CN108699510A - 细胞培养用层状颗粒及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有层状小颗粒的干细胞培养基或补料。由于分层，不太稳定组分或敏感组分在空间上与培养基、补料、补充剂或浓缩物中的反应组分分离。本发明涉及所述层状组合物的制备工艺和细胞培养组合物的制备方法，该细胞培养组合物具有热稳定性、光化学稳定性和/或伽马射线辐照稳定性。本发明还涉及应用培养基层状小颗粒的试剂盒和培养体系。

Description

细胞培养用层状颗粒及其制法

交叉参考

本申请要求于2015年12月30日申请的62/272,828号美国临时专利在美国法典第35章第119条(e)款项下的权利。前述申请案的全部内容通过引用而并入本文。

发明领域

本发明涉及干燥的含有层状小颗粒的细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物，所述层状小颗粒用于培养细胞及其它应用。本发明涉及所述层状组合物的制备工艺和细胞培养组合物的制法，该细胞培养组合物具有稳定性，例如热稳定性、光化学稳定性和/或伽马射线辐照稳定性。本发明还涉及，采用所述层状颗粒制剂生产蛋白和多肽，从而增加细胞生长和提高蛋白滴度。

发明内容

本发明涉及的部分内容是一种细胞培养用培养基或补料组合物的制备方法，包含：i)使干粉在流化床装置的动态气柱中悬浮；ii)用喷雾器将至少一种溶剂导入步骤(i)中的干粉，形成层状基础小颗粒；iii)将该层状基础小颗粒干燥。

本发明还涉及的部分内容是一种细胞培养用培养基或补料组合物的制备方法，包含：i)使干粉在流化床装置的移动气柱中悬浮；ii)用第一喷雾器将一种第一溶剂导入步骤(i)中的干粉上，形成基础大颗粒；iii)用第二喷雾器将至少一种第二溶剂导入步骤(ii)中的基础大颗粒上，形成层状基础大颗粒；iv)将该层状基础大颗粒干燥。

根据本发明的上述第一方面，所述干粉可以是基础培养基粉、完全培养基粉、细胞培养补料、细胞培养补充剂、细胞培养基或补料浓缩物或氨基酸混合物。

在第二方面，所述第一喷雾器可从由以下项构成的组中选择：顶部喷雾器、底部喷雾器、切向喷雾器。另外，所述第一或第二喷雾器也可从由以下喷雾器组成的组别中选择：顶部喷雾器、底部喷雾器、切向喷雾器。在一个优选实施例中，所述第二喷雾器可以是底部喷雾器。

在第三方面，所述第二喷雾器可以向所述基础大颗粒上喷射多种溶剂，分别形成一种层状基础大颗粒或层状基础小颗粒。另外，所述第二喷雾器可以依次喷射所述多种溶剂，使得每两次喷射步骤之间有间歇的干燥步骤。另外，所述第二喷雾器可以依次喷射所述多种溶剂，同时每两次喷射步骤之间没有间歇的干燥步骤。

在第四方面，所述多种溶剂中的每种溶剂可以有一种成分，或同一成分，或不同成分。例如，每种溶剂可以有混合成分。在其它方面，所述溶剂包含活性物质。在其它方面，所述溶剂包含敏感物质。

在第五方面，利用所述溶剂喷射的所述成分被分成活性物质和敏感物质。

在另外方面，所述活性物质和所述敏感物质被分别喷射，得到层状大颗粒。在特定方面，所述活性物质可以从由以下项构成的组中选择：一种或多种痕量元素、一种或多种活性氨基酸、一种或多种活性氨基酸、一种或多种金属盐、一种或多种酸溶性活性基团、一种或多种醇溶性活性基团及一种或多种pH调节剂基团。

在另一方面，所述敏感物质可以从由以下项构成的组中选择：一种或多种多胺、一种或多种维生素、一种或多种生长因子及一种或多种不稳定氨基酸。

在第六方面，所述方法所用进气的温度可以约为20℃至30℃。在另外方面，所述方法所用进气的温度可以约为25℃。

在第七方面，可能敏感的所述维生素从由以下项构成的组中选择：维生素B12、生物素、胆碱、叶酸、烟酰胺、吡多辛、核黄素、硫胺素、抗坏血酸及对氨基苯甲酸(PABA)。

在第八方面，所述干燥步骤的温度可以约为50℃至60℃。

在第九方面，所述基础小颗粒或所述基础大颗粒可以被干燥至含水量约为0.5％至10％。

在另一方面，所述溶剂还包含至少一种抗氧化剂或至少一种中性物质或二者兼有。

在第十方面，所述层状基础小颗粒或所述层状基础大颗粒是采用上述任一方法获得的。

在第十一方面，所述方法涉及生产营养培养基层状小颗粒、营养培养基补充剂层状小颗粒、营养培养基亚群层状小颗粒，该方法包含按上述任一方法制造层状培养基小颗粒，且其中所述基础小颗粒或基础大颗粒上的至少一层包含活性物质，而且/或者所述基础小颗粒或基础大颗粒上的至少一层包含敏感物质。在另外方面，所述活性物质可以从由以下项构成的组中选择：一种或多种痕量元素、一种或多种活性氨基酸、一种或多种活性氨基酸、一种或多种金属盐、一种或多种酸溶性活性基团、一种或多种醇溶性活性基团及一种或多种pH调节剂基团。另外，所述敏感物质可以从由以下项构成的组中选择：一种或多种多胺、一种或多种维生素、一种或多种生长因子及一种或多种不稳定氨基酸。在若干实施例中，所述干粉可以从由以下项构成的组中选择：维生素、散装无机盐和糖。

