CN108701350A - 背景补偿 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于数字图像的背景补偿的系统、方法和计算机程序产品，所述数字图像包含至少一个第一对象和至少一个第二对象，所述至少一个第一对象已接收包含遗传信息的至少一个分子，所述至少一个第二对象未接收包括遗传信息的分子，所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物，所述数字图像由光学成像系统在荧光化合物发射电磁辐射期间确定。
Description
本发明涉及用于数字图像的背景补偿的系统和方法，所述数字图像包含至少一个第一对象和至少一个第二对象。更具体地，本发明涉及由光学成像系统在荧光化合物发射电磁辐射期间确定的数字图像的背景补偿，优选用于DNA/RNA测序，其中自发荧光效应起作用。
生物技术、医学和相关的技术领域是基于分子分析的。电子器件可以以高精度和特异性分析分子。特别是在过去几年，自动化电子器件已经被开发出来用于通过常规方法分析大量样本。例如，现代DNA测序设备被用于大量DNA探针的常规分析。蛋白质样本可以借助高通量筛选及相关方法来分析。通常，这种电子器件检测从样本探针发射的荧光信号。当已经用荧光化合物如染料标记分子如核酸或蛋白质时，这是可行的。
商业上可获得的测序设备能够对用荧光染料标记的大量样本进行并行测序。最近开发的被称为“下一代测序”NGS的方法使测序发生革命性变化。NGS允许对在流动池中或通过产生油水乳液在空间上分隔的克隆扩增的或单个DNA分子进行大规模并行测序。NGS允许同时执行数千乃至成百万到数十亿的测序反应。
在NGS中，通过聚合酶介导的核苷酸延伸的重复循环或者在一种格式中通过寡核苷酸连接的迭代循环来执行测序。作为大规模并行处理，取决于平台，NGS在单次仪器运行中产生数百兆碱基到数千兆碱基的核苷酸测序输出。与常规方法相比，廉价地产生大量的序列数据是其主要优点。
例如在Voelkerding等人，Clinical Chemistry 55：4第641-658页，2009年以及Metzker，Nature Reviews/Genetics第11卷，2010年1月，第31-46页中综述了用于NGS技术的NGS平台和常见应用/领域。
在NGS中，各种感兴趣的寡核苷酸被共价附接于支持物上。随后，使用DNA聚合酶将用荧光染料标记的核苷酸附接于生长的寡核苷酸链。当用不同的荧光染料标记四个核苷酸时，可以检测从探针发射的荧光信号并且可以鉴定被附接于寡核苷酸的核苷酸的类型。在检测之后，将荧光染料切割掉并且执行下一合成循环，在下一合成循环中将新的标记的核苷酸附接于生长的链上。通过执行多个循环，可以依照逐步的方式确定生长的寡核苷酸链的序列。在自动化测序设备中执行工作步骤。
US 2010/0323350 A1和WO 2009/117119 A1涉及使用例如通过合成方法从测序中获得的数据来确定核苷酸序列中的核酸的身份的方法和组合物。
WO 2008/097455 A1涉及一种用于激发并测量包括荧光材料如荧光标签、染料或颜料的样本上或样本中的荧光的成像系统，尤其是用于检测核酸上的荧光标签。此外，公开了一种器件，所述器件被配置为使得同时检测多个不同的DNA模板中的荧光标签。
WO 2014/020137 A1涉及一种用于从测序库中富集目标序列以便提供目标富集测序库的方法，其中测序库适合于大规模并行测序并且包括多个双链核酸分子。
从具有标记分子的样本探针发射的荧光信号很弱，但是必须以高精度和特异性检测信号。因此，这种处理需要精确的光学设备，特别是照相机和扫描技术。
另外，为了例如在FASTQ中获得精确且可靠的测序结果，大规模评估由测序设备的光学成像系统捕获的数字图像是必须的。
由光学成像系统确定的观察到的信号强度(intensity)可以被认为是独立贡献例如自发荧光和荧光的信号强度的总和。此外，这些强度会由于光学系统和不均匀照明导致的光晕效应而被另外衰减。在没有背景补偿的常规系统中，这些效应导致降低了从图像获得的信息的精度，即DNA/RNA测序中碱基调用的精度。
本发明的目的是提供一种方法和系统，其克服了现有技术的上述问题。具体地，一个目的是确定并去除来自每个观察信号的自发荧光信号以便在随后的处理步骤中允许稳健且可靠的处理。
此目的利用独立权利要求的特征实现。从属权利要求涉及本发明的其他方面。
本发明的方法由计算机实现。然而，技术人员应当理解还存在其它方式来实现本发明的方法。
