CN108707663A - 用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂及其制备方法和应用。本申请的试剂包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA中的至少一种。本申请的试剂，将其定量的加入待测RNA样品中，并通过测序定量分析所加入的试剂的量，将定量分析结果与实际加入量进行比较，以此评价整个miRNA测序定量结果的准确性和可靠性；该方法简便、易用，能够有效的评价miRNA测序定量结果的可信度。本申请的试剂各方面特性都与真实的miRNA十分接近，因此，采用本申请的试剂能够更真实、准确、可靠的反映人源miRNA测序定量结果的实际情况，从而对癌症样本miRNA测序定量结果作出更准确、可靠的评价。

Description

用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂、制备方法和 应用

技术领域

本申请涉及miRNA测序定量检测领域，特别是涉及一种用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂及其制备方法应用。

背景技术

Small RNA是生物体内一类重要的功能分子，通过各种序列特异性的基因沉默作用，调控诸如细胞生长发育、应激反应、沉默转座子等各种各样的细胞生理过程。

Small RNA测序则是借助新一代高通量测序技术，对某物种某组织在特定状态下的18-30nt的small RNA进行高通量测序。继而通过数据库比对，对获得的small RNA序列进行分析、鉴定，将数百万条small RNA序列分类成rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和miRNA等。

成熟的miRNA通过翻译抑制或增强mRNA降解来调控基因表达。许多miRNA都位于不同类型癌症中删除或扩增的基因组区域，在大部分癌症类型中都观察到miRNA表达水平的整体下降。癌症研究中miRNA的研究大致可分为两大类：第一类是发现癌症发展中起作用的miRNA并注释功能；第二类是miRNA作为癌症检测和分期标志物的潜在应用研究，以此改善癌症的诊断和治疗。

容易测定、相对稳定、对mRNA具有调控作用，这些特点让miRNA有潜力成为癌症的标志物，但任何新发现的候选miRNA想要成为合格的生物标志物，都还有很长的路要走。迄今为止，miRNA作为生物标志物的研究仍处于生物标志物发现的极早期阶段，因此，评价miRNA测序数据的真实性和准确性就显得尤为重要。

随着高通量测序技术的普及和发展，small RNA文库的制备和测序已成为常规实验方法。但值得注意的是，其定量结果的可靠性一直广受质疑。从获得生物学样本到RNA的提取、建库和测序，miRNA经历了复杂的处理过程，这些处理过程都有可能为最终的测序结果引入相应偏差，直接影响分析结果的准确性。

2014年，Pieter Mestdagh等研究人员曾撰文讨论，认为miRNA测序结果可重复性较差，且不同的建库方法有可能导致分析结果出现显著差异。因此，亟需引入一种实验方法对miRNA测序结果进行客观评估，从而指导实验人员确认分析结果的准确性和可靠性。

现阶段，没有任何成熟的技术对miRNA测序结果给出快速、客观的评价。在癌症相关研究中，一般要求实验应当包含足够数量的样品，以建立统计学可信度；即通过测序分析获得差异表达的miRNA后，通常需要大量患者样本来检验此结果，以此建立统计学可信度。现有的评估方案在应用中存在多种局限。无法对测序数据提供实时的评价，且需要耗费大量实验资源和时间。目前对于在测序研究中建立统计学可信度和多重检验纠正，还没有公认的方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂，该试剂的制备方法，以及该试剂的应用。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请一方面公开了一种用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂，该试剂包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA中的至少一种；

SEQ ID NO.1：5’-GAGCCAUGCAUUAUAUGCCAG-3’

SEQ ID NO.2：5’-UAUGCCAGAAGUCUCACGGCC-3’

SEQ ID NO.3：5’-CCUAACGUGCCUAUGCGCAGAA-3’

SEQ ID NO.4：5’-UGCGCAGACAUAAAAGCGAU-3’