在第十二方面，所述方法涉及，在按上述所制的所述层状培养基复溶而得的液体中培养细胞，该方法包含：i)将所述层状培养基小颗粒在一种合适液体或缓冲液中复溶；其中所述层状培养基小颗粒可以是细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物；ii)细胞培养可以在复溶液体而有利于细胞生长的条件下进行。在另外方面，所述细胞培养可以被用于生产增多的量的多肽。在另外方面，所述多肽可以是重组多肽。另外，与含有不源于所述层状培养基小颗粒的液体培养基的培养液相比，所述培养通过加快细胞生长而增加产物产量。

第十三方面提供了一种试剂盒，包含：i)第一容器，其中包含符合以上权利要求中任一项的层状小颗粒或大颗粒；其中所述层状小颗粒或大颗粒可以是细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物；ii)所述细胞培养用层状小颗粒或大颗粒的使用说明书。

第十四方面提供了一种体系，包含：由遵循上述方法得到的一种层状培养基小颗粒复溶而得的液体培养基，和细胞。在另外方面，所述复溶液体培养基可以用于培养可生成重组多肽的细胞、病毒、分泌蛋白质，或用于培养悬浮细胞或可贴壁的细胞。

第十五方面提供了上述细胞培养用培养基或补料组合物的制法，或上述试剂盒的制法，或上述体系的制法，其中采用了氨基酸且所述氨基酸选自所述二十种氨基酸中的一种或多种及其盐或衍生物。在另外方面，所述氨基酸选自以下项中的一种或多种：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、半胱氨酸及赖氨酸。

第十六方面提供了利用上述方法获得的细胞培养用层状小颗粒或大颗粒。在另外方面，所述细胞可以是哺乳动物细胞。在特定方面，所述细胞可从由以下项构成的组中选择：CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、293细胞和VERO细胞。在另一方面，所述细胞可以是植物细胞、动物细胞、真核细胞、藻类细胞、真菌细胞和细菌细胞。

引用合并

本说明书述及的所有公开案、专利和专利申请案均通过同等程度的引用而并入本文，如同每个单独的公开案、专利或专利申请案被具体和单独地指明以引用方式并入本文。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考下述详尽说明和下述附图，将较好地理解本发明的特征和优点，这些说明阐述了例证性实施例，其中运用了本发明的原理：

图1：培养基层状颗粒制剂制造工艺示意图。利用一台带有含6英寸Wurster内芯的GPCG 1.1流化床的2升造粒干燥包衣机，进行底部喷射包衣。底部喷射成层-每次造粒，层体组成均不同。

图1a：示例性单层单一成分细胞培养基层状大颗粒-层状大颗粒原型A的示意图。

图1b：示例性多层、各层均为单一成分的细胞培养基层状大颗粒-层状大颗粒原型B的示意图。

图2a：细胞培养基层状大颗粒原型A(单层、单一成分)的扫描电镜图像。

图2b：细胞培养基层状大颗粒原型B(多层、每层单一成分)的扫描电镜图像。

图3a：原型A层状补料细胞的活性测定。

图3b：原型A层状补料细胞的生长力测定。

图4：细胞培养用层状培养基/补料大颗粒的示例性生产工艺。

图5a：细胞培养基层状大颗粒(制剂1)示意图。

图5b：细胞培养基层状大颗粒(制剂2)示意图。

图6a：制剂1的粒度分析(蓝色条块：未包衣非层状大颗粒；红色条块：包衣(层状)大颗粒)。

图6b：制剂2的粒度分析(蓝色条块：未包衣非层状大颗粒；红色条块：包衣(层状)大颗粒)。

图7a：底部喷射包衣前后的制剂1的累积粒度分析：成层步骤前的成粒基粉的筛分粒度级分析。粒度分析(蓝色方块：未包衣非层状大颗粒；红色菱形：包衣层状大颗粒)。

图7b：底部喷射包衣前后的制剂2的累积粒度(筛分法)分析：成层步骤前的成粒基粉的筛分粒度级分析。

图8a：包衣(层状)颗粒制剂1(F1)的不同放大倍数的扫描电镜图像，左图：放大100倍的俯视图；右图：放大1500倍的横截面图。

图8b：包衣(层状)颗粒制剂2(F2)的不同放大倍数的扫描电镜图像左图：放大100倍的俯视图；右图：放大1500倍的横截面图。

图9a：制剂1、制剂2、制剂3：成粒基粉的粒度分析。累积筛分粒度级分析。取3–5克成粒物料，使用3英寸筛进行基粉造粒的筛分分析。

图9b：制剂1、制剂2、制剂3：成粒基粉的粒度分析。取3–5克成粒物料，使用3英寸筛进行基粉造粒的筛分分析。

图10a：制剂1、制剂2、制剂3：研磨成粒基粉的粒度分析。造粒后研磨过的基粉的累积筛分粒度级分析。

图10b：制剂1、制剂2、制剂3：研磨成粒基粉的粒度分析条形图。取95-105克成粒物料，使用8英寸筛网进行基粉(造粒后研磨过)的筛分分析。

图11：层状造粒中因辐照所致的养分降解。由图可见，当对伽马射线辐照过的干型培养基(剂量范围20-70kGy)实施分层策略时，与未辐照的对照培养基(0kGy)的分层策略相比，敏感成分和/或活性成分的稳定性均改善。

具体实施方式

本发明涉及一种干粉培养基组合物的生产方法，该组合物包含层状基础小颗粒或层状基础大颗粒。本发明提及的干粉培养基可以指干粉培养基(基础培养基或完全培养基)、干态浓缩细胞培养基、干粉补料或补充剂、干粉浓缩补料或补充剂、干态缓冲粉，它们可以合用、可以部分使用、也可以单用(当它是完全培养基时)，进行细胞培养。一般地，培养指体外培养细胞。下文将叙述一个生产层状培养基或补料小颗粒或大颗粒的方法。

