KR20220084478A - 가시오가피 면역증강효과 성분을 함유하는 식품첨가제 - Google Patents
가시오가피 면역증강효과 성분을 함유하는 식품첨가제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다당체 가시오가피 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제 및 식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 가시오가피를 열수추출한 다음, 상기 열수추출물에 메탄올을 첨가하여 메탄올-불용성 잔사를 수득하고, 이를 증류수로 용해시킨후 에탄올을 첨가하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물로 조다당 획분을 제조한 후 염화나트륨을 이용하여 활성획분을 수득하는 것을 특징으로 하는 가시오가피 다당체 추출물을 함유하는 식품첨가제 및 식품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물은 점막 면역 증강 효과, 조혈세포의 증식 활성 효과, 종양전이 활성 억제효과 및 알러지 면역 반응 억제 효과를 나타내어 건강을 증진시킴으로써, 상기 가시오가피 다당체 추출물이 함유된 식품 및 식품첨가제를 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물은 점막 면역 증강 효과, 조혈세포의 증식 활성 효과, 종양전이 활성 억제효과 및 알러지 면역 반응 억제 효과를 나타내어 건강을 증진시킴으로써, 상기 가시오가피 다당체 추출물이 함유된 식품 및 식품첨가제를 제공하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 다당체 가시오가피 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제 및 식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 가시오가피를 열수추출한 다음, 상기 열수추출물에 메탄올을 첨가하여 메탄올-불용성 잔사를 수득하고, 이를 증류수로 용해시킨후 에탄올을 첨가하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물로 조다당 획분을 제조한 후 염화나트륨을 이용하여 활성획분을 수득하는 것을 특징으로 하는 가시오가피 다당체 추출물을 함유하는 식품첨가제 및 식품에 관한 것이다.
가시오가피(Acanthopanax Senticosus)는 라일라세에(Raliaceae)에 속하는 다년생 관목으로서 한반도, 시베리아, 중국 등지에서 자생하며 우리나라를 비롯한 동양에서는 그 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 한약제로 사용하여 왔다.
시베리아계 인삼(Siberian Ginseng)이라고 불리우는 가시오가피는 신체활력의 강화, 비장 및 신장의 강화의 목적으로 쓰이고 진정, 진통, 식욕부진이나 피로의 회복효능이 있는 것으로 입증되었다. 또한 중추신경계에 있어서 진정작용이 있으며 실험에 따라서는 진정과 흥분작용의 양면성을 나타내어 인삼과 같이 적응원(Adaptogen)의 성격을 보이나 그 작용기전에 있어서 상이함이 증명된 바 있다.
현재까지 가시오가피에 대한 출원은 주로 가시오가피의 배양방법, 대량생산방법이 대다수로 대표적으로 생물공학적인 기술에 의한 가시오가피 묘목의 대량생산방법(대한민국공개특허공보 제1999-0064391호), 체세포 배를 이용한 가시오가피의 번식방법(등록특허공보 제10-0257991호), 생물기 배양법에 의한 가시오가피 유식물체의 배양방법 및 그 용도(대한민국공개특허공보 제2001-0010217호) 등이 출원되어 있고, 다당체 가시오가피 추출물을 실제 이용할 수 있는 식품이나 약제에 적용하는 연구나 특허출원으로는 한국산 가시오가피에서 추출한 가시오가피추출물,단백질추출물,조단백다당류추출물을 유효성분으로하는 면역증강용 조성물 및 상기 면역증강용 조성물을 함유한 식품 또는 식품첨가제 및 약제조성물(등록특허공보 제10-0466735호)등이 개시되어 있다.