SEQ ID NO.5：5’-AAGCGAUUACGACAUUAGGAU-3’

SEQ ID NO.6：5’-AUGUGAAUGACCGGUACCCA-3’

SEQ ID NO.7：5’-GUACCCAUGUGAAGAUCGCGCU-3’

SEQ ID NO.8：5’-UAUUGAUCGCGCUGAGCCAUG-3’。

需要说明的是，本申请的试剂在使用时，将其作为外源的已知序列的small RNA(Small RNA Spike-in mix，缩写SRS)定量的加入待测RNA样品中，与待测RNA样品一起进行建库和测序，通过测序定量检测所添加的SRS量，与实际加入的SRS量进行比较，从而分析判断miRNA测序定量检测结果与实际含量之间的差距，以此评价癌症样本miRNA测序定量结果。

还需要说明的是，本申请的试剂中，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA都是经过严格筛选和设计的RNA短序列，这些序列的特性，例如长度、GC％分布、最低自由能MFE以及首位及末位碱基分布等，都与真实miRNA十分接近，因此，基于外源SRS的测序定量结果评价能够真实、准确、可靠的反映人源miRNA测序定量结果的实际情况，从而对癌症样本miRNA测序定量结果作出准确的评价。

本申请的另一面公开了本申请的试剂的制备方法，包括以下步骤，

(1)从miRNA公共数据库中导出人源miRNA的所有序列，统计其长度分布和GC％分布；

(2)随机生成一系列设定长度的RNA短序列，并从随机生成的RNA短序列中筛选出长度分布和GC％分布分别落在步骤(1)统计的长度分布和GC％分布统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第一短序列集合；

(3)将第一短序列集合中的所有RNA序列分别与人类基因组和miRNA公共数据库进行比对，将能够比对匹配上的RNA序列删除，剩余的RNA序列作为第二短序列集合；需要说明的是，该步骤的目的是删除随机RNA短序列与人类基因组或者miRNA公共数据库中重合的RNA序列，确保随机RNA短序列的唯一性，以保障其作为外源RNA引入待测RNA样品的理论含量，即保障加入的外源RNA的量的准确性；

(4)计算步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的最低自由能MFE，并统计MFE分布；

(5)计算步骤(3)获得的第二短序列集合中所有RNA序列的MFE，并筛选出RNA序列的MFE落在步骤(4)统计的人源miRNA的MFE统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第三短序列集合；

(6)统计步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的首位及末位碱基分布，统计第三短序列集合中所有RNA序列的首位及末位碱基分布，并筛选出RNA序列的首位及末位碱基分布与人源miRNA的首位及末位碱基分布一致的RNA序列，即获得SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA，合成筛选获得的随机RNA即得到本申请的试剂。

需要说明的是，本申请的试剂主要是用于评价癌症样本miRNA测序定量结果，因此，在设计时尽可能使试剂中各随机RNA短序列尽量的与真实的miRNA相近似，例如长度、GC％分布、最低自由能MFE以及首位及末位碱基分布等，这样才能使随机RNA短序列尽可能真实的模拟并反映人源miRNA的实际情况。

还需要说明的是，研究证实，首位及末位碱基分布会影响small RNA文库构建时，接头连接的效率，从而对测序数据产生偏向。因此，本申请的制备方法中，对作为SRS的随机合成RNA序列的首位及末位碱基分布进行了筛选，即步骤(6)，使其尽量符合人源miRNA的首位及末位碱基分布。实际上，本申请的制备方法中，所有步骤的筛选，其目的都是一致的，即使得最终获得的作为SRS的随机合成RNA序列能够更真实的模拟人源miRNA，从而使得SRS的整个建库、测序过程与真实的人源miRNA更接近，进而达到准确评价癌症样本miRNA测序定量结果的目的。