细胞培养基、补料或补充剂等制剂可以含有以下化学品：随时间推移而不稳定(即降解、氧化等)的化学品，或因制剂本身的敏感成分与活性成分之间的不良相互作用而变得不稳定的化学品。例如，葡萄糖可与某些氨基酸或多胺反应，形成不合需要的美拉德反应产物，这类产物如溶于溶液即析出，而且如有以下条件中的一种或多种，则这类反应可被进一步增强：高能辐射或电离辐射、热损伤、光、环境化学品、长期贮存、机械振摇等。因此，必须在较低温度时保存细胞培养基，这增加了货物成本而且可能累赘。为克服这些挑战，需要一个保护细胞培养基成分的方法，否则所述成分会发生不良的相互作用，通过分离或组合细胞培养成分，可实现这种保护作用，例如，通过分层，可将活性成分与敏感成分进行空间隔离，以及在若干实施例中，将所述敏感成分层和/或活性成分与自由基清除剂或活性物质清除剂、抗氧化剂之类的清除成分及/或与中性成分(例如，参见下文例3的表格)混合，可实现所述保护作用。因此，上述问题的理想的解决方案会是为细胞培养体系提供细胞培养基或外加补料(基础型或完全型)，使得制剂中的敏感成分和/或制剂中的活性成分通过分层而在空间上相互分离。作为备选，也可将惰性成分和/或抗氧化剂之类的清除剂与敏感成分和/或活性成分混合，或者是在活性层与敏感层之间用惰性成分和/或抗氧化剂之类的清除剂形成夹层。所述层状粉末化细胞培养基的应用可延长产品的稳定期以及/或者增加一系列稳定性，如热稳定性、辐照稳定性或光化学辐射稳定性。

如需制备一种由多成分细胞培养基、补料或补充剂组成的层状大颗粒，可能是困难的，因为，以完全培养基为例，所含成分有80至100种，其中每一种成分的用量都必须精准，才能维持活细胞的生长，保持足够的蛋白滴度。

要制备层状大颗粒，可以采用喷雾器，如底部喷雾器，将溶剂喷射到未造粒的基粉或已造粒或团集的基粉上。粒度分布宽的颗粒都可以成层。示例性造粒粉包括但不限于使用喷雾/湿法造粒、流化床喷雾干燥等工艺制得的粉粒(参见Srivastava et al.；International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research 2010；2(4):236-246；该专利通过整体引用而并入本文)。这样，可在所述大颗粒上形成第一层。所述溶剂可以含有一种或多种化学品/成分或一种由一种或多种化学品/成分组成的微悬浮体。在一些实施例中，颗粒上可形成不同的厚度受控的化学层。在一个特定实施例中，所述溶剂中或任何阶段均不采用粘结剂进行颗粒成形或成层。换言之，不必因为添加了粘结剂或额外的造粒成分而更改细胞培养基、补料或浓缩物的配方。可以采用配方中已有的成分对颗粒成层。反之，如下文所述，可分离或组合配方成分。

化学品/成分的分离和成层：根据一系列特性，如化学活性/性质，对热损伤、辐射损伤或光化学损伤的易感性，或根据溶剂的溶解度等，层状颗粒中的化学品/成分可以分离或组合。

例如，大颗粒(也叫基础大颗粒)的核心(有时叫内核/内层)可包含一种或多种敏感成分。其它实例中，所述基础大颗粒可包含由敏感成分和抗氧化剂成分组成的混合物。其它实例中，所述基础大颗粒可包含由敏感成分、抗氧化剂成分和/或中性成分组成的混合物。例如，在一个特定实施例中，所述大颗粒的核心可包含最敏感的成分或由最敏感成分组成的一种混合物、以及由一种或多种中性(惰性)成分和/或一种或多种抗氧化剂成分组成的一种混合物。其它实例中，所述基础大颗粒本身可以成层，使得敏感成分和/或中性化学品和/或抗氧化剂成分可逐个互相叠加地进行成层。例如，最敏感成分可形成所述基础大颗粒的中心核，然后下一种敏感成分形成下一层，依此类推，并混合或随后包上中性/惰性成分，而且/或者抗氧化剂层作为所述基础大颗粒的最表层。作为备选，所述中性成分可位于核心，随后包上敏感成分，或反之。所述大颗粒的敏感/中性/抗氧化剂成层可遵循任一顺序，该顺序根据细胞培养基、补料或浓缩物的成分并由熟练技术人员根据细胞培养基或补料成分的特性确定。

接着，活性化学品可被包裹在基础大颗粒的敏感成分(内核或内层)外面。在若干实例中，所述活性化学品可混合在一起，并在所述基础大颗粒上涂敷一层。这一分离工艺可在同一大颗粒内实现敏感化学物质与活性化学物质的空间分离。在其它实例中，所述活性化学物质可逐个逐层涂敷，使活性最差的化学物质接触所述(敏感)基础大颗粒，而活性最强的化学物质(最表层)在空间上与所述基础大颗粒分离。作为备选，介入性中性/惰性化学层可将所述大颗粒的内部敏感层与外部活性层分开。

在一个优选实施例中，可采用流化床造粒法生产AGT团聚细胞培养基。对于一定的基础小颗粒，可以运用附加的流化床包衣工艺，例如，采用类似Wurster法的底喷成层法。在AGT细胞培养制剂中，所述底喷法可按特定顺序添加化学基团，在主体造粒成分周围形成受控层(即所谓的活性成层)，以便分离/隔开AGT成品中的活性化学成分。在若干方面，被包衣的小颗粒可被改性，使成分缓释，而在其它方面，所述活性层状AGT可为对以下因素不稳定的制剂成分提供保护：伽马射线辐照、环境降解、湿气所致的降解，等等。所述活性化学成分可与抗氧化剂混合，提供保护作用。在AGT颗粒上，可喷射一种或多种活性层，完成制剂配制。每层可以包含也可以不包含一种或多种抗氧化剂，提供额外稳定性。本法有可能提供一种终末灭菌的完全AGT培养基(即单组份干型)，不必进行二次处理(如喷雾干燥、微胶囊化)。所述层状颗粒培养基在37℃、室温、4℃、0℃等贮存1周、3周或更长时间后，可进行稳定性测试。进行耐辐照和/或耐环境降解、耐温变或数周稳定性等测试，用常规测定法测定保存的敏感成分，如维生素、乙醇胺等。