상기 등록특허공보 제10-0466735호에 따른 출원은 가시오가피 추출물의 제조방법 및 그에 따라 제조된 가시오가피 추출물을 함유한 면역증강용 조성물 등에 관한 것이나, 상기 가시오가피 추출물 및 이를 유효성분으로 하는 면역증강용 조성물은 대식세포를 직접 면역 자극하여 생리활성물질인 씨토킨(cytokine)의 유도체로의 활성이 있고, 자연살해세포를 활성화시키는 효과를 갖는 것 이외에는, 점막 경구 투여가 아닌 일반적인 전신적 면역법에 관한 것으로 조직 상해의 염증반응과 같은 비정상적인 면역반응을 유도하는 단점이 있고, 조혈세포의 증식능을 활성화시켜 원천적으로 면역세포의 분화를 증가시키는 기능은 하지 못한다.
그러나, 경구투여 또는 경비투여에 의한 점막 면역법은, 전신적주사에 의한 면역법에 비해, 상기의 비정상적인 면역반응의 유도를 억제하는 등 생체에 대한 안전성이 큰 것으로 알려져 있어 최근 많은 관심을 받고 있다. 이러한 점막 면역법은 전신면역법에 비해 점막계가 여러 병원균에 많은 노출을 받고 있으므로 여러가지 병원균에 대하여 국소적 혹은 전신적으로 방어력을 높일 수 있는 장점이 있다. 다시말해, 점막면역의 증진은 소화기관 내의 여러가지 병원균들 즉, 헬리코박터 파이로리, 비브리오 콜레라, 로타바이러스 및 호흡기를 통하여 감염을 일으키는 병원균들 즉, 마이코플라스마, 인플루엔자 바이러스 그리고 HIV와 같은 병원균을 포함하여 여러 질병에 대한 방어력을 제공해준다.
현재까지는 이러한 병원균에 대항하는 숙주의 작동기전이 점막기관에서 분비되는 분비형 면역글로불린에 의한 방어기전으로 설명되고 있다. 그러나 최근의 여러연구에서, 점막면역계를 구성하는 점막 CD8+ 독성 T 림포사이트, CD4+ 헬퍼 T세포 및 자연살해세포 등의 활성화에 따른 방어기전이 설명되고 있다. 즉, 경구를 통한 백신의 면역에 의하여, 국소적 점막계의 항원 특이적 면역증강효과, 전신적 면역계의 활성화 및 면역세포의 기억능의 유도 등과 같은 전형적인 획득면역계의 유도가 가능한 것으로 밝혀지고 있다.
점막면역법은 말초조직에서 T세포-매개 면역반응인 지연성과민반응 억제하는 기능을 가진다. 또한, 단백질 혹은 여러 항원에 있어서 DTH 또는 다른 알러지 반응을 억제하는 특성을 가진다. 경구투여되는 대부분의 경우, 항원에 대한 면역관용이 유도되지만, 어떤 경우에는 말초적인 부위에서의 면역관용이 있더라도, 국소적으로 항원에 대한 IgA가 생산되는 면역반응이 유도된다. 즉, TGF-b및 IL-4와 같이 점막면역의 유도에 관여하는 사이토카인(cytokines)은 점막의 표면으로부터 분비형 IgA를 생산하게 한다. 이러한 IgA는 호흡기, 소화기 및 비뇨생식기에 침입한 항원의 제거에 유효하게 사용될 수 있으며, 궁극적으로 점막 조직에 국한되는 면역반응으로 끝나는 것이 아니라, 항원에 대한 전신 면역반응을 유도함으로써 그 중요성이 더욱 부각되고 있다.
이러한 점막면역의 여러가지 장점에도 불구하고, 점막백신의 개발이 어려운 이유는 몇몇 경우를 제외하고는 경구적으로 투여한 항원을 유효하게 제거할 수 있는 특이적 IgA 항체 생산이 어려웠기 때문이다.
현재 경구용 백신의 개발을 위하여 극복해야 하는 것은 점막면역계에 항원에 대한 유효한 면역반응을 유도할 수 있는 항원의 전달방법이다. 항원을 점막면역계로 유효하게 전달하고 그에 대한 방어력을 획득할 수 있는 가장 중요한 면역법은 경구용 아쥬반트(adjuvant)의 개발이다.
