO3溶液(50ml)洗涤，此后用CH2Cl2(2×50ml)提取含水层。用盐水(100ml)洗涤合并的有机层，并通过Na2SO4干燥，并浓缩。通过柱色谱(己烷：EtOAc 2:1→1:1)纯化粗制混合物，获得作为浅黄色油的纯产物5。Rf:0.33(己烷：EtOAc 1:1)。产量790mg(70％)。
[α]D 24＝+20.0°(c 2.30,CHCl3)。
1H NMR(600.13MHz,CDCl3,25℃):δ＝7.50(m,2H,arom.H),7.40–7.34(m,3H,arom.H),7.27(m,2H,arom.H),6.83(m,2H,arom.H),5.62(s,1H,4,6-OCHPh),5.42,(dd,1H,JH-2,H-1＝1.6Hz,JH-2,H-3＝3.5Hz,H-2),4.83,(d,1H,H-1),4.64和4.58(每个d,每个1H,J＝–11.56Hz,3-OCH2Ph),4.25(dd,1H,JH-6a,H-5＝4.8Hz,JH-6a,H-6b＝–10.24Hz,H-6a),4.03(dd,1H,JH-4,H-3＝10.0Hz,JH-4,H-5＝9.5Hz,H-4),4.01(dd,1H,H-3),3.91(ddd,1H,JH-5,H-6b＝10.4Hz,H-5),3.83(dd,1H,H-6b),3.80(m,1H,H-1'a),3.79(s,3H,3-OCH3),3.68–3.61(m,9H,H-1'b,H-2',H-3',H-4',H-5'),3.34(m,2H,H-6'),2.15(s,3H,COCH3)。
13C NMR(150.9MHz,CDCl3,25℃):δ＝170.2(2-OCOCH3),159.2,137.5,130.1,129.3,128.9,128.1,126.1,113.7(arom.C),101.5(4,6-OCHPh),98-8(C-1),78.3(C-4)73.6(C-3),71.8(3-OCH2Ph),70.8,70.7,70.1(C-2',C-3',C-4',C-5'),69.7(C-2),68.7(C-6),67.0(C-1'),63.8(C-5),55.2(3-OCH3),50.6(C-6'),21.0(2-OCOCH3)。
HRSM:m/z对于C29H41N4O10[M+NH4]+:计算值：605.2817，测定值：605.2829，m/z对于C29H37N3NaO10[M+Na]+:计算值：610.2371，测定值：610.2361。
2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙基4,6-O-苯亚甲基-3-O-(4-甲氧基苯甲基)-α-D-吡喃甘露糖苷(7)：
通过添加几滴MeOH中的NaOMe的5.4M溶液，在氩气氛下，将无水甲醇(4ml)中的产物5(490mg，0.83mmol)溶液的pH调节至～10-12。将反应混合物在室温下搅拌30min，随后用DOWEX-50WX8H+形式中和。将反应混合物过滤，并浓缩，获得作为黄色/橙色油的纯产物7。产量：441mg(97％)。
[α]D 24＝+21.0°(c 1.10,CHCl3)。
1H NMR(600.13MHz,CDCl3,25℃):δ＝7.51(m,2H,arom.H),7.42–7.35(m,3H,arom.H),7.30(m,2H,Arom.H),6.88(m,2H,arom.H),5.61(s,1H,4,6-OCHPh),4.91(d,1H,JH-1,H-2＝1.5Hz,H-1),4.78和4.65(每个d,每个1H,J＝–11.4Hz,3-OCH2Ph),4.26(dd,1H,JH-6a,H-5＝4.5Hz,JH-6a,H-6b＝–9.3Hz,H-6a),4.081(dd,1H,JH-2,H-3＝3.5Hz,H-2),4.076(dd,1H,JH-4,H-3＝9.6Hz,JH-4,H-5＝9.5Hz,H-4),3.93(dd,1H,H-3),3.88(ddd,1H,JH-5,H-6b＝9.6Hz,H-5),3.84(dd,1H,H-6b),3.85–3.82(m,1H,H-1'a),3.81(s,3H,3-OCH3),3.71–3.65(m,9H,H-1'b,H-2',H-3',H-4',H-5'),3.37(m,2H,H-6')。