示例性敏感或不太稳定的化学品/成分包括但不限于维生素、多胺、生长因子、激素等。示例性活性化学品/成分包括但不限于微量金属或盐、某些活性氨基酸、糖(如可与包括一些氨基酸、多胺在内的其它成分形成加成物的葡萄糖)、金属离子等。示例性中性化学品/成分包括但不限于中性氨基酸、中性糖等。

定义

本文件所用术语“粉”或“干粉”指用于细胞培养的培养基粉或粉末化培养基组合物，以干型存在，其大体外观可以是自由流动的。术语“粉”包括团聚粉末。术语“基粉”或“干基粉”或“干粉”可互用，本文使用的这些术语一般指尚未成层的原始干粉组合物。术语“基粉”或“干基粉”或“干粉”可用任何方式造粒，例如，在流化床处理装置中，生产“基础大颗粒”或“团聚大颗粒”，它们随后再用溶剂“成层”。但这并非意味着，层状小颗粒(大颗粒)必须源于基础大颗粒。所述层状小颗粒可源于简单的未成粒的粉末，该粉末也可采用喷雾技术层状。为方便起见，未层状的某种成粒或团聚的原始小颗粒可被称为“基础大颗粒”。对应地，未成粒的干粉原始小颗粒在层状之前有时可称为“基础小颗粒”。这并非意味着，原始物料都是完全没有干粉或团聚大颗粒的。在用溶剂层状前，原始物料有时可有由干粉和团聚大颗粒组成的混合物。所述干粉或团聚粉末(如适用)可以是基础培养基粉、完全培养基粉、细胞培养补料、细胞培养补充剂、细胞培养基或补料浓缩物或氨基酸混合物。

术语“细胞培养基组合物”或“粉末化培养基组合物”或“培养基粉”或“干粉制剂”或“培养基制剂”可以互用且大体包括，例如本发明的培养基、培养基补充剂、培养基亚群或缓冲液，可不限于基础培养基、完全培养基、培养基补料、培养基补充剂、培养基添加剂、浓缩培养基、浓缩补充剂和补料、氨基酸或氨基酸群、短肽、维生素、缓冲液、盐、微量成分等。这些术语一般指在细胞培养过程中添加的成分，熟练技术人员会清晰明白何时或如何使用这些术语。

术语培养基“成分”或“组分”指源于化学品或生物的任一化合物，可用于细胞培养，以维持或促进细胞的生长和增殖。术语“成分”、“养分”、“组分”、“物质”均可互用，且均旨在指称所述化合物。细胞培养基中所用的典型组分包括氨基酸、盐、金属离子、痕量元素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、缓冲盐、蛋白质等等。可促进或维持离体细胞培养的其它组分可由本领域的技术人员按具体需求选择。

喷雾器在一些实施例中，可将成层所用的“成分”喷射到所述基础小颗粒或基础大颗粒上。在一些实施例中，可将单一“成分”喷射到所述基础小颗粒或基础大颗粒上。在其它实施例中，喷射了多种“成分”。喷射多种“成分”时，这些成分可按其活性、溶解度、特性(如氨基酸与糖的相互作用)组合在一起，作为混合物进行喷雾。作为备选，所述成分也可逐个依次喷雾。

术语“溶剂”指可溶解一种或多种有待成层的“成分”的任一液体，如水、水化剂、缓冲液，或乙醇类有机溶剂等。成层可通过喷射含有已溶解的所述“成分”或“成分混合物”的液体而进行。所述溶剂可溶解一种或多种“相似”成分，例如，乙醇可溶解脂质、脂肪酸、胆固醇等；所述溶剂也可同时溶解一种或多种“相异”成分，如“活性成分”和“抗氧化剂”，很可能因为抗氧化剂或其它这样的分子/成分有助于稳定或减缓活性物质或基团的降解。所述溶剂可依次喷雾也可一次喷雾。依次喷雾时，所喷溶剂均可有相同成分，也可有不同成分。在一些实例中，可向同一基础小颗粒或大颗粒上喷射多种溶剂，形成多层基础小颗粒或大颗粒。在一些实例中，所述多层基础小颗粒或大颗粒在空间上分开了活性或反应性物质(或组分)与敏感物质。在一个实施例中，溶剂导入速率可介于约1克/分钟与约30克/分钟之间。在另在一个实施例中，溶剂导入速率可约为5克/分钟。

术语“喷雾器”指将携带有一种或多种成分的液体喷射到所述基础小颗粒或基础大颗粒上的设备。喷雾器可从由以下喷雾器组成的组别中选择：顶喷喷雾器、底喷喷雾器和切向喷雾器。可用喷雾器制造成粒小颗粒(如团聚小颗粒)，而用第二喷雾器(在一个实施例中，使用一个底喷喷雾器)将所述溶剂和所述成分按上述目的进行成层。

“活性物质”指那些易与培养基或补料中的其它成分反应的成分，从而产生不利产物，如加成物、交联产物、沉淀物等。活性物质可自发反应也可被激活而反应，激活因素有高温暴露、辐照暴露、存在其它化学品或活性物质等。示例性活性物质包括但不限于金属离子、糖加成物、微量金属成分、活性氨基酸等。

“敏感物质”指因与培养基或补料中的活性更强的物质或基团发生意外反应而易被破坏的那些成分。敏感(或不稳定)物质可自发反应也可被激活而与其它成分尤其是活性物质发生反应，激活因素有高温暴露、辐照暴露、存在其它化学品或活性物质等。示例性敏感物质包括但不限于维生素、某些氨基酸、诸如乙醇胺之类的多胺、生长因子类生物成分等，随着时间推移，或高温，或辐照暴露，或这些因素中的一个或多个的组合，它们被破坏。