현재 가장 활발하게 사용 혹은 연구되고 있는 점막 면역 증강제(adjuvant)는 박테리아 톡신 및 그 유도체, CpG DNA, 사이토카인, 또는 케모카인 및 항원 전달자로서의 바이러스 파티클을 예로 들 수 있다. 그러나 이들 역시 전신면역계에서 강한 염증반응을 유도한다는 부작용이 보고되고 있으므로 인간에게 적용될 수 있는 경구용 면역보조제, 식품 첨가제 및 식품의 개발은 시급하다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적이고 안전한 면역 증강제의 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 가시오가피로부터 분리한 다당체를 경구 또는 경비로 점막부위에 투여하면 점막 면역계를 구성하는 면역세포를 자극하고, 염증반응과 같은 비정상적 면역반응의 유도를 억제하며, 생체의 안전한 면역반응을 하는 면역세포로 분화되도록 조혈세포의 증식능을 활성화시켜 원천적인 면역능을 증강시키고, IgA 항체 생산능을 증가시킴으로써 특이적 항원에 대한 방어력을 유도한다는 것 뿐만아니라 항원에 대한 전신적 면역반응을 유도하는 IgG의 활성을 입증함으로써 상기 가시오가피 다당체 추출물을 함유하는 식품 첨가제 및 식품으로서의 유용성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 주된 목적은 점막 면역 증강 효과를 갖는 가시오가피 다당체 추출물을 함유하는 식품 첨가제 및 식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라비노오스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 람노오스(rhamnose), 및 갈락트로닉산(galacturonic acid)을 함유하는 가시오가피 다당체 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 및 식품 첨가제를 제공한다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 아라비노오스, 갈락토오스, 람노오스 및 갈락트로닉산을 함유하는 가시오가피 다당체 추출물을 유효량 함유하는 식품첨가제 및 식품을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따라 제조된 가시오가피 다당체 추출물은 경비투여에 의한 비정상적 염증반응의 유도를 억제하고, 점막 면역 증강효과, 조혈세포의 증식 활성 효과, 종양전이 활성 억제효과 및 IgE에 따른 알러지 면역 반응 억제 효과 뿐만아니라 점막 면역계의 IgA는 물론, 전신면역의 IgG 항체 생산능을 증진시킴으로써 전신면역 또한 증강시켜 건강에 이로운 식품 첨가제 및 식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물의 제조 공정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물의 시험관에서 직접 자극에 의한 조혈세포 증식 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물과 OVA(obalbumin)의 경구면역에 의한 IgA 생산 증진 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물과 OVA의 경구면역이 혈청 IgG 및 IgE의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 파이어스패치 세포(Peyer's patch cell)의 항원 OVA의 재자극에 의한 세포 증식 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물의 시험관에서 직접 자극에 의한 조혈세포 증식 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물과 OVA(obalbumin)의 경구면역에 의한 IgA 생산 증진 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 가시오가피 다당체 추출물과 OVA의 경구면역이 혈청 IgG 및 IgE의 생산에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 파이어스패치 세포(Peyer's patch cell)의 항원 OVA의 재자극에 의한 세포 증식 활성을 나타낸 것이다.