13C NMR(150.9MHz,CDCl3,25℃):δ＝159.5,137.7,130.3,129.6,129.0,128.3,126.2,114.0(arom.C),101.6(4,6-OCHPh),101.1(C-1),79.0(C-4),75.4(C-3),72.8(3-OCH2Ph),70.91,70.87,70.4,70.3(C-2',C-3',C-4',C-5'),70.0(C-2),69.0(C-6),66.9(C-1'),63.4(C-5),55.4(3-OCH3),50.8(C-6')。
HRSM:m/z对于C27H39N4O9[M+NH4]+:计算值：563.2712，测定值：563.2691，m/z对于C27H35N3NaO9[M+Na]+:计算值：568.2266，测定值：568.2267。
2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙基O-[4,6-O-苯亚甲基-2,3-二-O-(4-甲氧基苯甲基)-β-D-吡喃甘露糖基]-(1→2)-4,6-O-苯亚甲基-3-O-(4-甲氧基苯甲基)-α-D-吡喃甘露糖苷(9)：
向无水CH2Cl2(15ml)和1-辛烯(5ml)中的苯基4,6-O-苯亚甲基-2,3-二-O-(4-甲氧基-苯甲基)-硫代-α-D-吡喃甘露糖苷(1059mg，1.76mmol，1.3当量)的溶液中加入分子筛，此后将溶液冷却至-60℃。加入BSP(526mg，2.12mmol，1.56当量)、TTBP(568mg，2.71mmol，2当量)和Tf2O(386μl，2.29mmol，1.69当量)，将反应混合物在-60℃下搅拌30min。随后将反应混合物冷却至-78℃，并加入无水CH2Cl2(5ml)中的产物7(740mg，1.36mmol，1当量)。将反应混合物在-78℃下搅拌3h，随后通过添加Et3N(1ml)淬灭，并使反应混合物在30min内返回室温。用CH2Cl2(50ml)稀释反应混合物，并随后用饱和NaHCO3溶液(50ml)洗涤。用CH2Cl2(2×50ml)萃取水层，并用盐水(100ml)洗涤合并的有机层，通过Na2SO4干燥，并浓缩。柱色谱(己烷:EtOAc 2:1→1:1)，获得作为澄清油的纯产物9。Rf＝0.35(己烷:EtOAc 1:1)。产量：613mg(43％)。
[α]D 24＝–36.0°(c 1.36,CHCl3).
1H NMR(600.13MHz,CDCl3,25℃):δ＝7.51–7.47(m,4H,arom.H),7.43(m,2H,arom.H),7.40–7.32(m,8H,arom.H),7.19(m,2H,arom.H),6.86–6.79(m,6H,arom.H),5.59(s,1H,4B,6B-OCHPh),5.51(s,1H,4A,6A-OCHPh),4.96和4.89(每个d,每个1H,J＝–11.9Hz,2B-OCH2Ph),4.84(d,1H,JH-1A,H-2A＝0.7Hz,H-1A),4.71和4.62(每个d,每个1H,J＝–11.5Hz,3A-OCH2Ph),4.60和4.53(每个d,每个1H,J＝–12.0Hz,3B-OCH2Ph),4.60(s,1H,H-1B),4.27(dd,1H,JH-2A,H-3A＝3.0Hz,H-2A),4.26(dd,1H,JH-6Ba,H-5B＝5.9Hz,JH-6Ba,H-6Bb＝–10.6Hz,H-6Ba),4.25