CN108703894A - 一种具有美白、抗衰的复合多肽组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其包括以下原料：美白、提亮肤色功效肽0.0001～5%，抗衰功效肽0.0001～5%，多元醇保湿剂A 0.1～10%，保湿剂B 0.1～10%，防腐剂0.1～5%，增稠悬浮剂0.2～5%，乳化增溶剂0.1～0.5%，去离子水余量。本发明采用美白、提亮肤色功效肽，抗衰功效肽复配产生协同作用提高美白以及抗衰效果，与多元醇保湿剂A、保湿剂B复配使用可辅助提高其效果。本发明提供上述复合多肽护肤组合物的制备方法，该复合多肽护肤组合物还可作为添加剂应用于洗面奶、水乳、面膜等护肤产品中，通过各种活性成分之间复配，产生协同作用，可有效改善暗黄肌肤，提亮肤色，延缓肌肤老化，预防各种肌肤问题。

Description

一种具有美白、抗衰的复合多肽组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种护肤组合物，具体地涉及一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物及其制备方法。
背景技术
人体的肤色差异主要取决于皮肤基底层中黑色素含量的多少，黑色素的合成主要依赖于酪氨酸酶活力，酪氨酸酶能够将酪氨酸经过多步骤的催化合成多巴，进而形成黑色素颗粒，黑色素逐步从细胞中转移至基底层中并沉淀于基底层，导致色素沉着。酪氨酸酶是黑色素合成的主要限速酶。多肽是由两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的天然活性物质，其与机体物质同源、分子量小、生化生理机制明确，是目前公认比较安全的美容护肤原料。皮肤组织细胞的增殖、细胞趋化与迁移、修复与再生、血管形成与重建、色素形成与清除以及蛋白合成与分泌，代谢与调控等皮肤自然老化的防御和护理过程中，活性生物多肽也起着重要的生理作用。
目前，市场上抗衰老、提亮肤色的产品多种多样，但作用比较单一，一般都是单独地抑制黑色素生成或是单独的抗氧化作用，作用机理不清晰，而且安全性方面问题也有待考究。虽然有不少也考虑多肽对美白、抗衰的影响，然而对辅助组分的影响以及之间的具体作用机理并未探讨，所以也无法确定效果。
从国内外大型化妆品公司的发展战略来看，提高化妆品的安全性及功效性乃倍受重视，尤其是抗衰老、美白化妆品仍是现今与未来研发的主题。越来越多的消费者希望化妆品生产商能开发出更多安全有效的抗衰老、美白护肤品，使得皮肤更加健康。因此，开发抗衰老、美白的复合多肽成分原料已经成为化妆品新产品开发所必需的。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以改善暗黄肌肤，提亮肤色，同时延缓肌肤老化，预防各种肌肤问题。
本发明的另一目的是提供一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：
作为优选的，所述复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：
进一步优选地，述复合多肽护肤组合物还含有寡肽。
进一步优选的，所述美白、提亮肤色功效肽包括肌肽、九肽-1中的至少一种。
进一步优选的，所述抗衰功效肽包括棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、乙酰基六肽-8、棕榈酰三肽-1、乙酰基四肽-5中的至少一种
进一步优选的，所述多元醇保湿剂A包括甘油、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇中的至少一种。
进一步优选的，所述保湿剂B为透明质酸。
进一步优选的，所述防腐剂包括苯氧乙醇、乙基己基甘油、1,2-己二醇中的至少一种
进一步优选的，所述增稠悬浮剂包括卡波姆、聚丙烯酸中的至少一种。
进一步优选的，所述乳化增溶剂包括聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60中的至少一种。
一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至75～80℃，依次加入美白、提亮肤色功效肽，抗衰功效肽，搅拌均匀；
(2)依次加入增稠悬浮剂、乳化增溶剂，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至50～70℃，依次加入多元醇保湿剂A、保湿剂B、防腐剂，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至20～30℃，采用孔径为0.2～0.4um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-10～-5℃下储存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的复合多肽护肤组合物，利用抗衰功效肽有效抑制酪氨酸酶活性，减少皮肤黑色素的生成和转移；同时采用特定组合的保湿剂防止皮肤水分流失，提高皮肤弹性、降低皱纹的形成。
2、本发明的复合多肽护肤组合物，能够促使表皮修复和再生。寡肽中所含有的多种细胞生长因子具有高度的生物活性，分子结构与人皮肤组织相应的细胞生长因子非常相近，可对皮肤组织及其细胞发挥相应的促细胞生长等生理作用。
3、本发明的复合多肽护肤组合物配方科学合理，该复合多肽护肤组合物还可作为添加剂应用于洗面奶、水乳、面膜等护肤产品中，通过各种活性成分之间的复配，产生协同作用，可以有效的改善暗黄肌肤，提亮肤色，同时延缓肌肤老化，预防各种肌肤问题。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
甘油、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇属于多元醇保湿剂，其分在结构中含有羟基-OH可以从空气中吸附水分子与水分子形成氢键，能够发挥吸水、锁水的功效，为皮肤保持水分含量。另一方面降低皮肤表面蒸汽压。