본 발명에 있어서, 아라비노오스 : 갈락토오스 : 람노오스 : 갈락트로닉산의 몰비가 0.2∼0.3 : 0.2∼0.3 : 0.1∼0.2 : 0.9∼1.1인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 가시오갈피 다당체 추출물은 다음의 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) 가시오갈피 시료에 증류수를 첨가하고 증류한 후 여과한 1차 여과액 및 잔사로 분리하고, 상기 분리된 잔사에 상기 과정을 반복하여 얻어진 여과액을 1차 여과액과 혼합하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 동결 건조하여 열수추출물을 제조하는 단계;
(b) 상기 열수추출물에 메탄올을 첨가하여 환류시킨 후 메탄올 가용성액을 분리하고 잔사에 다시 메탄올을 첨가하여 메탄올-가용성 획분과 메탄올-불용성 잔사로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 메탄올-불용성 잔사를 증류수로 용해시킨 후 에탄올을 첨가하고 교반하여 침전물과 에탄올 가용성 획분으로 분리하는 단계;
(d) 상기 에탄올 침전물을 증류수로 용해한 후 투석하고 원심분리하여 에탄올-불용성 물질을 분리한 후 동결건조하여 조다당 획분을 제조하는 단계;
(e) 상기 조다당 획분을 증류수로 평형화된 컬럼에 충전하고 증류수로 용출시켜 비흡착 획분을 얻은 후, 염화나트륨을 용출시키고 투석 및 동결건조하여 흡착획분을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 흡착획분을 충전한후 염화나트륨을 용출시켜 활성획분을 수득하는 단계.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 가시오가피 다당체 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다.
동결건조 후 파쇄한 가시오가피 시료에 증류수를 첨가하고, 물의 양이 첨가량의 반이 될 때까지 증류를 한 후 여과액과 잔사를 분리한다. 다시 잔사에 증류수를 첨가한 후 상기 과정을 반복하여 얻어진 여과액을 처음 여과액과 혼합하여 원심분리하여 불용성 물질을 완전히 제거한 후 동결건조를 통하여 열수추출물을 제조할 수 있다. 상기 열수추출물에 다시 메탄올을 첨가하여 1시간정도 환류시킨 후 메탄올 가용성액을 분리하고 잔사에는 다시 메탄올을 첨가하는 방법으로 메탄올-가용성 획분과 메탄올-불용성 잔사로 분리한다. 상기 분리된 메탄올-불용성 잔사는 증류수로 용해시킨 다음, 4배의 에탄올 첨가하여 12시간 정도 교반한 후 침전물과 에탄올 가용성 획분을 분리한다. 에탄올 침전물은 다시 증류수로 용해한 후 투석하고 원심분리로 불용성 물질을 분리해내고, 동결건조를 통해 고분자의 조다당 획분을 수득할수 있다.
상기 조다당 획분을 증류수로 평형화된 컬럼에 충전하고 증류수로 용출시켜 비흡착 획분을 얻는다. 다음으로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0과 2.0 M NaCl을 순차적으로 용출시켜 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0 및 2.0 M NaCl 용출획분에서 투석과 동결건조를 통해 7개의 흡착획분을 얻는다. 그 후, 상기 7개의 획분 중 0.5M NaCl의 획분을 컬럼에 충진한 후 0.2 M NaCl을 용출시켜 비활성획분 및 활성 획분으로 분리가능하면, 활성획분인 상기 가시오가피 다당체 추출물을 수득할 수 있다.
상기 제법으로 수득된 본 발명의 가시오가피 다당체 추출물을 경구투여 함으로써 점막 면역세포인 파이어스패치 세포의 비특이적 활성화 능력 및 조혈세포의 활성화 능력을 확인하였고, 경구투여에 의한 종양 억제효과를 확인할 수 있었다. 또한, 항원과 동시에 경구면역하였을 경우, 국소적 및 전신적인 면역세포의 자극능이 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 가시오가피 다당체 추출물은 항원과 동시에 경구면역 하였을 경우 항원 특이적인 IgA의 생산능과 IgG 항체 생산능이 증가된 결과를 얻음으로써 점막 면역 뿐만 아니라 경구투여에 의하여 전신적 면역능이 증진됨을 확인할 수 있었다.