(dd,1H,JH-6Aa,H-5＝4.9Hz,JH-6Aa,H-6Ab＝–11.2Hz,H-6Aa),4.22(dd,1H,JH-4B,H-3B＝9.8Hz,JH-4B,H-5B＝9.5Hz,H-4b),4.08(dd,1H,JH-4A,H-3A＝9.9Hz,JH-4A,H-5A＝9.7Hz,H-4A),3.96(dd,1H,H-3A),3.93(d,1H,JH-2B,H-3B＝3.1Hz,H-2B)3.87(dd,1H,JH-6Bb,H-5B＝9,9Hz,H-6Bb),3.85(ddd,1H,JH-5A,H-6Ab＝9.9Hz,H-5A),3.82(m,1H,H-1'),3.80(s,3H,OCH3),3.774(s,3H,OCH3),3.766(dd,1H,H-6Ab),3.76(s,3H,OCH3),3.69–3.59(m,9H,H-1'b,H-2',H-3',H-4',H-5'),3.55(dd,1H,H-3B),3.32(m,2H,H-6'),3.30(ddd,1H,H-5B)。
13C NMR(150.9MHz,CDCl3,25℃):δ＝159.23,159.22,159.1,137.71,137.70,131.1,130.7,130.52,130.45,129.3,129.2,128.9,128.30,128.26,126.22,126.15,113.79,113.65,113.6(arom.C),101.7(4A,6A-OCHPh),101.5(4B,6B-OCHPh),101.0(C-1B),98.5(C-1A),78.7(C-4A),78.6(C-4B),77.3(C-3B),75.3(C-2B),74.9(C-2A),74.2(2B-OCH2Ph),72.0(3B-OCH2Ph),70.94(3A-OCH2Ph),70.91,70.8,70.3,70.2(C-2',C-3',C-4',C-5'),69.0(C-6A),68.7(C-6B),67.9(C-5B),67.0(C-1'),64.3(C-5A),55.38,55.36,55,3(3×OCH3),50.7(C-6')。
HRSM:m/z，对于C56H69N4O16[M+NH4]+:计算值：1053.4703，测定值：1053.4669,m/z，对于C56H65N3NaO16[M+Na]+:计算值：1058.4257，测定值：1058.4208。
2-[2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基]乙基O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-d-吡喃甘露糖基)-(1→2)-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(11)：
向10ml CH2Cl2中的产物9(200mg，0.19mmol，1当量)的溶液中，加入1,3-丙烷二硫醇(155μl，1.54mmol，8当量)，并将混合物在冰浴上冷却。加入TFA(4ml)和H2O(1ml)，并将反应混合物在室温下下搅拌3h。然后用H2O(100ml)稀释反应混合物，并用CH2Cl2(4×50ml)洗涤，此后将水层蒸发并用甲苯共同蒸发。将残余物溶解于吡啶(20ml)中并在冰浴上冷却，同时加入Ac2O(10ml)。随后将反应混合物在室温下搅拌18h，此后，将反应在冰浴上冷却，并通过添加甲醇(10ml)来淬灭。用CH2Cl2(50ml)稀释反应混合物，用H2O(4×50ml)和盐水(50ml)洗涤。将有机层通过Na2SO4干燥，并浓缩。通过柱色谱(己烷:EtOAc 1:1→CH2Cl2:甲醇20:1)纯化粗制混合物，获得作为澄清油的纯产物11。Rf＝0.34(CH2Cl2:甲醇20:1)。产量：113mg(75％)。
[α]D 24＝–51.5°(c 1.62,CHCl3).