透明质酸与皮肤具有优异的亲和作用，其分子结构中的羧基与N-乙酰基之间形成氢键，其效果虽然不及多元醇。但是，透明质酸在一定程度上可以被皮肤吸收，从而形成保水膜，增强皮肤屏障功能。
皮肤弹性的改善需要提高皮肤细胞外的水分子、胶原蛋白、透明质酸等，这些组分吸收填充在细胞和胶原纤维之间，使皮肤充盈有弹性；提供皮肤内部角朊质和成纤维细胞所需营养组分，从而加快生长代谢，产生更多胶原蛋白，提高皮肤弹性。
弹性测试是表征皮肤衰老的重要指标，用MPA 580弹性测试仪对多元醇保湿剂A、保湿剂B以及多元醇保湿剂A和保湿剂B复配对皮肤弹性的效果进行表征。采用MPA 580弹性测试仪筛选出未使用保湿剂，且弹力参数R2值为0.45的志愿者90人分成9组分别长期使用60天，记录各组结果，并取其平均值。测试结果记载于表1。
表1
多元醇保湿剂A、保湿剂B都具有改善皮肤弹性的效果，然而单独使用的效果远不及两者使用。对比得出初步筛选后，多元醇保湿剂A和保湿剂B的复配比单一的多元醇保湿剂A、保湿剂B具有更好的提高皮肤弹性的效果，所以本发明技术方案采用多元醇保湿剂A和保湿剂B复配作为复合多肽护肤组合物的辅助抗衰组分。
实施例1
一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：肌肽0.1％，棕榈酰五肽-4 0.1％，甘油5％，透明质酸5％，苯氧乙醇0.5％，卡波姆1％，聚山梨醇酯-20 0.2％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至75℃，依次加入肌肽，棕榈酰五肽-4，搅拌均匀；
(2)依次加入卡波姆、聚山梨醇酯-20，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至50℃，依次加入甘油、透明质酸、苯氧乙醇，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至20℃，采用孔径为0.2um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-10℃下储存。
对比例1
一种复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：肌肽0.1％，甘油5％，透明质酸5％，苯氧乙醇0.5％，卡波姆1％，聚山梨醇酯-20 0.2％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至75℃，依次加入肌肽搅拌均匀；
(2)依次加入卡波姆、聚山梨醇酯-20，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至50℃，依次加入甘油、透明质酸、苯氧乙醇，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至20℃，采用孔径为0.2um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-10℃下储存。
实施例2
一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：九肽-1 3％，棕榈酰四肽-7 3％，丙二醇1％，透明质酸1％，乙基己基甘油2％，聚丙烯酸3％，聚山梨醇酯-600.4％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至80℃，依次加入九肽-1，棕榈酰四肽-7，搅拌均匀；
(2)依次加入聚丙烯酸、聚山梨醇酯-60、乙基己基甘油，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至70℃，依次加入丙二醇、透明质酸，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至30℃，采用孔径为0.4um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-5℃下储存。
对比例2
一种复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：棕榈酰四肽-73％，丙二醇1％，透明质酸1％，乙基己基甘油2％，聚丙烯酸3％，聚山梨醇酯-60 0.4％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至80℃，依次加入棕榈酰四肽-7，搅拌均匀；
(2)依次加入聚丙烯酸、聚山梨醇酯-60、乙基己基甘油，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至70℃，依次加入丙二醇、透明质酸，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至30℃，采用孔径为0.4um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-5℃下储存。
实施例3
一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：九肽-1 1％，乙酰基六肽-8 1％，1,3-丙二醇2％，透明质酸2％，1,2-己二醇1％，聚丙烯酸2％，聚山梨醇酯-60 0.3％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至76℃，依次加入九肽-1，乙酰基六肽-8，搅拌均匀；
(2)依次加入聚丙烯酸、聚山梨醇酯-60、1,2-己二醇，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至65℃，依次加入1,3-丙二醇、透明质酸、防腐剂，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至25℃，采用孔径为0.2um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-8℃下储存。