在本发明的一个方面，提供了一种用于数字图像的背景补偿的方法，所述数字图像包含至少一个第一对象和至少一个第二对象，所述至少一个第一对象已接收包括遗传信息的至少一个分子，所述至少一个第二对象未接收包括遗传信息的分子。所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物。由光学成像系统在荧光化合物发射电磁辐射期间确定数字图像。所述方法优选按以下次序包括以下步骤：
a)根据数字图像确定每个对象的第一强度值；
b)根据数字图像确定多个预定区域内的至少一个第二对象的第二强度值；
c)根据多个预定区域中的每个区域的第二强度值计算中值强度值；
d)将所述中值强度值内插到原始数字图像的尺寸；
e)通过从确定的第一强度值中减去内插的中值强度值来计算每个对象的背景补偿强度值。
对象状态优选被预先确定并且作为已知参数输入到方法中。另外，对象位置优选根据相应的白光图像预先确定并且可以作为已知参数输入到方法中。
所述至少一个第一对象优选是已接收至少一个DNA链的一个活珠粒(live-bead)并且所述至少一个第二对象优选是一个未接收DNA链的空白珠粒(blank-bead)。所述DNA链优选是单链DNA片段。这种珠粒在商业上可从例如赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Inc.)例如以Dynabeads品牌获得，参见参考文献[1]。
优选地，每个DNA链被配置为接收分子，优选核苷酸。核苷酸优选包括可切割荧光化合物和可切割帽。进一步优选的是，所述分子是多个四种不同分子，对于四种不同分子中的每一个均具有特异性的荧光化合物。
优选地，多个循环中的每个循环的特征在于四种分子之一被附接于DNA链之一，其中可切割帽确保在一个循环期间只有一个分子被附接于一个DNA链。
对每个循环来说，优选的是获取多张图片，优选是四张，对附接于所述分子的四种荧光化合物中的每个获取一张。进一步优选的是，四种荧光化合物具有红、蓝、黄或绿光谱体系中的主发射光谱之一。
在每次循环之后，可切割帽和荧光化合物如荧光染料被去除，使得另一分子可以在下一循环中被附接于DNA链。
光学成像系统优选包括用于激活荧光化合物的照明器件如LED和用于检测荧光化合物的发射光谱的检测系统如CCD检测器。
每个预定区域优选包括原始数字图像的多个像素。预定区域对应于至少一个第二对象的预定位置。优选的是，预定区域的尺寸近似于所述至少一个第二对象的尺寸，例如2.8像素。
所述方法可以进一步包括：基于多个预定区域内的至少一个第二对象的位置，依照拓扑网格构造，优选依照中值矩阵来布置计算的中值强度值。
所述方法可以进一步包括：向多个预定区域的计算的中值强度值应用区域生长方法。即，所述方法可以进一步包括向中值矩阵应用区域生长方法。区域生长方法对于增加方法的稳定性可以是有益的，这是因为可以填充相应矩阵表示中的空元素。
特别地，如果多个预定区域中的一个或多个预定区域不包含第二对象，即空白珠粒，则可以出现在中值矩阵中的空元素。从而，对于该(那些)预定区域，不确定第二强度值，由此中值矩阵的各自元素是空的。
优选地，所述方法进一步包括：向多个预定区域的计算的中值强度值应用中值滤波。即，所述方法进一步包括：向中值矩阵应用中值滤波。
所述方法还优选进一步包括：向多个预定区域的计算的中值强度值应用高斯滤波。即，所述方法进一步包括：向中值矩阵应用高斯滤波。
将中值强度值内插到原始数字图像尺寸优选包括双线性内插。即，在内插之后，对于原始数字图像中的每个像素存在相应的中值强度值。即便双线性内插是优选的，本领域技术人员知道也可以同样应用其它内插算法。
所述至少一个对象可以是优选被配置为接收DNA和/或RNA的珠粒。如上面已经概述的那样，所述对象可以是用于接收DNA/RNA链的珠粒，所述DNA/RNA链然后接收具有可切割帽和可切割荧光化合物如荧光染料的分子。
依照本发明的另一个方面，提供了一种计算机程序产品，其中计算机程序产品包括一个或多个计算机可读介质，其具有用于执行上述方法的步骤的计算机可执行指令。
依照本发明的又一方面，提供了一种用于数字图像的背景补偿的系统，所述数字图像包含至少一个第一对象和至少一个第二对象，所述至少一个第一对象已接收包括遗传信息的至少一个分子，所述至少一个第二对象未接收包括遗传信息的分子。所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物。由光学成像系统在荧光化合物发射电磁辐射期间确定数字图像。系统优选被配置为执行任何上述方法步骤中的步骤。所述系统包括：强度确定单元，其被配置为根据数字图像确定每个对象的第一强度值以及确定多个预定区域内的至少一个第二对象的第二强度值；和计算单元，其被配置为根据多个预定区域中的每个区域的第二强度值计算中值强度值并且计算中值强度值到原始数字图像尺寸的内插并且通过从确定的第一强度值中减去内插的中值强度值来计算每个对象的背景补偿强度。