1H NMR(600.13MHz,CDCl3,25℃):δ＝5.51(dd,1H,JH-2B,H-1B＝0.7Hz,JH-2B,H-3B＝3.4Hz,H-2B),5.27(t,1H,JH-4A,H-3A＝JH-4A,H-5A＝10.1Hz,H-4A),5.22(dd,1H,JH-4B,H-3B＝10.0Hz,JH-4B,H-5B＝9.9Hz,H-4B),5.05(dd,1H,H-3B),5.02(dd,1H,JH-3A,H-2A＝3.4Hz,H-3A),4.88(d,1H,JH-1A,H-2A＝1.8Hz,H-1A),4.69(d,1H,H-1B),4.36(dd,1H,H-2A),4.32(dd,1H,JH-6Bb,H-5B＝6.0Hz,JH-6Bb,H-6Ba＝–12.2Hz,H-6Bb),4.26(dd,1H,JH-6Ab,H-5A＝3.8Hz,JH-6Ab,H-6Aa＝–12.3Hz,H-6Ab)4.06(dd,1H,JH-6Aa,H-5A＝2.3Hz,H-6Aa),4.02(dd,1H,JH-6Ba,H-5B＝2.4Hz,H-6Ba),3.94(ddd,1H,H-5A),3.81(m,1H,H-1'a),3.72–3.64(m,9H,H-1'b,H-2',H-3',H-4',H-5'),3.64(ddd,1H,H-5B),3.40(m,2H,H-6'),2.25(s,3H,2B-COCH3),2.13(s,3H,6A-COCH3),2.10(s,3H,6B-COCH3),2.05(s,3H,4A-COCH3),2.03(s,3H,4B-COCH3),2.02(s,3H,3A-COCH3),2.01(s,3H,3B-COCH3)。
13C NMR(150.9MHz,CDCl3,25℃):δ＝171.0(6A-COCH3),170.7(6B-COCH3),170.3(2B-COCH3),170.2(3A-COCH3),170.0(3B-COCH3),169.7(4B-COCH3),169.3(4A-COCH3),97.5(C-1A),96.3(C-1B),72.22(C-5B),72.17(C-2A),70.73,70.72(C-3',C-4'),70.6(C-3B),70.3(C-3A),70.2(C-2'),70.1(C-5'),68.52(C-2B),68.50(C-5A),67.1(C-1'),66.1(C-4B),65.1(C-4A),62.5(C-6B),61.8(C-6A),50.7(C-6'),20.8,20.74,20.70,20.62,20.57(COCH3)。
HRSM:m/z，对于C32H51N4O20[M+NH4]+:计算值：811.3091，测定值：811.3083,m/z，对于C32H47N3NaO20[M+Na]+:计算值：816.2645，测定值：816.2621。
1,2,3-三(1-{2-[2-(2-[O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→2)-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基氧]乙氧基)乙氧基]乙基}-4-甲氧基-1,2,3-三唑基)丙烷(3)：
向CH2Cl2(2ml)中的产物11(70mg，0.088mmol，3.3当量)和1,2,3-三-(丙-2-炔-1-基氧)丙烷(5.5mg，0.027mmol，e当量)的溶液中，加入t-BuOH(2ml)和H2O(2ml)。加入CuSO4(2.8mg，0.017mmol，0.66当量)和抗坏血酸钠(7.0mg，0.035mmol，1.32当量)，并将反应混合物在55℃下搅拌18h。加入NH4Cl(10ml)和H2O(10ml)的饱和溶液，并用CH2Cl2(4×20ml)提取反应混合物。将合并的有机层通过Na2SO4干燥，并浓缩。通过柱色谱(CH2Cl2:甲醇20:1→5:1)纯化粗制混合物，获得作为白色固体的纯产物3。Rf＝0.16(CH2Cl2:甲醇20:1)。产量：62mg(89％)。
[α]D 24＝–37.0°(c 1.05,CHCl3)。