短语“细胞培养基”、“细胞介质”和“培养基制剂”(其中的培养基或介质均为复数)指某种支持细胞培养和/或生长的营养液；这些短语可互用。

术语“合并”指混合或掺和某一细胞培养基制剂的各组分。液态或粉末态或一种或多种粉末和一种或多种液体等情况下，均可合并。另一个实例中，可掺和两种或两种以上的粉末化成分，然后团聚，产生一种复杂混合物，如培养基、培养基添加物、培养基亚群或缓冲剂。

术语“粒度”指通过“筛分”测量确定的所述层状小颗粒的尺寸(可以是尺寸分布)。在一个实施例中，所述层状小颗粒或基础大颗粒的尺寸可约为0.05毫米至7毫米。一个优选实施例中，所述层状小颗粒或基础大颗粒的尺寸可约为0.05毫米至约0.5毫米、约0.05毫米至约1毫米、约0.05毫米至约2毫米、约0.05毫米至约3毫米、约0.05毫米至约4毫米、约0.05毫米至约5毫米、约0.05毫米至约6毫米、约0.05毫米至约0.1毫米、约0.05毫米至约0.2毫米、约0.05毫米至约0.3毫米、约0.05毫米至约0.4毫米、约0.1毫米至约1毫米、约0.1毫米至约2毫米、约0.1毫米至约3毫米、约0.1毫米至约4毫米、约0.1毫米至约5毫米、约0.1毫米至约6毫米、约0.5毫米至约1毫米、约0.5毫米至约2毫米、约0.5毫米至约3毫米、约0.5毫米至约4毫米、约0.5毫米至约5毫米、约0.5毫米至约6毫米、约0.5毫米至约7毫米、约1毫米至约2毫米、约1毫米至约3毫米、约1毫米至约4毫米、约1毫米至约5毫米、约1毫米至约6毫米、约1毫米至约7毫米。另一实施例中，所述层状小颗粒或大颗粒的尺寸可约大于0.5毫米、约大于0.4毫米、约大于0.3毫米、约大于0.2毫米、约大于0.6毫米、约大于0.7毫米、约大于0.8毫米、约大于0.9毫米、约大于1毫米。

示例

虽然已经在此示出和描述本发明的优选实施例，但本领域的技术人员应清楚，此类实施例仅是作为实例而提供的。于是本领域的技术人员会意识到，在不偏离本发明的情况下，可发生许多差异、变化和替代。应当理解，本文所述本发明的实施例的各种替代方案可被用于实施本发明。下述权利要求旨在限定本发明的范围，并从而涵盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。

实例1：层状细胞培养基大颗粒的示例性制造工艺-原型A和原型B(采用底喷喷雾器)

将造粒用的顶喷喷雾器与包衣用的底喷喷雾器(如Wurster)相结合，应用成层法设计和生产颗粒制剂。在一个实例中，用一台带有含6英寸Wurster内芯的GPCG 1.1流化床的2升造粒干燥包衣机，进行底喷包衣。底喷成层工艺中，每次造粒均可有不同的层成分。例如，原型A和原型B就属于这种情况(参见图1a、1b，图2a、2b，和图3a、3b)。用于原型A和原型B的成粒基础培养基，SKU号PL003021，批号1024MER1601。基础培养基是通过顶喷造粒而生产的。

原型A如下成层：溶液#1(维生素B-12)，SKU号PL003023，批号1101MER1601。

喷射#1(每批200倍浓缩液，取约95毫升)原型B如下成层：使用溶液#2(NaCl盐溶液)，SKU号PL003024，批号1101MER1602。使用溶液#3(盐酸硫胺素溶液)，SKU号PL003029，批号1109MER1601。喷射#2(每批500倍浓缩液，取约38毫升)，接着喷射#3(每批500倍浓缩液，取约38毫升)。最后喷射#2(每批500倍浓缩液，取约38毫升)。原型A和原型B的扫描电镜图像如图2a和图2b所示。干燥层状产品的扫描电镜图显示，与成粒基粉(顶喷)相比，原型A(底喷)的表面比较光滑。扫描电镜图显示，与成粒基粉(顶喷)相比，原型B的涂层表面粗糙，可能因为其最表层是盐层(NaCl)。

实例2：复溶层状补料培养基测定中的细胞活力和生长的比较

复溶层状补料培养基(供试品＝试验原型A)与普通补料培养基(阳性对照品)的测定中的细胞活力和生长比较(参见图3a和图3b)。本测定中，在含有Efficient Feed B(添加物)#A2530(阳性对照)的CD-CHO(培养基)#12490中，培养DG44-IgG细胞系；而供试品是复溶的层状补料培养基(原型A)；阴性对照＝补加葡萄糖的培养基。

所有细胞均如下继代培养：3天继代培养3代，然后将各代细胞分成3×10e5个活细胞/毫升。3天后达到第4代时，进行每日细胞计数。所有供试和对照的补料培养基均先用液体复溶，再除菌过滤。如图3a和图3b所示，与添加了非层状的阳性对照补料培养基相比，原型A呈现较高的活力百分比。细胞生长方面，原型A呈现的活细胞计数是约6.6×10e6个细胞/毫升(生长率)，即仅稍低于添加了阳性对照补料的细胞培养液中的活细胞计数(～7.5×10e6)。为了比较，可将无添加物的细胞培养液标为葡萄糖补料(阴性对照)。