优选的，本申请的试剂的制备方法中，其步骤(2)中，设定长度为20-22nt。

需要说明的是，设定长度一般是能够涵盖大部分人源miRNA的长度范围，但是，设定长度范围越大，随机生成的RNA量越大，后续筛选的计算量也越大，因此，为方便后续的筛选，本申请的一种优选方案中设定长度为20-22nt。

优选的，本申请的试剂的制备方法中，其步骤(1)中，miRNA公共数据库为miRBase数据库。

需要说明的是，miRBase数据库是目前比较完善的miRNA公共数据库，不排除还可以采用其它数据库，又或者在这些数据库的基础上进一步添加一些本地数据，使得最终筛选获得的随机RNA与实际样本的miRNA的特性更接近。

优选的，本申请的试剂的制备方法中，其步骤(4)和步骤(5)中，MFE采用RNAfold计算。

需要说明的是，RNAfold是已经存在的软件，经常用于预测miRNA与靶基因的互相作用；本申请用于预测人源miRNA的二级结构，并计算人源miRNA的MFE值，同时对随机RNA短序列的二级结构和MFE值进行预测和计算，筛选MFE值落在人源miRNA的MFE统计值上下四分位数间的随机RNA序列，作为本申请的SRS，用于癌症样本miRNA测序定量结果评价。本申请创造性的采用RNAfold进行MFE值计算，并以此进行筛选，使得筛选获得的SRS的特征更贴近真实的miRNA。

需要补充说明的是，理论上来说，二级结构的形成会影响RNA的建库效率，如果筛选获得的SRS其二级结构和MFE值能够更贴近真实的miRNA，则SRS能更准确和真实的模拟真实miRNA的建库过程，进而使得基于SRS的测序定量结果评价能够更真实、准确、可靠的反映人源miRNA测序定量结果的实际情况。当然，不排除还可以采用其它软件进行MFE计算，但是，RNAfold作为一款比较成熟和常规使用的软件，其MFE计算具有更广泛的适应性和可靠性。

本申请的再一面公开了本申请的试剂在癌症样本miRNA测序定量结果评价、癌症样本miRNA测序质量分析或靶标miRNA定量检测中的应用。

需要说明的是，本申请的试剂不仅可以用于癌症样本miRNA测序定量结果评价；可以理解，通过比较测序定量检测所添加的SRS量，与实际加入的SRS量，还可以判断整个癌症样本miRNA测序质量，例如测序定量检测的SRS量与实际加入的SRS量相符或者差别很小，则可以认为测序质量高，相应的测序定量结果也可以认为更准确、可靠。至于靶标miRNA定量检测，可以通过添加浓度梯度的SRS制作标准曲线来实现，其定量的思路类似于实时荧光定量PCR通过标准曲线进行定量。

本申请的再一面公开了一种评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法，包括在待测RNA样品中定量加入合成的已知序列的small RNA作为参考样品，将待测RNA样品和参考样品的混合样品用于建库和测序，通过测序定量分析混合样品中已知序列的small RNA的含量，并将该测序定量分析结果与实际加入待测RNA样品中的已知序列的small RNA的量进行比较，以此评价癌症样本miRNA测序定量结果的准确性。

需要说明的是，本申请评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法，在待测RNA样品中加入确定含量的已知序列small RNA作为参考样品，在本申请的一种优选实现方式中，所添加的已知序列small RNA就是本申请的试剂，最后，通过测序定量分析所加入的已知small RNA，比较测序定量结果分析的已知small RNA的量，与实际加入的量，则可以判断整个癌症样本miRNA测序定量结果的准确性。本申请的方法不仅可以定量分析癌症样本miRNA测序定量结果的准确性，而且，还可以通过添加浓度梯度的已知small RNA制作标准曲线，以此对靶标miRNA进行绝对定量，进一步提高组内、组间分析的准确度；又或者，结合mRNA-Seq的数据，则提供了一种高效的数据均一化工具，对于在分子水平上理解miRNA与其靶向RNA的相互作用机制提供重要依据。