1H NMR(600.13MHz,CDCl3,25℃):δ＝7.81,7.772,7.769(每个s,每个1H,3×triaz.H),5.52–5.49(m,3H,3×H-2B),5.27(m,3H,3×H-4A),5.23(m,3H,3×H-4B),5.06(m,3H,3×H-3B),5.01–4.97(m,3H,3×H-3A),4.85(m,3H,3×H-1A),4.78(s,2H,G2-OCH2),4.72(m,3H,3×H-1B),4.64(s,4H,G1-OCH2),4.60–4.51(m,6H,6×H-6'),4.36–4.30(m,6H,3×H-6Bb,H-2A),4.24(m,3H,3×H-6Ab),4.06(m,3H,3×H-6Aa),4.03–3.98(m,3H,3×H-6Ba),3.95–3.86(m,9H,3×H-5A,6×H-5'),3.85–3.75(m,4H,H-G2,3×H-1'a),3.68–3.58(m,28H,3×H-5B,4×H-G1,3×H-1'b,6×H-2',6×H-3',6×H-4'),2.24,2.12,2.09,2.04,2.03,2.02,2.01(每个s,每个9H,21×COCH3)。
13C NMR(150.9MHz,CDCl3,25℃):δ＝171.0,170.6,170.33,170.29,170.0,169.7,169.3(COCH3),145.1,144.7(C-4,triaz.),124.0,123.9(C-5,triaz.),97.6(C-1A),96.29,96.27(C-1B),77.2(C-G2),72.11,72.08(C-5B,C-2A),70.67,70.65(C-3B),70.51,70.49(C-3',C-4'),70.29,70.26(C-3A),70.2(C-G1),70.1(C-2'),69.5(C-5'),68.53(C-2B),68.49(C-5A),67.0(C-1'),66.1(C-4B),65.1(C-4A),64.8(G1-OCH2),63.8(G2-OCH2),62.4(C-6B),61.8(C-6A),50.20,50.16(C-6'),20.79,20.75,20.7,20.62,20.57(COCH3)。
HRSM:m/z，对于C108H155N9NaO63[M+Na]+:计算值：2608.9094，测定值：2608.8944。
生物学研究
过敏原诱导的细胞因子应答
生物学研究对象
在花粉季期间，将14名患有过敏性鼻结膜炎的成年桦树过敏受试者(12名女性和两名男性)登记在研究中(平均年龄42.5岁，SD12.4岁；平均桦树特异性IgE(Immunocap，Thermo Fisher Scientific Phadia，Uppsala，瑞典)36.1kU/l，SD 31.5kU/l)。基于花粉季期间良好的桦树诱发的IL-4应答，从早先的群选择他们用于研究。在知情同意后获取所有样品。研究由地方伦理委员会批准。
生物学研究中的佐剂
按照之前在WO 2012/175813中所述的，合成了化合物1(1,2,3-三[1-(3-{O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→2)-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基氧}乙基)-4-甲氧基-1,2,3-三唑基]丙烷)和化合物2(1,2,3-三[1-(3-{O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→2)-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基氧}丙基)-4-甲氧基-1,2,3-三唑基]丙烷)。根据本文中所述的方法，制备了化合物3(1,2,3-三(1-{2-[2-(2-[O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→2)-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖基氧]乙氧基)-乙氧基]乙基}-4-甲氧基-1,2,3-三唑基)丙烷)。合成的MPL和CpG-ODN(tlrl-2006)购自Invivogen(San Diego，CA，USA)。CpG-ODN具有5′-TCG TCG TTTTGT CGT TTT GTC GTT-3′的序列(SEQ ID NO:1)，与之前研究中使用的相同。