实例3：细胞培养用层状培养基/补料大颗粒的示例性生产工艺

将造粒用的顶喷喷雾器与包衣用的底喷喷雾器(Wurster)相结合，用成层法设计和生产颗粒制剂。参见图4、图5a和图5b。

基粉含有氨基酸、右旋葡萄糖、缓冲盐和选用维生素(SKU 12681)。

先用混料机(4夸脱)混合粉末，接着用顶喷工艺(参见表1)和设备(包括但不限于Niro MP-1、蠕动泵、Quadro Comil U5)及溶剂(如水)造粒，然后用Fitzmill L1A研磨。这里，所述基粉是先造粒后成层，但该基粉的造粒可以不是必要步骤。可采用顶喷、底喷或切向喷雾方式造粒。通常可采用底喷成层方式成层，且各次造粒的包衣层的成分可不同。关于顶喷造粒参数，参见下面的表1和图4–11。

表1：示例性顶喷造粒参数

成粒基粉需经粒度分析和扫描电镜分析(参见图6a和图6b、图7a和图7b、图8a和图8b)。可用于制造大颗粒的示例性工艺参数如下，参见表2：

表2(上文)中，底喷包衣是用配有一个6英寸改型喷杯的Niro MP-1喷枪、一个Schlick 970喷嘴和一个1.2毫米液体喷雾器(0.5-4.0毫米可选)进行的。在基座上方4厘米处固定喷嘴，气柱间隙为20毫米(可变)。制剂1有7层包衣，制剂2有8层包衣。各层包衣操作均至少持续20分钟，以确保包衣均匀。每两层包衣之间，通过管道用5毫升水清洗。操作结束时，有10分钟的干燥步骤，此时，雾化器关闭，进口温度被设为40℃。

制剂1有7层包衣，制剂2有8层包衣。制剂1和制剂2的各喷雾层的示意图如图5a和图5b所示，其说明也在下面的表3中给出。

表3：制剂1和制剂2的描述：基础大颗粒内容物和喷雾包衣。

这些描述以赛默飞世尔目录产品(混合物目录产品)CD OptiCHO AGT SKU#A11222-05作为参照。

制剂1相关：概念设计#1：为实现对敏感基团的保护，采用底喷成层(包衣)法(多层、多组分)，包层由以下几层组成：

将基础粒化组分(如右旋葡萄糖、盐、氨基酸、缓冲剂和若干维生素)包上第一层抗氧化剂(“核”)。接着，包上第二层具有抗氧性的养分。随即，包上第三层，该层含有与抗氧性养分混合在一起的敏感养分(即其浓度因伽马射线辐照而下降)。然后，可包上第四层，作为屏障，将敏感组分与其余三层分开，这三层是盐层、附加分隔层、外部抗氧层(“壳”)。

制剂1具有8层包衣，包衣总厚约为10微米，且D50＝180微米。底喷包衣前后，均进行了筛分分析(参见图6a和图7a)。包衣大颗粒的平均粒径小于原始未包衣的大颗粒的平均粒径，因为工艺过程中有颗粒摩耗。筛分分析所用的是Retsch振动筛，但也可用其它任何振筛机。详细信息：8英寸筛，振幅6，脉动式，振动时长6分钟。

用底喷法生产了一种示例性层状AGT原型或“洋葱皮”式层状AGT。所制的层状AGT原型中，活性基团被分离/分层。本法可放大至1-2公斤的工艺规模。用分析方法识别并确认了层状结构。示例性原型产品可能由以下三层组成：主体造粒成分，溶液A＝维生素，溶液B(或混悬液)*＝抗氧性氨基酸层(例如，半胱氨酸和蛋氨酸)，溶液C＝痕量元素(或其它活性氧成分)。*备注：一次造粒中，可将半胱氨酸配成溶液。在溶液中，半胱氨酸有可能形成胱氨酸(二聚体)。避免形成胱氨酸的一个方法是，在二次造粒中，将半胱氨酸配成微悬浮液。

制剂2相关：概念设计#2：为实现对活性基团的隔离，采用底喷成层(包衣)法(多层、多组分)，包层由以下几层组成：

基础粒化组分(如右旋葡萄糖、盐、氨基酸、缓冲剂和若干维生素)。溶液A含有敏感养分(即其浓度因伽马射线辐照而下降)。溶液B含有抗氧性养分。溶液C含有对基础粒化成分有反应活性的养分。

制剂2有7层包衣，包衣总厚约为5微米，且D50＝180微米。“洋葱皮”式层状(薄层)。底喷包衣前后，均进行了筛分分析(参见图6b和图7b)。

作为一个示例性层状培养基，制剂2的制备过程如下所述：基础粒化成分-造粒步骤的培养基化学品列表；第一内层；(维生素，含抗氧化剂)＝例如，维生素+半胱氨酸-HCl-H₂O+蛋氨酸＝第二层；(多胺，含抗氧化剂)*＝例如，半胱氨酸和蛋氨酸+多胺+乙醇胺＝第三层；盐#1＝(铁螯合物溶液)，例如，EDTA+七水硫酸亚铁＝第四层；盐#2[痕量元素溶液A(0116031)]＝第五层；盐#3[痕量元素溶液B(0116026)]＝第六层。

制剂3相关：作为一个示例性层状培养基，制剂3(F3)的制备过程如下所述：用底喷法(“核-壳”成层)生产“核-壳”层状AGT。折算到微悬浮液成层法实践(即放大到1-2公斤规模)，制剂3(F3)的描述如下：基础粒化成分，第一内层，包衣#2(维生素，含抗氧化剂)＝维生素+半胱氨酸-HCl-H₂O+蛋氨酸＝第二层；(抗氧化剂微悬浮液)*＝(在Pluronic/水载体溶液或PEG/水载体溶液中的微粒化/混悬的半胱氨酸和蛋氨酸)＝第三层；盐#1＝(铁螯合物溶液)＝EDTA+七水硫酸亚铁＝第四层；盐#2[痕量元素溶液A(0116031)]＝第五层；盐#3[痕量元素溶液B(0116026)]＝第六层。或者合并第4、5和6层。