优选的，本申请评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法中，参考样品的smallRNA采用以下方法获得，

(1)从miRNA公共数据库中导出人源miRNA的所有序列，统计其长度分布和GC％分布；

(2)随机生成一系列设定长度的RNA短序列，并从随机生成的RNA短序列中筛选出长度分布和GC％分布分别落在步骤(1)统计的长度分布和GC％分布统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第一短序列集合；其中，设定长度一般是能够涵盖大部分人源miRNA的长度范围，以方便后续的筛选，本申请的一种优选方案中设定长度为20-22nt；

(3)将第一短序列集合中的所有RNA序列分别与人类基因组和miRNA公共数据库进行比对，将能够比对匹配上的RNA序列删除，剩余的RNA序列作为第二短序列集合；需要说明的是，该步骤的目的是删除随机RNA短序列与人类基因组或者miRNA公共数据库中重合的RNA序列，确保随机RNA短序列的唯一性，以保障其作为外源RNA引入待测RNA样品的理论含量，即保障加入的外源RNA的量的准确性；

(4)计算步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的最低自由能MFE，并统计MFE分布；

(5)计算步骤(3)获得的第二短序列集合中所有RNA序列的MFE，并筛选出RNA序列的MFE落在步骤(4)统计的人源miRNA的MFE统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第三短序列集合；

(6)统计步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的首位及末位碱基分布，统计第三短序列集合中所有RNA序列的首位及末位碱基分布，并筛选出RNA序列的首位及末位碱基分布与人源miRNA的首位及末位碱基分布一致的RNA序列，作为参考样品的small RNA。

需要说明的是，作为外源RNA加入到待测RNA样品中的已知small RNA参考样品，虽然原则上只要这些已知small RNA不与人源miRNA重叠即可；但是，为了进一步确保测序定量结果评价的准确性和可靠性，本申请优选的方案中，对作为参考样品的已知small RNA进行了特别设计，例如从长度、GC％分布、最低自由能MFE以及首位及末位碱基分布等各方面对人源miRNA进行模拟，使得随机生成的外源small RNA尽可能与真实的人源miRNA相接近，从而使得基于外源small RNA的测序定量结果评价能够更真实、准确、可靠的反映人源miRNA的实际情况。

优选的，本申请评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法，在获得参考样品的small RNA的步骤中，其步骤(2)中，设定长度为20-22nt。

优选的，在获得参考样品的small RNA的步骤中，其步骤(1)中，miRNA公共数据库为miRBase数据库。

优选的，在获得参考样品的small RNA的步骤中，其步骤(4)和步骤(5)中，MFE采用RNAfold计算。

优选的，本申请评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法中，参考样品的smallRNA为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA中的至少一种；

SEQ ID NO.1：5’-GAGCCAUGCAUUAUAUGCCAG-3’

SEQ ID NO.2：5’-UAUGCCAGAAGUCUCACGGCC-3’

SEQ ID NO.3：5’-CCUAACGUGCCUAUGCGCAGAA-3’

SEQ ID NO.4：5’-UGCGCAGACAUAAAAGCGAU-3’

SEQ ID NO.5：5’-AAGCGAUUACGACAUUAGGAU-3’

SEQ ID NO.6：5’-AUGUGAAUGACCGGUACCCA-3’

SEQ ID NO.7：5’-GUACCCAUGUGAAGAUCGCGCU-3’

SEQ ID NO.8：5’-UAUUGAUCGCGCUGAGCCAUG-3’。

本申请的有益效果在于：

本申请用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂，将其定量的加入待测RNA样品中，并通过测序定量分析所加入的试剂的量，将定量分析结果与实际加入量进行比较，以此评价整个miRNA测序定量结果的准确性和可靠性；该方法简便、易用，能够有效的评价miRNA测序定量结果的可信度。本申请的试剂各方面特性都与真实的miRNA十分接近，因此，采用本申请的试剂能够更真实、准确、可靠的反映人源miRNA测序定量结果的实际情况，从而对癌症样本miRNA测序定量结果作出更真实、准确、可靠的评价。