对比例3
一种复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：九肽-11％，乙酰基六肽-8 1％，1,3-丙二醇2％，1,2-己二醇1％，聚丙烯酸2％，聚山梨醇酯-60 0.3％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至76℃，依次加入九肽-1，乙酰基六肽-8，搅拌均匀；
(2)依次加入聚丙烯酸、聚山梨醇酯-60、1,2-己二醇，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至65℃，依次加入1,3-丙二醇、防腐剂，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至25℃，采用孔径为0.2um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-8℃下储存。
实施例4
一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：肌肽2％，棕榈酰三肽-1 2％，丁二醇1％，透明质酸1％，苯氧乙醇0.5％，卡波姆1％，聚山梨醇酯-60 0.4％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至76℃，依次加入肌肽，棕榈酰三肽-1，搅拌均匀；
(2)依次加入卡波姆、聚山梨醇酯-60，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至55℃，依次加入丁二醇、透明质酸、苯氧乙醇，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至28℃，采用孔径为0.3um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-6℃下储存。
对比例4
一种复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：肌肽2％，棕榈酰三肽-1 2％，苯氧乙醇0.5％，卡波姆1％，聚山梨醇酯-60 0.4％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至76℃，依次加入肌肽，棕榈酰三肽-1，搅拌均匀；
(2)依次加入卡波姆、聚山梨醇酯-60，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至55℃，依次加入透明质酸、苯氧乙醇，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至28℃，采用孔径为0.3um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-6℃下储存。
实施例5
一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：九肽-1 0.5％，乙酰基四肽-5 0.5％，丙二醇3.5％，透明质酸3.5％，乙基己基甘油1.5％，卡波姆1.5％，聚山梨醇酯-20 0.2％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至75℃，依次加入九肽-1，乙酰基四肽-5，搅拌均匀；
(2)依次加入卡波姆、聚山梨醇酯-20，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至70℃，依次加入丙二醇、透明质酸、乙基己基甘油，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至29℃，采用孔径为0.2um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-9℃下储存。
对比例5
一种复合多肽护肤组合物，以重量百分计，其主要由以下原料制成：九肽-10.5％，乙酰基四肽-5 0.5％，透明质酸3.5％，乙基己基甘油1.5％，卡波姆1.5％，聚山梨醇酯-20 0.2％，去离子水余量。
所述复合多肽护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至75℃，依次加入九肽-1，乙酰基四肽-5，搅拌均匀；
(2)依次加入卡波姆、聚山梨醇酯-20，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至70℃，依次加入透明质酸、乙基己基甘油，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至29℃，采用孔径为0.2um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-9℃下储存。
1.抗衰实验
自由基是生命活动过程中生物化学反应的中间产物，能够导致皮肤衰老。利用本发明复合多肽护肤组合物对DPPH自由基的作用效果评价其抗衰效果。
取等体积(为5mL)的复合多肽护肤组合物与3×10－4mol/L的DPPH溶液混匀(记为No.1)；取等体积的水与3×10－4mol/L的DPPH溶液混匀(记为No.2)；取等体积的无水乙醇与待测液混匀(记为No.3)；反应35min后，在517nm处测记为No.1，记为No.2和记为No.3的吸光度值，分别记为A1，A2和A3。DPPH自由基清除率＝[(A2+A3)－A1]/A2×100％。
除了自由基清除率来评价抗衰效果，发明人同时还按照前述弹性测试来直观表征本发明复合多肽护肤组合物的使用效果。
将本发明实施例1-5以及对比例1-5的实验结果记录于表2。
表2
从表2的实验结果可以看出，本发明提供的复合多肽护肤组合物能够有效的防止皮肤衰老。实施例1与对比例1的比较结果可以推断，对比例1在缺少抗衰功效肽的情况下，复合多肽护肤组合物的抗衰效果明显下降。