이에 대한 증거로서 파이어스패치 세포를 항원으로 재자극시 항원 특이적인 면역세포의 활성화가 유도됨을 확인할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 가시오가피로부터 다당체 EN3.5-2의 제조
동결건조 후 파쇄한 가시오가피 시료 100 g에 증류수 2 L를 첨가한 후 물의 양이 첨가량의 반이 될 때까지 증류한 후 금속체로 여과액과 잔사를 분리하였다. 다시 잔사에 2 L의 증류수를 첨가한 후 이 과정을 반복하여 얻어진 여과액을 처음 여과액과 혼합하고 원심분리하여 불용성 물질을 완전히 제거한 후 동결건조를 통하여 열수추출물(이하 EN-0)을 조제하였다.
이와 같이 얻어진 EN-0을 메탄올 5 L를 첨가하여 1시간 정도 환류시킨 후 메탄올 가용성액을 분리하고 잔사에는 다시 메탄올을 첨가하는 방법으로 메탄올-가용성 획분을 조제하였다(이하 EN-1). 분리된 메탄올-불용성 잔사는 증류수로 용해시킨 후 4배의 에탄올 첨가한 후 12시간 정도 교반하여 침전물과 에탄올 가용성 획분을 분리하였다(이하 EN-2). 에탄올침전물은 다시 증류수로 용해한 후 투석하고 원심분리로 불용성 물질을 분리한 후 동결건조를 통하여 고분자의 조다당 획분으로 제조하였다(이하 EN-3).
즉, 조다당 획분 1 g을 증류수로 평형화된 DEAE-Sepharose CL-6B (Cl-형, 4.0×40 cm, Pharmacia) 컬럼에 충전하고 증류수로 용출시켜 비흡착 획분을 얻는다. (EN-3I, 수율; EN-3의 2.2%). 다음으로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0과 2.0 M NaCl을 순차적으로 용출시켜 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0 및 2.0 M NaCl 용출획분에서 투석과 동결건조를 EN3.1 - EN3.7까지의 7개의 흡착획분을 얻었다. 그 후, 다양한 면역활성을 보였던 EN3.5를 Sephacryl S-300 (3.0×90 cm, Pharmacia) 컬럼에 충진한 후 0.2 M NaCl를 용출시켜 비활성획분인 void volume 부근의 EN3.5-1과 활성 획분인 EN3.5-2로 분획하였다.
상기의 제법으로 수득된 본 발명의 가시오가피 다당체 추출물의 구성당을 조사하기 위하여 alditol acetate 유도체로 전환한 후 GC로 분석하였다. GC는 SP-2380 apillary 컬럼이 (0.2 ㎛ film, 0.25 mm i.d.×30 m, Supelco) 장착된 Hewlett-Packard 6890 II를 사용하였으며 온도변화는 다음과 같이 60℃, 1분; 60→220℃ (30℃/분); 220℃, 8분; 220℃→250℃(8℃/분); 250℃, 15분으로 진행하였다. 구성당의 molar ratio는 FID를 이용하여 피크면적과 response factor로부터 계산하였다.
점막면역 증강활성을 갖는 획분으로 분리된 EN3.5-2는 주요구성분으로서 62.4%의 산성당과 27.6%의 중성당 및 6.6%의 단백질로 구성되어져 주로 산성당을 구성당으로 포함하고 있는 특징을 보이있으며 공통적으로 산성당이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다(표 1). 상대적으로 활성획분에서 당의 함량이 상대적으로 높기 때문에 활성획분의 구성당을 비교한 결과, arabinose, galactose, rhamnose 및 galacturonic acid를 (molar ratio; 0.25 : 0.26 : 0.11 : 1.00) 주 구성당으로 하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 자극에 의한 조혈세포의 증식활성
마우스 대퇴부로부터 조혈세포를 멸균적으로 회수하고 96웰 배양플레이트(96-well culture plate)의 각 웰에 5 X 106 세포수를 넣고 시료로서 여러 농도로 조정된 EN3.5-2를 첨가하고 5일간 배양하였다. 배양 완료 후, 시료에 의한 골수세포의 증식활성은 XTT를 첨가하여 측정하였다. 즉, 배양완료 6시간 전에 XTT용액을 각 웰당 20 ml를 첨가하고 골수세포가 호흡효소와 XTT가 반응하여 생성된 수용성 포르마잔(formazan)의 정도를 450 nm에서 측정하였고 그 결과는 도 2에서와 같이 제시하였다. 그 결과, 본 발명인 EN3.5-2는 시험관에서 조혈세포의 증식을 유의하게 증가시키는 활성이 있었으며 그 활성은 조추출물에 비하여 약 300 배 정도 높은 활성을 그리고 EN3.5에 비하여는 2배 이상의 높은 활성을 보였다.