附图说明

图1是本申请实施例中评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法和应用流程图；

图2是本申请实施例中人源miRNA与SRS mix的长度分布统计的比较结果图；

图3是本申请实施例中人源miRNA与SRS mix的GC％分布统计的比较结果图；

图4是本申请实施例中人源miRNA与SRS mix的MFE分布统计的比较结果图；

图5是本申请实施例中人源miRNA与SRS mix的首位、末位碱基分布统计的比较结果图；

图6是本申请实施例中在进行测序定量结果评价之前miRNA测序定量结果与QPCR定量检测结果之间的相关性分析结果；

图7是本申请实施例中采用评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法对一个测序样品中的测序定量分析的SRS mix含量与实际加入的SRS mix含量的相关性分析结果；

图8是本申请实施例中采用评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法对另一个测序样品中的测序定量分析的SRS mix含量与实际加入的SRS mix含量的相关性分析结果；

图9是本申请实施例中采用评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法对另一个测序样品中的测序定量分析的SRS mix含量与实际加入的SRS mix含量的相关性分析结果；

图10是本申请实施例中采用评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法进行评价并纠正后的miRNA测序定量结果与QPCR定量检测结果之间的相关性分析结果。

具体实施方式

目前尚没有任何比较成熟的对miRNA测序定量结果进行快速、客观评价的方法；虽然在癌症研究中，可以采用足够数量的样品来建立统计学可信度；但是，一方面，这需要大量的患者样品，另一方面，需要耗费大量的人力、物力和时间；并且，更为重要的是，通过大量样品建立统计学可信度的方法，并不能对miRNA测序本身进行评价。

基于以上问题，本申请创造性的提出了一种新的评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法和试剂。本申请的试剂中，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA，其特性，例如长度、GC％分布、最低自由能MFE以及首位及末位碱基分布等，都与真实miRNA十分接近，因此，能够真实的模拟真实miRNA的建库、测序和测序定量分析，使得采用本申请的试剂进行的癌症样本miRNA测序定量结果评价能够更真实、准确、可靠的反映人源miRNA测序定量结果的实际情况，从而能够对癌症样本miRNA测序定量结果作出更真实、准确、可靠的评价。

本申请评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法，在待测RNA样品中加入设定含量的已知small RNA，在本申请的一种优选实现方式中，所添加的已知序列small RNA就是本申请的试剂，已知small RNA混合在待测RNA样品中，与之一起进行建库、测序，通过测序定量分析已知small RNA的量，将该测序定量获得的已知small RNA含量，与实际加入的已知small RNA量进行比较，以此评价测序定量结果的准确性和可靠性。在实际应用中，本申请添加的已知small RNA仅占用低于1％的测序数据，可以评价miRNA测序定量结果的可信度。

并且，还可以做进一步的延伸利用，例如通过外源已知small RNA浓度梯度制作标准曲线，对靶标miRNA进行绝对定量，进一步提高组内、组间分析的准确度；又或者，结合mRNA-Seq的数据，则提供了一种高效的数据均一化工具，对于在分子水平上理解miRNA与其靶向RNA的相互作用机制提供重要依据。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例首先设计并合成了评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法中所使用的作为参考样品的已知序列的small RNA，即本例的用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂，然后在待测RNA样品中添加外源的已知small RNA(Small RNA Spike-in mix，缩写SRS)，并通过SRS的测序结果分析，判断miRNA测序定量结果的可靠性。具体如下：

一、SRS的设计

(1)导出miRNA公共数据库miRBase中人源miRNA的所有序列，统计其长度分布、GC％分布；其中，miRBase网址为http://www.mirbase.org/。