*备注：在溶液中，半胱氨酸有可能形成胱氨酸(二聚体)。避免形成胱氨酸的一个方法是，将半胱氨酸配成微悬浮液。检测用pluronic或PEG作为微悬浮液的溶剂的可行性，因为这些聚合物与水溶性和水不溶性化合物均相容。

底喷溶液的配制工艺：用底喷法生产“洋葱皮”式层状AGT。本文描述了制剂2(F2)或制剂3(F3)的制备步骤。主体造粒成分(内核)。*备注：可将含抗氧化剂的多胺配成溶液，参见下文。第1步：预先配制多胺溶液(pH＝6.4-6.6)并除菌过滤(0.2微米)。第2步：往第1步制备的多胺溶液里添加抗氧化剂，搅拌该溶液(磁力搅拌器)，直至溶解(形成澄清液)。第3步：测量并记录该澄清液的pH(pH＝2.0-3.0)。第4步：使用5N NaOH将该溶液的pH值调至6.5–7.5。该溶液应当仍然澄清且可用于生产底喷成层造粒产品。

制剂1和制剂2的物理性质

为了比较起见，还分析了基础粒化小颗粒(图9a和图9b)和研磨基础粒化小颗粒(图10a和图10b)的粒度。

实例4：伽马射线辐照前后对制剂1和制剂2的分析检测

对用上述方法制备的干燥层状细胞培养基(制剂1和制剂2)，进一步检测了伽马射线辐照稳定性。本实验旨在判定能否通过仅改变工艺条件(本文指层状培养基/补料成分)制备抗辐射的培养基(即，不改变细胞培养基的配方)。用伽马射线辐照处理所述层状培养基，辐照剂量介于约20kGy和约70kGy之间，如下表所示。通过测量伽马射线辐照前后的敏感化学标志物(如硫胺素、维生素B-12等维生素)的浓度，分析所得层状粒化培养基的伽马射线辐照耐受性。对每一制剂(F1和F2)和每个伽马射线辐照条件，均用MilliQ超纯水制备两批1升培养基。检测(HPLC法)各样品的色氨酸、烟酰胺、叶酸、硫胺素和维生素B12。剂量列列出了本研究中的制剂所接受的伽马射线辐照的平均剂量。结果见下文的表6和图11。另外，对所得大颗粒也进行了物理表征(表4和表5)。发现用底喷成层技术制备的多成分细胞培养基有极好的含量均匀度。还注意到，基础粒化粉末周围的各层的受控排列，提供了将同一配方里的活性化学品与敏感化学品进行物理分离的方法。分组层的组合进一步改善了产品在暴露于各状况下的化学稳定性，这些状况会造成热活性或热降解、光化学活性或光化学降解、辐射活性或辐射降解。

表6：辐射分析表(剂量单位：kGy)

表6小结和制剂1和制剂2的其它测定：硫胺素降解了9％且降解速率与剂量相关，维生素B12降解率多达49％且降解速率与剂量相关。硫胺素和维生素B12的降解如图11所示。60–70kGy伽马射线辐照下，跟目录对照品相比，制剂1和制剂2的维生素B12降解率分别减少了18％和26％(成层造粒中，保护了对伽马辐照敏感的养分)。伽马辐照处理：目录产品CD OptiCHO AGT对照品、制剂1和制剂2都被运至某地，如美国思泰瑞公司(Steris)，进行伽马辐照处理。全部样品均在5℃储存，并在干冰熔点温度(-78℃)运输和接受辐照。每一制剂被分成四批并保持在(a)5℃或(b)被总剂量为20–30kGy的伽马射线辐照、(c)被总剂量为30–40kGy的伽马射线辐照，或(d)被总剂量为60–70kGy的伽马射线辐照。

所有检测辐射剂量水平下，色氨酸和烟酰胺的含量水平都在未辐照培养基的对应含量的3％以内。各辐射剂量下，叶酸含量均在未辐照培养基的叶酸含量的6％以内。伽马辐照处理：目录产品CD OptiCHO AGT对照品、制剂1和制剂2都被运至某地，如美国思泰瑞公司(Steris)，进行伽马辐照处理。全部样品均在5℃储存，并在干冰熔点温度(-78℃)运输和接受辐照。每一制剂被分成四批并保持在(a)5℃或(b)被总剂量为20–30kGy的伽马射线辐照、(c)被总剂量为30–40kGy的伽马射线辐照，或(d)被总剂量为60–70kGy的伽马射线辐照。

上述工艺均适用于任何类型细胞的培养，如哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞等，这些细胞从复溶的本专利说明书通篇描述的干型层状细胞培养基获得营养保障。如上文若干实施例所述，应用一层由配成微悬浮液或作为成粒细胞培养基包衣的组分组成的包层，也属于本发明的范围内。按大量排列方式，细胞培养基组分可以被组合、分离或安排在围绕任一种粉末化或成粒的细胞培养基/补料的包衣层内，使得本方法可用于广泛的应用场合，比如，提高热稳定性、抗辐射性、经改造的溶解特性等，本领域的技术人员会容易理解这一点。

Claims (43)

1.一种制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，包括：

i)使干粉悬浮在流化床装置中的运动气柱中；

ii)使用喷雾器将至少一种溶剂引入步骤(i)的所述干粉中，形成层状基础小颗粒；

iii)干燥所述层状基础小颗粒。

2.一种制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，包括：

i)使干粉悬浮在流化床装置中的运动气柱中；

ii)使用第一喷雾器将第一溶剂引入步骤(i)的干粉上，形成基础大颗粒；

iii)用第二喷雾器将至少一种第二溶剂引入步骤(ii)中的基础大颗粒上，形成层状基础大颗粒；

iv)干燥所述层状基础大颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述干粉是基础培养基粉末、完全培养基粉末、细胞培养补料、细胞培养补充剂、细胞培养基或补料浓缩物或氨基酸混合物。