실시예 3: EN3.5-2의 파이어스패치 세포 경유 조혈세포의 증식 활성
본 연구에서는 Peyer's patch 세포를 매개로 한 골수세포 증식활성의 유도능을 조사하기 위하여 EN3로부터 각 분획 성분을 실험에 적용하였다. 골수세포의 증식활성을 조사하기 위한 실험은 다음과 같이 수행하였다. 즉, Peyer's patch 세포배양 상등액의 조제는 LPS 비의존성인 C3H/He 마우스의 소장을 채취하고 소장벽의 Peyer's patch를 잘라 차가운 RPMI-1640 medium이 있는 페트리디쉬에 이동시킨 후 Peyer's patch를 분쇄하여 세포를 방출한 후, medium으로 3회 세정하였다. 세포농도를 2×106 cells/mL RPMI-1640으로 조정, 200 ㎕씩을 96 well plate에 분주하고, 각 시료를 10 mg/ml의 농도가 되도록 조정하여 첨가 후 37℃에서 5일간 5% CO2 배양기에서 배양하여 상등액을 회수하여 이 상등액을 골수세포 증식활성측정용 세포배양 상등액으로 사용하였다. 한편, 골수세포의 조제는 동일 mouse의 정강이 뼈로부터 RPMI-1640 medium을 주입하면서 골수세포를 회수하고 상기와 같이 여과, 세정하고 2.5×105 cells/mL RPMI-1640으로 조정하였다. 골수세포 증식도의 측정은 Alamar Blue 환원측정법을 사용하는데 조정된 골수세포액 100 ㎕씩을 96 well plate에 분주한 후 Peyer's patch 세포로부터 얻은 세포배양 상등액 및 RPMI-1640 medium 50 ㎕와 함께 37℃에서 6일간 배양하였다. 배양 종료 5시간 전에 Alamar Blue 용액 20㎕를 첨가하고 Fluoroskan II를 이용하여 형광세기를 excitation 544 nm와 emission 590 nm에서 측정하였다. 시료의 골수세포 증식촉진활성은 대조구와의 차이로부터 골수세포의 증식도를 정량하였다. 실험결과 EN3로부터 분리한 각 분획을 조사한 결과 EN3.5가 가장 높은 활성을 보였으며 EN3.5로부터 분리된 EN3.5-2가 유의적으로 가장 높은 골수세포 증식활성을 (대조군의 1.9배) 나타내었고 나머지 EN3.5-1의 획분은 약한 활성을 (1.3배) 보여주었다. (표 2)
실시예 4: EN3.5-2 경구투여에 의한 종양전이 억제 활성
본 발명인 EN3.5-2의 경구투여에 의한 비특이적 면역자극활성의 조사는 colon 26-M3.1 carcinoma 주를 이용하는 실험동물 종양전이 모델에서의 항종양 활성을 측정하였다. 실험 동물로 Balb/c 마우스를 사용하였으며, 종양의 전이를 위한 접종은 2.7×104의 colon 26-M3.1 carcinoma 세포를 정맥주사 (i.v.) 하였다. 14일 후에 마우스를 희생시키고 종양의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정시킨 후 종양의 군집 수를 측정하였다. 본 발명에 의한 항종양전이 효과를 조사하기 위하여 종양접종 전 5, 3, 1일 전에 1 mg의 EN3, EN3.5-1 및 EN3.5-2를 경구투여 하였다. 그 결과, EN-3 및 EN3.5-2의 경우는 각각 35% 및 46%의 유의한 항종양 효과가 인정되었으나 EN3.5-1의 경우는 유의한 결과가 나오지 않아 본 발명인 EN3.5-2의 경우 EN3로부터 경구투여에 의한 전신적으로 비특이적 면역자극능이 이행되었다고 판단된다(표 3).