PBMC培养
在花粉季期间，从研究受试者的肝素化血样，通过Ficoll-Paque密度梯度离心(Ficoll-Paque PLUS，GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，瑞典)分离了外周血单核细胞(PBMC)。用NaHCO3(pH 7.4)缓冲的Hanks’平衡盐溶液(HBSS)洗涤PBMC两次，并重悬浮于补充了5％自体同源血清、2.5mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich_Co.，St.Louis，MO)和100μg/ml硫酸庆大霉素(Biological Industries Ltd.，Kibbutz Beit Haemek，Israel)的RPMI-1640培养基(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA，USA)中，并以106/ml的密度施加于48-孔平底细胞培养平板上(Costar，Corning Inc.，New York，United States)。在桦树过敏原(50μg/ml，Betula verrucosa，Bet v，Aquagen，ALK-AbellóA/S，丹麦)和化合物1、2、3和浓度为1、10和100μg/ml的MPL和浓度为2、20和200μg/ml的佐剂CpG-ODN存在下共同培养细胞，以获得相等的摩尔浓度。单独的培养基用作未刺激的对照。所有温育在含有5％CO2的潮湿气氛中在+37℃下进行。在刺激开始后72h收集来自一式两份进行的培养物的上清液，并储存在-70℃。
IL-4和TNF产生
使用高灵敏度人细胞因子Lincoplex试剂盒(LINCO Research，St.Charles，MO，USA)，测量了上清液中的细胞因子IL-4和TNF。根据制备商的实验方案，通过使用Luminex技术，进行了测试。
统计学
使用Wilcoxon’s Signed Rank测试来测试PBMC实验中的统计学显著性。使用GraphPad Prism软件(v.5，GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA)，通过非参数Mann-Whitney U-测试比较了单个小鼠组。将数据表示为平均±SEM，并且认为<0.05的P-值是统计学上显著的。
结果
化合物1、2、3，MPL和CpG-ODN对14名桦树过敏性鼻炎患者的PBMC培养物中的过敏原(Bet v)诱导的细胞因子应答的作用呈现于图1中。与未刺激的培养物(平均0.4pg/ml，SEM 0.2pg/ml)相比，用桦树刺激诱导了显著的Th2细胞因子IL-4应答(平均45.3pg/ml，SEM11.2pg/ml)(p＝0.0015)。用10(p<0.001)和100μg/ml(p＝0.036)化合物2、10(p＝0.016)和100μl/ml(p＝0.021)化合物3、10(p＝0.016)和100μg/ml(p＝0.006)化合物3，1(p＝0.002)和10μg/ml(p＝0.0.013)MPL和200μg/ml CpG-ODN(p＝0.002)，看到了桦树诱导的IL-4产生的显著遏制。只有使用化合物1-3看到了遏制的剂量应答曲线，因为较低浓度的CpG-ODN提高了IL-4产生，并且最高浓度的MPL没有遏制作用。用100μg/ml(p＝0.021)化合物2、100μl/ml(p＝0.0039)化合物3以及20(p＝0.0026)和200μg/ml(p<0.001)CpG-ODN看到了显著提高的前炎性细胞因子TNF产生(图2)。
癌症免疫治疗的体内异种移植模型
材料和方法
将100μl PBS中的3*106B16细胞黑素瘤细胞s.c.注入七周大的雌性C57BL/6小鼠的右侧。从第0天开始，以3天间隔，在200μl PBS中i.p.50μg/注射给予化合物3五次。每个处理组含有10只小鼠。使用公式0.5*长度*宽度2，计算了肿瘤体积。当肿瘤体积达到800mm3时，将动物牺牲。按照Aluehallintavirasto(许可ESAVI/480/04.10.07/2016)接受的程序进行了动物实验。