4.根据权利要求1所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第一喷雾器从由以下项构成的组中选择：顶部喷雾器、底部喷雾器和切向喷雾器。

5.根据权利要求2或3所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第一喷雾器或第二喷雾器从由以下项构成的组中选择：顶部喷雾器、底部喷雾器和切向喷雾器。

6.根据权利要求2或3或5所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第二喷雾器是底部喷雾器。

7.根据权利要求2至3或5至6中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第二喷雾器向所述基础大颗粒上喷射多种溶剂，形成多层基础大颗粒。

8.根据权利要求1或3至4中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第二喷雾器向所述基础小颗粒上喷射多种溶剂，形成多层基础小颗粒。

9.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第二喷雾器依次喷射所述多种溶剂，每两次喷射步骤之间进行间歇的干燥步骤。

10.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述第二喷雾器依次喷射所述多种溶剂，每两次喷射步骤之间进行任意间歇的干燥步骤。

11.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述多种溶剂中的每种溶剂均含有每种溶剂中的一种组分。

12.根据权利要求11所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述多种溶剂中的每种溶剂均含有相同组分。

13.根据权利要求11所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述多种溶剂中的每种溶剂均含有不同组分。

14.根据权利要求1至11和13中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中每种溶剂均含有混合组分。

15.根据权利要求14所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述组分分为活性物质和敏感物质。

16.根据权利要求15所述的细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述活性物质和所述敏感物质被分别喷射，得到层状大颗粒。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活性物质从由以下项构成的组中选择：一种或多种痕量元素、一种或多种活性氨基酸、一种或多种活性氨基酸、一种或多种金属盐、一种或多种酸溶性活性基团、一种或多种醇溶性活性基团及一种或多种pH调节剂基团。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述敏感物质从由以下项构成的组中选择：一种或多种多胺、一种或多种维生素、一种或多种生长因子及一种或多种不稳定氨基酸。

19.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述方法所用的进气温度约为20℃至30℃。

20.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述方法所用的进气的温度约为25℃。

21.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述维生素从由以下项组成的组中选择：维生素B12、生物素、胆碱、叶酸、烟酰胺、吡哆辛、核黄素、硫胺素、抗坏血酸及对氨基苯甲酸(PABA)。

22.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述干燥步骤的温度约为50℃至60℃。

23.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述基础小颗粒或所述基础大颗粒被干燥至含水量约为0.5％至10％。

24.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述溶剂包含活性物质。

25.根据前述权利要求中任一项所述的制备细胞培养用培养基或补料组合物的方法，其中所述溶剂还至少包含抗氧化剂。

26.根据前述权利要求中任一项获得所述层状基础小颗粒或所述层状基础大颗粒。

27.一种用于生产营养培养基层状小颗粒、营养培养基补充剂层状小颗粒、营养培养基亚组层状小颗粒的方法，所述方法包含根据前述权利要求中任一项制造层状培养基小颗粒，其中所述基础小颗粒或基础大颗粒上的至少一层包含活性物质，而且/或者所述基础小颗粒或基础大颗粒上的至少一层包含敏感物质。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活性物质从由以下项构成的组中选择：一种或多种痕量元素、一种或多种活性氨基酸、一种或多种活性氨基酸、一种或多种金属盐、一种或多种酸溶性活性基团、一种或多种醇溶性活性基团及一种或多种pH调节剂基团。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述敏感物质从由以下项构成的组中选择：一种或多种多胺、一种或多种维生素、一种或多种生长因子及一种或多种不稳定氨基酸。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干粉从由以下项构成的组中选择：维生素、散装无机盐和糖。

31.一种在由前述任一权利要求的所述层状培养基小颗粒复溶而得的液体中进行细胞培养的方法，包括：

i)在适宜的液体或缓冲液里将所述层状培养基小颗粒复溶；其中所述层状培养基小颗粒是细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物；

ii)在有利于细胞生长的条件下，在所述复溶液体中培养细胞。

32.根据权利要求31所述的细胞培养法，其中所述培养用于生产增加的量的多肽。

33.根据权利要求31至32的所述细胞培养法，其中所述多肽是重组多肽。

34.根据权利要求31至33所述的细胞培养法，其中与含有不源于所述层状培养基小颗粒的液体培养基的培养液相比，所述培养可以增加产物产量，加快细胞生。

35.一种试剂盒，包含：

i)包含根据前述权利要求中任一项所述的层状小颗粒或大颗粒的第一容器；其中所述层状小颗粒或大颗粒是细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物；

ii)所述细胞培养用层状小颗粒或大颗粒的使用说明书。

36.一种体系，包含：由根据前述权利要求中任一项所述的层状培养基小颗粒复溶所得的液体培养基，及细胞。

37.根据权利要求36所述的体系，其中所述复溶液体培养基用于培养可生成重组多肽、病毒、分泌蛋白质的细胞，或用于培养悬浮细胞或贴壁细胞。

38.根据上述权利要求中任一项制备的用于培养所述的细胞或者补料组合物的培养基，或者根据权利要求35所述的试剂盒，或者根据权利要求36-37所述的体系，其中所述氨基酸选自所述二十种氨基酸中的一种或多种酸、其盐或其衍生物。

39.根据上述权利要求中任一项所述制备的细胞培养用培养基或补料组合物，或者根据权利要求35所述的试剂盒，或者根据权利要求36-37所述的体系，其中所述氨基酸选自以下项中的一项或多项：甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和赖氨酸。

40.使用由上述权利要求中任一项的方法获得的层状小颗粒或大颗粒用于培养细胞。

41.根据权利要求40所述的用途，其中所述细胞为哺乳动物细胞。

42.根据权利要求40-41所述的用途，其中所述细胞从由以下项构成的组中选择：CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、293细胞和VERO细胞。

43.根据权利要求40-41所述的用途，其中所述细胞是植物细胞、动物细胞、真核细胞、藻类细胞、真菌细胞和细菌细胞。