(2)根据步骤一的统计结果，随机生成一系列20-22nt的RNA短序列，并筛选出长度分布与GC％落在步骤(1)统计的长度分布和GC％分布统计值上下四分位数间的随机RNA序列，作为第一短序列集合。

(3)将第一短序列集合中的所有RNA序列分别比对到人基因组和miRBase，并将能比对到人基因组或miRBase的随机RNA短序列删除，得到第二短序列集合。

(4)采用工具RNAfold计算步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的最低自由能MFE，并统计MFE分布；

RNAfold网址http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi。

(5)计算步骤(3)获得的第二短序列集合中所有RNA序列的MFE，并筛选出RNA序列的MFE落在步骤(4)统计的人源miRNA的MFE统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第三短序列集合。

(6)统计步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的首位及末位碱基分布，统计第三短序列集合中所有RNA序列的首位及末位碱基分布，并筛选出RNA序列的首位及末位碱基分布与人源miRNA的首位及末位碱基分布一致的RNA序列，作为参考样品的small RNA。

本例作为参考样品的small RNA结果如表1所示。

表1外源small RNA及其配比

按照表1所示结果合成外源small RNA，并按照表1的比例进行稀释，混合得到SRSmix待用，即本例的用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂。

对步骤(6)获得的参考样品的small RNA即SRS mix的序列进行长度分布统计、GC％分布统计、MFE分布统计，以及首位及末位碱基分布统计，将统计结果与人源miRNA的统计结果相比较，结果如图2至图5所示。图2是人源miRNA与SRS mix的长度分布统计的比较结果图，其中，纵坐标是RNA长度。图3是人源miRNA与SRS mix的GC％分布统计的比较结果图，其中，纵坐标是RNA的GC％含量。图4是人源miRNA与SRS mix的MFE分布统计的比较结果图，其中，纵坐标是RNAfold计算的MFE值。图5是人源miRNA与SRS mix的首位、末位碱基分布统计的比较结果图，其中，miRBase_first是指人源miRNA中首位碱基的分布统计结果柱图，柱图中由下到上依序为首位碱基为A的百分比、首位碱基为C的百分比、首位碱基为G的百分比、首位碱基为U的百分比；SRS_first是指SRS mix中首位碱基的分布统计结果柱图，柱图中由下到上依序为首位碱基为A的百分比、首位碱基为C的百分比、首位碱基为G的百分比、首位碱基为U的百分比；miRBase_last是指人源miRNA中末位碱基的分布统计结果柱图，柱图中由下到上依序为末位碱基为A的百分比、末位碱基为C的百分比、末位碱基为G的百分比、末位碱基为U的百分比；SRS_last是指SRS mix中末位碱基的分布统计结果柱图，柱图中由下到上依序为末位碱基为A的百分比、末位碱基为C的百分比、末位碱基为G的百分比、末位碱基为U的百分比。

图2至图5的结果显示，本例的SRS mix中各随机RNA短序列，其长度分布、GC％分布、MFE分布，以及首位及末位碱基分布，都与人源miRNA极其相似，作为参考样品时能够真实有效的反映miRNA的实际情况。

试验例

深圳华大基因股份有限公司通过small RNA测序的方法展开前列腺癌发生机制的研究，但样品鉴定到的miRNA测序定量结果与QPCR定量检测结果一致性较低，R²仅为0.428，如图6所示。其中，miRNA测序定量采用BGISEQ-500测序平台进行；QPCR使用MicroRNA Assays(Thermofisher Scientific,part No.4440888)，QPCR检测按照试剂盒标准操作规程进行。

QPCR定量检测是目前认为比较成熟，且稳定的定量检测方法，miRNA测序定量结果与QPCR定量检测结果一致性低，说明miRNA测序定量结果，或者说miRNA测序检测存在问题。

