CN108697804B - 用于软骨损伤的检测和治疗的微米和纳米装置 - Google Patents

用于软骨损伤的检测和治疗的微米和纳米装置 Download PDF

Info

Publication number
CN108697804B
CN108697804B CN201680069894.7A CN201680069894A CN108697804B CN 108697804 B CN108697804 B CN 108697804B CN 201680069894 A CN201680069894 A CN 201680069894A CN 108697804 B CN108697804 B CN 108697804B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoparticle
cartilage
biopolymer
ligand
biocompatible
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680069894.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108697804A (zh
Inventor
约瑟夫·博雷利
唐力平
J·周
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yue SefuBoleili
University of Texas System
Original Assignee
Yue SefuBoleili
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yue SefuBoleili, University of Texas System filed Critical Yue SefuBoleili
Publication of CN108697804A publication Critical patent/CN108697804A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108697804B publication Critical patent/CN108697804B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/195—Chemokines, e.g. RANTES
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70585—CD44
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/105—Osteoarthritis, e.g. cartilage alteration, hypertrophy of bone

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了靶向探针、成像探针和用作药物的探针以治疗损坏的软骨，其中所述探针靶向损伤的组织，然后可以成像和/或释放药剂以引发周围软骨细胞从健康组织向损伤的组织迁移和/或募集滑膜干细胞。