실시예 5: EN3.5-2 및 오브알부민의 경구면역에 의한 장관 내용물의 IgA의 제조
항원과 함께 EN3.5-2를 경구투여시 항원에 대한 점막면역능이 증진되는지 확인하기 위하여 동물시험을 실시하였다. 실험에 사용된 실험동물은 6주령의 balb/c 마우스를 사용하였고, 항원으로는 오브알부민(obalbumin; OVA)을 사용하였다.
즉, 100 ug의 OVA와 1 mg의 EN3.5-2를 생리식염수(PBS)에 0.2 ml에 녹인 후 군당 5마리의 마우스에 면역하였다. 대조군으로 OVA 및 EN3.5-2 단독을 경구투여 하였으며 정상마우스를 이용하였다. 항체생산을 위한 면역은 1주일 간격으로 3회 면역하였으며 최종면역 3일 후에 항체가를 측정하였다. EN3.5-2의 경구투여에 의한 점막면역능의 증진 효과는 소장 내용물 및 혈청에 존재하는 IgA의 항체가를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법으로 측정하였다. 실험결과도 3에서 보는 바와 같이, 항원 OVA와 EN3.5-2를 동시에 면역한 경우 대조군에 비하여 유의하게 높은 항체가 생성 결과를 얻음으로써, EN3.5-2의 경구투여는 점막기관의 약성면역기구인 IgA의 생산 증진 활성을 갖고있음을 확인시켜 주었다.
실시예 6: EN3.5-2 및 오브알부민의 경구면역에 의한 혈중 IgG의 제조
실시예 5에서 실시한 마우스의 혈청으로부터 OVA 특이적인 항체가를 500배 희석된 혈청을 이용하여 조사한 바, 실시예5의 결과(도 3 참고)와 동일한 경향의 IgG 생산능을 보였다. 본 실험에 적용한 항원이 OVA는 강한 알러젠(allergen)으로 알려져 있다. 따라서 항원과 동시에 면역한 EN3.5-2에 의하여, 알러지 유도와 관련있는 항체 IgE의 생산에 미치는 효과를 검토하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 혈청내의 OVA에 대한 IgE의 생산은 유의하게 감소된 결과를 얻었다.
실시예 7: EN3.5-2 및 오브알부민의 경구면역에 의한 파이어스패치 세포의 증식활성
실시예 5의 실험에 적용한 마우스로부터 Peyer'patch cell을 취하여 96웰 배양플레이트(96-well culture plate)의 각 웰에 2.5 X 106 세포수를 넣고 여러 농도로 조정된 OVA로 3일동안 재자극하였다. 배양 종료 5시간 전에 Alamar Blue 용액20㎕를 첨가하고 세포의 증식활성은 세포가 흡수한 형광물질의 형광세기를 excitation 544 nm와 emission 590 nm에서 측정하였다. 대조군으로는 5 mg/ml의 LPS로 자극하였다. 실험결과 도 5에서 보는 바와 같이, 항원 OVA로 재자극이 일어난 세포의 군은 항원 OVA와 EN3.5-2를 동시에 면역한 군에서만 유의하게 일어났으며 재자극된 정도는 점막면역능을 증진시키는 adjuvant인 EN3.5-2의 농도에 의존적인 결과를 보였다. 따라서 EN3.5-2의 경구투여는 항원에 대한 세포 증식활성을 높이는 결과를 보임으로써, 상기 면역반응인 점막계의 IgA 및 전신계의 IgG 항체 생산능을 증진시킨다는 결과를 지지해주었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 아라비노오스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 람노오스(rhamnose), 및 갈락트로닉산(galacturonic acid)을 함유하는 가시오가피 다당체 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제.