结果
小鼠中的肿瘤生长侵入性非常高，并且小鼠在第13天必须牺牲。与对照相比，用化合物3处理的小鼠肿瘤生长开始较晚，并且较慢，直至第9天。在第9天，与对照小鼠相比，用化合物3处理的小鼠中的肿瘤体积在统计学上显著较小(图3)。
构象研究
为了预测和准确地测定生物活性分子的作用，重要的是研究它们在溶液中的行为。这样的研究通常涉及对分子的三维结构及其随着时间变化的研究。这样的研究不总是直接的，包括温度和溶剂的几个因素影响分子的动力学行为。在本发明的研究中，通过NMR光谱学来研究化合物1、2和3，包括扩散有序光谱(DOSY)和旋转框overhauser效应光谱学(ROESY)方法。
NOE作用对于在溶液中快速翻滚的小分子是正向的，或对于翻滚较缓慢的较大的分子(如蛋白质)是负向的。作为该结果，存在其中NOE作用可以为零的区域。范围从双糖至己糖的寡糖(～400-1500Da)常常位于这个范围内。尽管这个工作中研究的分子略大于此，但NOE作用仍然相当弱。因此，使用ROESY实验，其通常产生正信号。ROESY允许评价哪些质子彼此在空间上接近，提供关于分子构象的关键信息。此外，这些数据也可以与分子动力学模拟产生的结果进行比较。
另一方面，DOSY允许计算分子的扩散系数，这转而提供了关于分子占据的水力半径(体积)的信息。尽管化合物1-3的生物评价在水中进行，由于其差的水溶性，这将导致不切实际地长的实验时间，因此在氘化甲醇中进行了NMR实验。关于极性和电介质常数(对于水和甲醇，分别为p＝1.85D，ε＝80.1和p＝1.69D，ε＝32.7)，甲醇的性质与水相当相似。不幸地，来自三个不同甘露二糖单体的信号彼此实际上是不能区分的，表明所有甘露二糖部分的化学环境是相当相似的。值得注意的是，由于进行了ROESY实验，关联的缺乏可以提供与关联自身同样多的信息，因为它们与NOESY类似物相比，对分子运动不太敏感。
计算实验方案描述于“一般”部分中。特别地，将通过分子动力学模拟获得的几何学用于提取关键质子间距离，将其与使用非常确定的方法从NOESY实验估算的那些进行比较。
结果
将DOSY用于估算分子的大小。令人相当惊讶地，尽管化合物1-3的连接基长度明显不同，扩散系数实际上是相同的。直觉上，可以预期分子的三个臂将尝试尽可能多地展开，以最小化空间相互作用。然而，看来不是这种情况。由于使用高极性溶剂(氘化甲醇)，这些非极性分子反而与自身相互作用，尝试最小化与溶剂的接触并因此形成折回自身上的褶皱结构。ROESY谱中这种严重的重叠使得不可能区分来自一个特定实体内产生的那些的不同甘露二糖单体之间的关联。因此，本文中只记载了观察到的关联，安全地假设了对于观察到的ROE，相应的距离不能长于这是在这个大小的分子中产生NOE作用的距离的大致上限。
参照化合物1
对于具有许多可旋转键的大分子，能量最小值不是非常充分限定的。这意味着在溶液中，将存在大量不同构象。在这种情况中，也是这样的。在分子动力学模拟过程中，观察到了大量构象。在退火工艺的高温过程中，分子的主要构象是其中每个臂是直着伸出的，但随着系统冷却，分子开始折叠在一起。实际上，在低温下，这是主要构象。
对于这个分子，支持折叠结构的最重要的ROESY关联，是来自三唑和连接基质子的关联。三唑质子显示出与H-2A和H-3A质子的关联以及与异头质子H1A的关联(图4)。从分子动力学模拟获取的距离分别为和此外，H-2B质子显示出与H-1A质子的关联，这对于分子中存在的β-(1→2)连接的甘露二糖的αβ构象是特征性的。最重要的关联显示于图4中。此外，在质子H3A和H5A以及H1B、H3B和H5B之间可以看到关联。这证实了碳水化合物部分是4C1构象。在分子动力学模拟过程中，与NOE数据一致，针对化合物1的最多形式的构象描绘于图5中。
参照化合物2
略大的化合物2的行为与化合物1的行为非常相似。ROESY谱中的主要差异是多添加一个离三唑环足够远的-CH2-基团来排除与碳水化合物质子的任何ROE关联。由于不能从三唑质子看到相关关联，通过着眼于连接基和碳水化合物质子之间的关联来测定构象。这种情况中的相关关联是H1A-H1’H1A-H2’H5A-H1’H5A-H2’和H5A-H3’(图6)。从分子动力学模拟提取的与实验数据一致的最多的构象显示于图7中。