Description

用于软骨损伤的检测和治疗的微米和纳米装置
发明的技术领域
本发明涉及用于检测和治疗损伤的软骨的微型支架的开发。我们的发明基于微米或纳米尺寸的支架的设计，其可以(1)通过靶向活化的/损伤的细胞诊断损伤的软骨，和(2)通过释放生物分子以促进自体干细胞和软骨细胞应答来修复损伤的软骨(募集和软骨再生)。
背景技术
在不限制本发明的范围的情况下，就用于开发用于检测和治疗损伤的软骨的微型支架的组合物和方法描述本发明的背景。
支架由生物可降解的材料制成，其可通过针注射给予，并且还具有释放生物分子的能力。为了细胞靶向，支架含有对于活化的/损伤的/或凋亡的细胞而言独特的配体。这些配体包括用于CD44受体的透明质酸(在活化的软骨细胞上被上调)，用于活化的巨噬细胞的叶酸。配体可以是支架的部分或被涂覆在支架上和支架内部。
用于促进干细胞应答的生物分子包括促红细胞生成素、基质来源因子。生物分子可通过物理吸附或化学结合负载到支架载体中。
发明内容
创伤后骨关节炎(PTOA)是最常见的关节炎形式之一。PTOA被认为是关节软骨损伤的结果。传统上，已经使用X射线和MRI来检查发生于损坏的软骨中的解剖变化。不幸的是，没有方法检测早期软骨损伤，特别是在细胞水平。以前的研究已表明，PTOA中软骨细胞凋亡和蛋白聚糖消耗之间存在良好的关系。
关节炎是以炎症为特征的关节疾病。有许多类型的关节炎。关节炎的类型范围从与软骨磨损有关的那些到与由过于活跃的免疫应答导致的炎症有关的那些。
关节炎的标准治疗始于减轻体重、低强度运动和关节周围的肌肉强化，以及口服非甾体抗炎药(NSAID)。为了减少通常与长期使用NSAID和甾体有关联的全身性并发症，关节内注射可的松或润滑聚合物(Hylamers)。尽管这些药物治疗有效地减少不适和许多症状，但它们对于改变关节炎的自然病程无效。这些治疗的失败使手术成为必需，其通常涉及清创、重建和使用人工植入物替换磨损的关节表面。像药理学方法一样，常规的外科疗法无法恢复关节软骨关节的全部功能。此外，关节假体可能与天然组织不良地结合，引起异物反应并且寿命有限，每十到十五年需要多次手术干预。有效和持久治疗的缺乏使得可以改善关节的愈合，同时减少炎症反应的新的治疗方法成为必要。本发明被设计为永久治愈关节炎。
本发明提供了用于使损坏的软骨成像的靶向探针。靶向探针可靶向损伤的组织，然后释放趋化因子以引发周围软骨细胞从健康组织向损伤的组织迁移。靶向探针可以靶向损伤的组织，然后释放趋化因子以募集滑膜干细胞。干细胞随后分化成软骨细胞，该软骨细胞然后参与软骨再生。在一些实施方案中，要求保护的发明可以实施所有这三种功能，而在其他实施方案中，要求保护的发明可以实施这些功能中的全部、一种或两种。
本发明提供了关节炎软骨靶向探针，其用作药物以靶向和/或治疗关节炎软骨，其中关节炎软骨靶向探针包含生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体是与CD44受体相互作用的透明质酸，与叶酸受体相互作用的叶酸或两者；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签。
本发明提供了损坏软骨靶向探针，其用作药物以靶向和/或治疗损坏的软骨，其中损坏软骨靶向探针包含生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签。
本发明提供了损坏软骨靶向探针用于识别损坏的软骨的用途，包括：提供损坏软骨靶向探针，其包含生物相容的透明质酸聚合物，所述生物相容的透明质酸聚合物通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，其中交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签；使疑似被损坏的软骨与损坏软骨靶向探针接触；和检测损坏软骨靶向探针。
本发明提供了软骨靶向探针，其用作药物以通过将干细胞、软骨细胞或两者募集到损坏的软骨来治疗损坏的软骨，其中软骨靶向探针包含：生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；与聚合物靶向探针缔合的选自SDF 1、SDF 1β、Epo、CCL2、CCL16、VEGF、TGF-β1和TGF-β3的一种或多种趋化因子，其中一种或多种趋化因子被释放以募集干细胞、软骨细胞或两者；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签。
本发明提供了软骨靶向探针，其用作药物以通过增加成软骨分化来治疗损坏的软骨，其中软骨靶向探针包含：生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；与聚合物靶向探针缔合的选自TGF-β1和TGF-β3的一种或多种TGF活性剂，其中一种或多种TGF活性剂被释放以引发较高的成软骨分化；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签。
本发明提供了损坏软骨靶向探针用于识别具有小至1mm的小损伤的损坏的软骨的用途，包括：提供损坏软骨靶向探针，其包含生物相容的透明质酸聚合物，所述生物相容的透明质酸聚合物通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，其中交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签；使疑似具有小至1mm的小损伤的软骨与损坏软骨靶向探针接触；和检测损坏软骨靶向探针。
在一些实施方案中，配体是透明质酸，并且一种或多种细胞表面靶点是CD44受体。在其他实施方案中，配体是叶酸，并且一种或多种细胞表面靶点是叶酸受体。
本发明提供了损坏的/损伤的软骨的成像探针，其用作药物以靶向和/或治疗损坏的软骨，其中损坏的软骨的成像探针包含生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体是与CD44受体相互作用的透明质酸、与叶酸受体相互作用的叶酸或两者；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中可检测的标签可以在损坏的软骨处被检测到并且用于生成损坏的软骨的图像。
对软骨的损坏可以来自任何来源，包括机械创伤、物理创伤、压迫创伤、关节炎损坏、炎性损坏或其组合。
在任意的实施方案中，聚合物靶向探针可以包含具有以下分子量的生物相容的透明质酸聚合物：约10K、60K、700k、1.5M或其增量变化(例如8K、9K、10K、11K、12K、13K、14K、15K、16K、17K、18K、19K、20K、21K、22K、23K、24K、25K、26K、27K、28K、29K、30K、31K、32K、33K、34K、35K、36K、37K、38K、39K、40K、41K、42K、43K、44K、45K、46K、47K、48K、49K、50K、51K、52K、53K、54K、55K、56K、57K、58K、59K、60K、61K、62K、63K、64K、65K、66K、67K、68K、69K、70K、71K、72K、73K、74K、75K、76K、77K、78K、79K、80K、81K、82K、83K、84K、85K、86K、87K、88K、89K、90K、100K、110K、120K、130K、140K、150K、160K、170K、180K、190K、200K、210K、220K、230K、240K、250K、260K、270K、280K、290