- 아라비노오스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 람노오스(rhamnose), 및 갈락트로닉산(galacturonic acid)을 함유하는 가시오갈피 다당체 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품.
- 제1항에 있어서, 아라비노오스 : 갈락토오스 : 람노오스 : 갈락트로닉산의 몰비가 0.2∼0.3 : 0.2∼0.3 : 0.1∼0.2 : 0.9∼1.1인 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
- 제2항에 있어서, 아라비노오스 : 갈락토오스 : 람노오스 : 갈락트로닉산의 몰비가 0.2∼0.3 : 0.2∼0.3 : 0.1∼0.2 : 0.9∼1.1인 것을 특징으로 하는 식품.
- 제1항에 있어서, 상기 가시오가피 추출물은 다음의 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
(a) 가시오갈피 시료에 증류수를 첨가하고 증류한 후 여과한 1차 여과액 및 잔사로 분리하고, 상기 분리된 잔사에 상기 과정을 반복하여 얻어진 여과액을 1차 여과액과 혼합하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 동결 건조하여 열수추출물을 제조하는 단계;
(b) 상기 열수추출물에 메탄올을 첨가하여 환류시킨 후 메탄올 가용성액을 분리하고 잔사에 다시 메탄올을 첨가하여 메탄올-가용성 획분과 메탄올-불용성 잔사로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 메탄올-불용성 잔사를 증류수로 용해시킨 후 에탄올을 첨가하고 교반하여 침전물과 에탄올 가용성 획분으로 분리하는 단계;
(d) 상기 에탄올 침전물을 증류수로 용해한 후 투석하고 원심분리하여 에탄올-불용성 물질을 분리한 후 동결건조하여 조다당 획분을 제조하는 단계;
(e) 상기 조다당 획분을 증류수로 평형화된 컬럼에 충전하고 증류수로 용출시켜 비흡착 획분을 얻은 후, 염화나트륨을 용출시키고 투석 및 동결건조하여 흡착획분을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 흡착획분을 충전한후 염화나트륨을 용출시켜 활성획분을 수득하는 단계. - 제2항에 있어서, 상기 가시오가피 추출물은 다음의 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 식품.
(a) 가시오갈피 시료에 증류수를 첨가하고 증류한 후 여과한 1차 여과액 및 잔사로 분리하고, 상기 분리된 잔사에 상기 과정을 반복하여 얻어진 여과액을 1차 여과액과 혼합하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 동결 건조하여 열수추출물을 제조하는 단계;
(b) 상기 열수추출물에 메탄올을 첨가하여 환류시킨 후 메탄올 가용성액을 분리하고 잔사에 다시 메탄올을 첨가하여 메탄올-가용성 획분과 메탄올-불용성 잔사로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 메탄올-불용성 잔사를 증류수로 용해시킨 후 에탄올을 첨가하고 교반하여 침전물과 에탄올 가용성 획분으로 분리하는 단계;
(d) 상기 에탄올 침전물을 증류수로 용해한 후 투석하고 원심분리하여 에탄올-불용성 물질을 분리한 후 동결건조하여 조다당 획분을 제조하는 단계;
(e) 상기 조다당 획분을 증류수로 평형화된 컬럼에 충전하고 증류수로 용출시켜 비흡착 획분을 얻은 후, 염화나트륨을 용출시키고 투석 및 동결건조하여 흡착획분을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 흡착획분을 충전한후 염화나트륨을 용출시켜 활성획분을 수득하는 단계.
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