经分析认为，small RNA建库过程中所使用的RNA连接酶部分失活，是造成实验结果显著偏向的原因，但使用现有数据和技术方法无法证实这种猜测。因此采用本例的SRSmix，将其加入实验材料total RNA中，分别采用前列腺癌发生机制研究中使用的三个RNA连接酶进行建库，然后分别进行测序定量分析，在其它试剂和条件都相同的情况下，通过SRSmix对待测small RNA样本的测序定量结果进行评价，以检测RNA连接酶是否会对实验数据及分析结果产生影响。

整个检测方法如图1所示，具体包括以下步骤：

(1)取实验材料total RNA 1μg，并掺入SRS mix；

(2)对混合后的RNA进行small RNA文库构建。主要步骤包括：使用PAGE凝胶电泳回收18-30nt small RNA片段、分别连接3’接头和5’接头、反转录并扩增得到small RNA文库；其中，3’接头和5’接头为BGISEQ-500测序平台常规使用的接头，PAGE凝胶电泳回收和反转录参考常规试验方法，文库构建参考BGISEQ-500测序平台的文库构建，在此不累述；

(3)采用BGISEQ-500测序平台进行测序，并基于cPAS技术读取序列碱基信息；

(4)对测序数据进行常规的过滤后，将测序结果与SRS mix的各随机RNA短序列进行比对，获得SRS mix的测序结果，即SRS tags；

(5)统计SRS tags数目，并计算测序定量结果与各随机RNA短序列添加的实际浓度的相关性；得到RNA连接酶三个批次所对应的数据相关性R²分别为0.985、0.863、0.986，如图7至图9所示。

SRS的测序定量结果与实际加入的SRS量的相关性分析可以用于判断或评价miRNA测序定量结果的准确性，具体的，相关性R²数值越大，说明miRNA测序定量结果与实际的理论含量值越相符，说明miRNA测序定量结果越准确，可信度高。通过比较RNA连接酶三个批次的实验结果，发现批次二存在较明显的异常，批次三结果最优。

基于以上分析，后续实验只启用批次三的RNA连接酶，并在建库过程中掺入SRSmix，对small RNA测序实验做到实时检测，取得了满意的实验结果。

将采用批次三的RNA连接酶的前列腺癌发生机制small RNA测序定量结果，与QPCR定量检测结果进行相关性分析，结果如图10所示，结果显示，鉴定到的miRNA与QPCR结果相关性R²达到0.836。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因股份有限公司

<120> 用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂、制备方法和应用

<130> 18I26040

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagccaugca uuauaugcca g 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uaugccagaa gucucacggc c 21

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccuaacgugc cuaugcgcag aa 22

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

ugcgcagaca uaaaagcgau 20

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcgauuac gacauuagga u 21

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

augugaauga ccgguaccca 20

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

guacccaugu gaagaucgcg cu 22

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uauugaucgc gcugagccau g 21

Claims (10)

1.一种用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂，其特征在于：所述试剂包括SEQID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA中的至少一种；

SEQ ID NO.1：5’-GAGCCAUGCAUUAUAUGCCAG-3’

SEQ ID NO.2：5’-UAUGCCAGAAGUCUCACGGCC-3’

SEQ ID NO.3：5’-CCUAACGUGCCUAUGCGCAGAA-3’

SEQ ID NO.4：5’-UGCGCAGACAUAAAAGCGAU-3’

SEQ ID NO.5：5’-AAGCGAUUACGACAUUAGGAU-3’

SEQ ID NO.6：5’-AUGUGAAUGACCGGUACCCA-3’

SEQ ID NO.7：5’-GUACCCAUGUGAAGAUCGCGCU-3’

SEQ ID NO.8：5’-UAUUGAUCGCGCUGAGCCAUG-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

(1)从miRNA公共数据库中导出人源miRNA的所有序列，统计其长度分布和GC％分布；

(2)随机生成一系列设定长度的RNA短序列，并从随机生成的RNA短序列中筛选出长度分布和GC％分布分别落在步骤(1)统计的长度分布和GC％分布统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第一短序列集合；