计算单元可以被进一步配置为基于多个预定区域内的至少一个第二对象的位置，依照拓扑网格构造，优选依照中值矩阵来布置计算的中值强度值。
计算单元可以被进一步配置为向多个预定区域的计算的中值强度值应用区域生长方法。即，计算单元可以被进一步配置为向中值矩阵应用区域生长方法。如上面概述，可以应用区域生长方法，以便填充中值强度值的矩阵表示的空元素。
计算单元优选被进一步配置为向多个预定区域的计算的中值强度值应用中值滤波。即，计算单元优选被进一步配置为向中值矩阵应用中值滤波。
计算单元可以被进一步配置为向多个预定区域的计算的中值强度值应用高斯滤波。即，计算单元可以被进一步配置为向中值矩阵应用高斯滤波。
内插的计算可以包括双线性内插。
从而，本发明例如借助于使用中值，通过非正常值强度的局部加工和稳健处理(robust handling)来考虑强度的挑战性偏差。
现在参考附图描述一些优选实施方式。为了解释目的，在不脱离如权利要求所述的本发明的范围的情况下阐明各个具体细节。
图1示出了依照本发明一个实施方式的系统。
图2示出了依照本发明的数字图像中的自发荧光效应。
图1示出了本发明的系统。依照本发明示例性实施方式，所述系统包括强度确定单元100和计算单元200。所述单元被配置为执行本发明的一个或多个步骤。虽然使用两个独立的单元100、200描述了本发明，不过显然独立的单元也可以是一个单个“主”单元的一部分。
在本发明的优选实施方式中，强度确定单元100被配置为根据数字图像确定每个对象的第一强度值以及确定多个预定区域内的至少一个第二对象的第二强度值。
计算单元200被配置为计算多个预定区域中的每个区域的中值强度值，计算中值强度值到原始数字图像尺寸的内插，以及通过从确定的第一强度值中减去中值强度值来计算每个对象的背景补偿强度。
在本发明的以下优选实施方式中，按照方法步骤进一步描述强度确定单元100和计算单元200的功能。对本领域技术人员来说明显的是，方法步骤的以下描述给出强度确定单元100和计算单元200的相应功能。
图2示出了在存在自发荧光的情况下活珠粒(第一对象)和空白珠粒(第二对象)的典型强度水平。在图表的左侧示出了空白珠粒强度并且在图表的右侧示出了活珠粒强度(由虚线分隔开)。如同所见，空白珠粒的强度水平不是零，这本应当是“理想”情况中的情形。然而，发射荧光的存在导致即使在空白珠粒的位置也有自发荧光。在活珠粒的位置，源于自发荧光的强度水平被添加到由于荧光发射(“DNA”信号)所导致的强度值。
依照本发明，假定第一对象(活珠粒)和第二对象(空白珠粒)被预先分类，即预先确定哪些对象已经接收DNA链并且哪些没有。换句话说，珠粒的分类，无论它们能否接收具有荧光化合物的核苷酸，对本发明的方法和系统来说都是已知的，并且可以被输入到强度确定单元和/或计算单元200中。
在示例性实施方式的第一步骤中，执行基于子区块(sub-tile)方式的中值强度值的确定。为此，通过只使用空白珠粒，根据珠粒位置和珠粒状态在网格中对珠粒强度进行分类。即，自发荧光通常从空白珠粒中提取，所述空白珠粒未用DNA填充。基于珠粒位置，形成空间网格以便确保局部加工，这会减少光晕效应的影响。这里，被映射到一个网格元素上的典型空间分辨率是64x64像素。即，每个空白珠粒位置一个网格。然而，可以通过只考虑预定数目的网格来节省计算时间。
接下来，通过计算每个网格单元(子区块)的中值强度值来计算中值矩阵。使用中值以便补偿非正常值，从而改进稳健性。这里，非正常值可以来源于误分类的珠粒，例如当活珠粒已经被错误地分类为空白珠粒时。
随后，如果必要的话，借助区域生长方法来填充中值矩阵的空元素。
可以应用表面平滑以便通过应用中值滤波(3x3)来消除产生的中值矩阵中可能的极值，在所述中值滤波之后可以应用高斯滤波。
因为图像已经被再分到多个网格中，必须例如通过双线性内插将中值强度值的矩阵扩大到原始图像尺寸，以便允许提取每个珠粒的中位值。即，目标是对于原始数字图像的像素具有相应的中位值(自发荧光)。因此，中值矩阵(例如52x39)通过双线性内插而被放大到原始的数字图像尺寸(例如3296x2472像素)。
最后，通过从原始强度值中减去相应的中值强度值来执行每个珠粒强度的背景校正。如果计算功率和时间不那么重要，那么可以对数字图像的每个像素进行此减去操作。然而，只从每个珠粒位置的原始强度值中减去相应的中值强度值作为珠粒位置就足够了。