化合物3
正如预期的，最大分子的行为与其他两个略有不同。连接基单体明显更长，这使得与两个较小分子相比更灵活并且因此导致限定更不明确的能量最小值。
在ROESY谱中，可以看到不同碳水化合物质子与连接基的关联。这是根据致密结构，如图9中展示的。值得注意的是，在连接基质子和几乎所有糖质子之间存在关联，除了H4A和H4B(图8)。这个情况应当是预期的，除非碳水化合物基团之间的糖苷键采用非常罕见的构象。根据分子动力学模拟，糖苷键在预期的构象中，糖苷角大约60°，并且糖苷配基(aglyconic)ψ角大约20-30°，与β-(1→2)连接的甘露糖苷的典型构象一致。与其他两个结构相同，在丙三醇质子和碳水化合物或连接基质子之间没有看到关联。从分子动力学模拟提取的化合物3的最多的构象显示于图9中。
结论
所有三种化合物的折叠结构将三唑部分留在分子外面。这使得它们易接近生物靶标，并且已知三唑可以参与生物学事件。实际上，已经围绕三唑基团设计了许多药物。尽管在本发明的情况中，三唑部分对糖簇分子1、2和3的生物活性可能的影响不能完全排除，但必须强调在筛选的非常大量的寡价β-(1→2)甘露糖苷中，几种其他的也含有三唑单体，显示出具有前景的体外活性的仅有化合物是之前已知的化合物1和2及其新的类似化合物3。这三种活性化合物共享的共有特征是：1)完全乙酰化的三价β-(1→2)甘露二糖单体，其2)经由β-键连接中心核；经由3)不同大小的连接基。这种三维结构似乎是高度特异性的并且是生物活性所需的，相应的脱乙酰化或经由β-键连接连接基和中心核的化合物1的类似物至少在体外PBMC模型中是无活性的。此外，在所有三种分子中，丙三醇骨架位于糖部分的相对侧，即，聚糖部分全部折叠至分子的同一侧。这得到骨架中的质子没有显示出与碳水化合物质子的任何ROESY关联的事实的支持。
本领域技术人员将显而易见的是，作为技术优势，本发明的概念可以以各种方式来实施。本发明及其实施方案不限于上述的实施例，而是可以在权利要求的范围内改变。

Claims (16)

1.式(I)的化合物或其药物学上可接受的盐
其中每个n是0至2。
2.如权利要求1所述的化合物，其具有式(II)，或其药物学上可接受的盐
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药物学上可接受的盐，用作药物。
4.如权利要求1或2所述的化合物或其药物学上可接受的盐，用于治疗中。
5.如权利要求1或2所述的化合物或其药物学上可接受的盐，用作疫苗的佐剂。
6.如权利要求1或2所述的化合物或其药物学上可接受的盐，用于可以通过诱导Treg和/或Th1-型免疫应答和/或抑制Th2-型免疫应答来预防或治疗的病症的治疗中。
7.根据权利要求6的用于使用的化合物，其中所述病症是I型速发型特应性变态反应。
8.根据权利要求6或7的用于使用的化合物，其中所述病症选自
a)特应性湿疹/皮炎综合征(AEDS)，
b)过敏性哮喘，
c)过敏性鼻炎，
d)过敏性荨麻疹，
e)食物过敏，
f)毒液过敏，和
g)过敏性鼻结膜炎。
9.根据权利要求3至5任一项的用于使用的化合物，其中所述病症是传染病。
10.根据权利要求3至5任一项的用于使用的化合物，其中所述病症是癌症。
11.免疫刺激组合物，其包括一种或多种根据权利要求1的化合物和药物学上可接受的载体，所述载体优选选自经皮载体、经粘膜载体、口服载体、非肠道载体、用于储库制剂的载体和用于延迟释放制剂的载体。
12.如权利要求11所述的免疫刺激组合物，其中所述载体是用于舌下给药和/或含服的经粘膜载体。
13.如权利要求11或12所述的免疫刺激组合物，其中其进一步包括用于特异性过敏原免疫治疗的过敏原制剂；和/或另外的过敏或哮喘药物。
14.如权利要求11或12所述的免疫刺激组合物，其中其进一步包括用于对抗传染病的疫苗接种的微生物特异性抗原；和/或抗微生物剂。
15.如权利要求11或12所述的免疫刺激组合物，其中其进一步包括癌抗原，该癌抗原用于引发对抗表达所述抗原的癌细胞的特异性免疫应答；和/或癌症药物。
16.如权利要求1或2所述的化合物，用作食品添加剂或营养制剂。
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