(3)将所述第一短序列集合中的所有RNA序列分别与人类基因组和miRNA公共数据库进行比对，将能够比对匹配上的RNA序列删除，剩余的RNA序列作为第二短序列集合；

(4)计算步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的最低自由能MFE，并统计MFE分布；

(5)计算步骤(3)获得的所述第二短序列集合中所有RNA序列的MFE，并筛选出RNA序列的MFE落在步骤(4)统计的人源miRNA的MFE统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第三短序列集合；

(6)统计步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的首位及末位碱基分布，统计所述第三短序列集合中所有RNA序列的首位及末位碱基分布，并筛选出RNA序列的首位及末位碱基分布与人源miRNA的首位及末位碱基分布一致的RNA序列，即获得SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，设定长度为20-22nt。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述miRNA公共数据库为miRBase数据库。

5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)和步骤(5)中，MFE采用RNAfold计算。

6.根据权利要求1所述的试剂在癌症样本miRNA测序定量结果评价、癌症样本miRNA测序质量分析或靶标miRNA定量检测中的应用。

7.一种评价癌症样本miRNA测序定量结果的方法，其特征在于：包括在待测RNA样品中定量加入合成的已知序列的small RNA作为参考样品，将待测RNA样品和参考样品的混合样品用于建库和测序，通过测序定量分析混合样品中已知序列的small RNA的含量，并将该测序定量分析结果与实际加入待测RNA样品中的已知序列的small RNA的量进行比较，以此评价癌症样本miRNA测序定量结果的准确性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述参考样品的small RNA采用以下方法获得，

(1)从miRNA公共数据库中导出人源miRNA的所有序列，统计其长度分布和GC％分布；

(2)随机生成一系列设定长度的RNA短序列，并从随机生成的RNA短序列中筛选出长度分布和GC％分布分别落在步骤(1)统计的长度分布和GC％分布统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第一短序列集合；

(3)将所述第一短序列集合中的所有RNA序列分别与人类基因组和miRNA公共数据库进行比对，将能够比对匹配上的RNA序列删除，剩余的RNA序列作为第二短序列集合；

(4)计算步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的最低自由能MFE，并统计MFE分布；

(5)计算步骤(3)获得的所述第二短序列集合中所有RNA序列的MFE，并筛选出RNA序列的MFE落在步骤(4)统计的人源miRNA的MFE统计值上下四分位数间的RNA序列，作为第三短序列集合；

(6)统计步骤(1)导出的人源miRNA所有序列的首位及末位碱基分布，统计所述第三短序列集合中所有RNA序列的首位及末位碱基分布，并筛选出RNA序列的首位及末位碱基分布与人源miRNA的首位及末位碱基分布一致的RNA序列，作为所述参考样品的small RNA。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，设定长度为20-22nt；优选的，所述步骤(1)中，所述miRNA公共数据库为miRBase数据库；优选的，所述步骤(4)和步骤(5)中，MFE采用RNAfold计算。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于：所述参考样品的smallRNA为SEQID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列的RNA中的至少一种；

SEQ ID NO.1：5’-GAGCCAUGCAUUAUAUGCCAG-3’

SEQ ID NO.2：5’-UAUGCCAGAAGUCUCACGGCC-3’

SEQ ID NO.3：5’-CCUAACGUGCCUAUGCGCAGAA-3’

SEQ ID NO.4：5’-UGCGCAGACAUAAAAGCGAU-3’

SEQ ID NO.5：5’-AAGCGAUUACGACAUUAGGAU-3’

SEQ ID NO.6：5’-AUGUGAAUGACCGGUACCCA-3’

SEQ ID NO.7：5’-GUACCCAUGUGAAGAUCGCGCU-3’

SEQ ID NO.8：5’-UAUUGAUCGCGCUGAGCCAUG-3’。