优选实施方式的以上方法步骤已经被描述为与DNA/RNA测序相关。然而，对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明不局限于此领域。显然，本发明的方案可以被应用于许多其它技术领域，其中使用荧光图像并且自发荧光效应起作用。即，对象不必是此示例性实施方式中的珠粒，而是可以是图像中任何种类的荧光发射对象，其中由于对象的荧光性质而存在自发荧光效应。
因为本发明在不脱离其范围或本质特性的情况下可以以几种形式体现，所以应当理解，除非另作说明，否则上述实施方式并不受以上说明书的任何细节的限制，相反应当在如权利要求限定的范围内宽泛地解释，因此落入本发明的所有变化和修改均旨在被权利要求涵盖。
此外，在权利要求中，词“包括”并不排除其它元素或步骤，并且不带具体数量的指称并不排除多个的情形。单个单元可以满足权利要求中列举的几个特征的功能。与属性或值结合的术语“基本上”、“大约”、“近似”等具体地还准确地分别定义了所述属性或值。
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Claims (14)
1.一种用于数字图像的背景补偿的方法，所述数字图像包含至少一个第一对象和至少一个第二对象，所述至少一个第一对象已接收包括遗传信息的至少一个分子，所述至少一个第二对象未接收包括遗传信息的分子，所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物，所述数字图像由光学成像系统在荧光化合物发射电磁辐射期间确定，其中所述方法优选按以下次序包括以下步骤：
a)根据数字图像确定每个对象的第一强度值；
b)根据数字图像确定多个预定区域内的至少一个第二对象的第二强度值；
c)根据多个预定区域中的每个区域的第二强度值计算中值强度值；
d)将所述中值强度值内插到原始数字图像的尺寸；
e)通过从确定的第一强度值中减去内插的中值强度值来计算每个对象的背景补偿强度值。
2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括：基于多个预定区域内的至少一个第二对象的位置，依照拓扑网格构造，优选依照中值矩阵来布置计算的中值强度值。
3.权利要求2的方法，所述方法进一步包括：向多个预定区域的计算的中值强度值应用区域生长方法。
4.权利要求2或3的方法，所述方法进一步包括：向多个预定区域的计算的中值强度值应用中值滤波。
5.权利要求2到4任一项的方法，所述方法进一步包括：向多个预定区域的计算的中值强度值应用高斯滤波。
6.权利要求1到5任一项的方法，其中将中值强度值内插到原始数字图像尺寸包括双线性内插。
7.权利要求1到6任一项的方法，其中所述至少一个对象是优选被配置为接收DNA和/或RNA的珠粒。
8.一种计算机程序产品，其包括具有用于执行前述权利要求之一的方法的步骤的计算机可执行指令的一个或多个计算机可读介质。
9.一种用于数字图像的背景补偿的系统，所述数字图像包含至少一个第一对象和至少一个第二对象，所述至少一个第一对象已接收包括遗传信息的至少一个分子，所述至少一个第二对象未接收包括遗传信息的分子，所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物，所述数字图像由光学成像系统在荧光化合物发射电磁辐射期间确定，所述系统优选被配置为执行权利要求1到7的任一方法的步骤，所述系统包括：
强度确定单元，其被配置为根据数字图像确定每个对象的第一强度值以及确定多个预定区域内的至少一个第二对象的第二强度值；
计算单元，其被配置为根据多个预定区域中的每个区域的第二强度值计算中值强度值并计算所述中值强度值到原始数字图像尺寸的内插，并且通过从确定的第一强度值中减去内插的中值强度值来计算每个对象的背景补偿强度。
10.权利要求9的系统，其中所述计算单元被进一步配置为基于多个预定区域内的至少一个第二对象的位置，依照拓扑网格构造，优选依照中值矩阵来布置计算的中值强度值。
11.权利要求10的系统，其中所述计算单元被进一步配置为向多个预定区域的计算的中值强度值应用区域生长方法。
12.权利要求10或11的系统，其中所述计算单元被进一步配置为向多个预定区域的计算的中值强度值应用中值滤波。
13.权利要求10到12任一项的系统，其中所述计算单元被进一步配置为向多个预定区域的计算的中值强度值应用高斯滤波。
14.权利要求10到13任一项的系统，其中内插的计算包括双线性内插。
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