实施例2与对比例2比较结果可以看出，对比例2虽然含有抗衰功效肽，但是在不含美白、提亮肤色功效肽的情况下，其抗衰效果也有所下降，从而可以判断，本发明美白、提亮肤色功效肽与抗衰功效肽的复配产生了优异的效果。
实施例3与对比例3比较结果可以看出，含有复配保湿剂的含有比单一的保湿剂具有更好的提高皮肤弹性的效果，且自由基清除率也相应提高。在不含保湿剂的对比例4的结果也差于含单一保湿剂的对比例3、5，更差于含有本发明的效果。由此可见，结果与前述弹性测试相互印证，进一步说明了本发明技术方案采用保湿剂A和保湿剂B复配作为复合多肽护肤组合物的辅助抗衰组分与抗衰功效肽协同发挥了更加优异的抗衰作用。
2、美白实验
黑色素的多少直接的表现于皮肤的颜色，本发明采用复合多肽护肤组合物对皮肤黑色素抑制率评价其美白效果。
筛选年纪在30-45岁、皮肤健康的100名志愿者分成10组作为接受测试。以上志愿者预先采用皮肤黑色素测试仪测定了黑色素的含量，并保证黑色素的差别小于1.5。
左右前臂内侧4cm×4cm区域为测试部位，左前臂为实验部位，涂抹本发明实施例1-5以及对比例1-5得到的护肤组合物；右前臂为对照部位，不涂抹。每天早晚各涂抹1次，连续涂抹60天。结束后用皮肤黑色素测试仪检查皮肤中黑色素含量，计算黑色素抑制率，结果见表3。
黑色素抑制率(％)＝[(对照部位皮肤黑色素含量-实验部位皮肤黑色素含量)/对照部位皮肤黑色素含量]×100％。
除了上述直观表征美白情况，同时采用酪氨酸酶活性抑制率来测试。具体按照以下方法进行：
分别取10mL上述实施例1-5以及对比例1-5的复合多肽护肤组合物，加入2mL L-酪氨酸(0.25mol)和2mL pH＝6.8的磷酸缓冲液(PBS)，在37℃恒温水槽中保温5分钟，再加入0.5ml酪氨酸酶水溶液(1.0mg/ml，mcllvains缓冲液)，充分搅拌，在37℃反应10分钟后，测定475nm吸光度(A1)。另外，用所述磷酸缓冲液代替上述实施例1-5以及对比例1-5的复合多肽护肤组合物进行相同的反应，测得吸光度(A2)。为了做对照试验，在不加试样和酪氨酸酶水溶液的情况下，测得吸光度(A3)。采用下面公式计算出酪氨酸酶活性抑制率。酪氨酸酶活性抑制率(％)＝(A2-A1)/(A2-A3)×100。结果记录于表3。
表3
从表3的实验结果可以看出，本发明提供的复合多肽护肤组合物能够有效的抑制黑色素。实施例1-2与对比例1-2的比较结果可以推断，虽然美白效果与美白、提亮肤色功效肽有直接联系，但是在复配抗衰功效肽的情况下，黑色素抑制率有较大的提高，说明美白效果更佳。
从实施例3-5以及对比例3-5的结果可知，不添加保湿剂的美白效果小于采用单一保湿剂的美白效果小于，小于本发明采用保湿剂A、B复配的美白效果。由此可见，多元醇保湿剂A、保湿剂B复配在一定程度上可以增强本发明复合多肽护肤组合物的美白效果。
以上实施例表明，本发明抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物能够有效营养皮肤，消除自由基、抑制黑色素的增长，长期使用可使皮肤保持美白，弹性润泽、淡化皱纹，延缓皮肤衰老。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有抗氧化、清除自由基、抑制黑色素生成的复合多肽护肤组合物，其特征在于，以重量百分计，其主要由以下原料制成：
2.根据权利要求1所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，以重量百分计，其主要由以下原料制成：
3.根据权利要求1-2任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述复合多肽护肤组合物还含有寡肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述美白、提亮肤色功效肽包括肌肽、九肽-1中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述抗衰功效肽包括棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、乙酰基六肽-8、棕榈酰三肽-1、乙酰基四肽-5中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述多元醇保湿剂A包括甘油、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇中的至少一种；所述保湿剂B为透明质酸。
7.根据权利要求1-6任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述防腐剂包括苯氧乙醇、乙基己基甘油、1,2-己二醇中的至少一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述增稠悬浮剂包括卡波姆、聚丙烯酸中的至少一种。
9.根据权利要求1-8任一项所述复合多肽护肤组合物，其特征在于，所述乳化增溶剂包括聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60中的至少一种。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述复合多肽护肤组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将去离子水投入到反应容器中，加热至75～80℃，依次加入美白、提亮肤色功效肽，抗衰功效肽，搅拌均匀；
(2)依次加入增稠悬浮剂、乳化增溶剂，搅拌均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液冷却至50～70℃，依次加入多元醇保湿剂A、保湿剂B、防腐剂，搅拌均匀；
(4)继续将步骤(3)得到的混合液冷却至20～30℃，采用孔径为0.2～0.4um的微孔滤膜将步骤(3)得到的混合液过滤；
(5)灭菌处理后封装，并在-10～-5℃下储存。
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