K、300K、310K、320K、330K、340K、350K、360K、370K、380K、390K、400K、410K、420K、430K、440K、450K、460K、470K、480K、490K、500K、510K、520K、530K、540K、550K、560K、570K、580K、590K、600K、610K、620K、630K、640K、650K、660K、670K、680K、690K、700K、710K、720K、730K、740K、750K、760K、770K、780K、790K、800K、810K、820K、830K、840K、850K、860K、870K、880K、890K、900K、1M；1.2M；1.3M；1.4M；1.5M；1.6M；1.7M；1.8M；1.9M；1.10M；1.11M；1.12M；1.13M；1.14M；1.15M；1.16M；1.17M；1.18M；1.19M；1.20M；1.21M；1.22M；1.23M；1.24M；1.25M；1.26M；1.27M；1.28M；1.29M；1.30M；1.31M；1.32M；1.33M；1.34M；1.35M；1.36M；1.37M；1.38M；1.39M；1.40M；1.41M；1.42M；1.43M；1.44M；1.45M；1.46M；1.47M；1.48M；1.49M；1.50M；1.51M；1.52M；1.53M；1.54M；1.55M；1.56M；1.57M；1.58M；1.59M；1.60M；1.61M；1.62M；1.63M；1.64M；1.65M；1.66M；1.67M；1.68M；1.69M；或1.70M)，并且其交联比为1:4、1:3、1:2、1:1、1:3.9、1:3.5、1:2.3、4:1、3:1、2:1及其增量变化(例如1:4；1.1:4；1.2:4；1.3:4；1.4:4；1.5:4；1.6:4；1.7:4；1.8:4；1.9:4；2:4；2.1:4；2.2:4；2.3:4；2.4:4；2.5:4；2.6:4；2.7:4；2.8:4；2.9:4；3:4；3.1:4；3.2:4；3.3:4；3.4:4；3.5:4；3.6:4；3.7:4；3.8:4；3.9:4；4:1；4:1.1；4:1.2；4:1.3；4:1.4；4:1.5；4:1.6；4:1.7；4:1.8；4:1.9；4:2；4:2.1；4:2.2；4:2.3；4:2.4；4:2.5；4:2.6；4:2.7；4:2.8；4:2.9；4:3.0；4:3.1；4:3.2；4:3.3；4:3.4；4:3.5；4:3.6；4:3.7；4:3.8；或4:3.9)。
可检测的标签是荧光染料、放射性标签、金属、纳米颗粒或其组合。在任意的实施方案中，聚合物靶向探针可以是生物可降解的或部分生物可降解的。
聚合物靶向探针可以包含一种或多种趋化因子或一种或多种TGF活性剂，其结合到交联的生物聚合物，可释放地缔合到交联的生物聚合物，置于交联的生物聚合物中，喷涂在交联的生物聚合物上或其组合。
交联的生物聚合物可以形成一个或多个孔以携带活性剂，例如形成一个或多个孔以携带一种或多种趋化因子或一种或多种TGF活性剂用于随时间缓释。根据所携带的活性剂以及希望的释放速率或曲线，可以改变交联以形成具有以下平均直径的孔：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29nm或小于1nm或大于29nm，以及每个的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的增量变化(例如X.1、X.2、X.3、X.4、X.5、X.6、X.7、X.8或X.9，其中X为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29；具体实例包括3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9，或11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或20.1、20.2、20.3、20.4、20.5、20.6、20.7、20.8、20.9)。
聚合物靶向探针可以用于在少于15分钟内接触一种或多种靶点以实现在15分钟内的快速检测。聚合物靶向探针可以关节内注射。
本发明提供了用于定向治疗损坏的软骨的组合物和方法。本发明可以用作识别机制以定位损坏的软骨，其使用配体以将软骨损坏成像探针引导到损坏的软骨，并且使用第一可检测的标签识别软骨损坏成像探针在体内的位置。第二软骨靶向探针可用作药物，以通过将干细胞、软骨细胞或两者募集到损坏的软骨治疗损坏的软骨。配体用于将第二软骨靶向探针引导到损坏的软骨，其中一种或多种趋化因子从第二软骨靶向探针释放，以将干细胞、软骨细胞或两者募集至损坏的软骨。第二软骨靶向探针可以具有第二可检测的标签以识别第二软骨靶向探针的位置。第三软骨靶向探针可以用作药物，以通过增加成软骨分化来治疗损坏的软骨。第三软骨靶向探针包括用于将第三软骨靶向探针引导到损坏的软骨的配体，其中一种或多种TGF活性剂从第三软骨靶向探针释放以引发更高的成软骨分化。第三软骨靶向探针可以具有第三可检测的标签以识别第二软骨靶向探针的位置。在这个实例中，有3种探针，它们具有3种不同的可检测的标签，使得每种探针针对定位和递送而被成像和识别。然而，在某些情况下，每种探针的可检测的标签可以是相同的。类似地，显然可以通过将各个探针组合成2个或甚至1个探针减少探针的数目。例如，可以使用单个成像探针，然后局部注射第二探针，该第二探针释放趋化因子以将干细胞、软骨细胞或两者募集至损坏的软骨，并且还释放一种或多种TGF活性剂以引发更高的成软骨分化。例如，本发明提供了一种损坏的软骨的探针，其用作药物用于损坏的软骨的靶向治疗，其中损坏的软骨的探针包括：用于识别损坏的软骨的软骨损坏成像探针，其中软骨损坏成像探针包含生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体是与CD44受体相互作用的透明质酸、与叶酸受体相互作用的叶酸或两者；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中第一可检测的标签可以在损坏的软骨处被检测到并且用于生成损坏的软骨的图像；和软骨靶向探针，其用作药物以通过将干细胞、软骨细胞或两者募集到损坏的软骨来治疗损坏的软骨，其中软骨靶向探针包含：生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；与聚合物靶向探针缔合的选自SDF1、SDF1β、Epo、CCL2、CCL16、VEGF、TGF-β1和TGF-β3的一种或多种趋化因子，其中一种或多种趋化因子被释放以募集干细胞、软骨细胞或两者；和任选地，与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的第二可检测的标签；和任选地，成软骨分化探针，其用作药物以通过增加成软骨分化来治疗损坏的软骨，其中成软骨分化探针包含：生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，并且交联的生物聚合物具有大于约200nm的直径以调节内化；与交联的生物聚合物接触的配体，其中配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；与聚合物靶向探针缔合的选自TGF-β1和TGF-β3的一种或多种TGF活性剂，其中一种或多种TGF活性剂被释放以引发较高的成软骨分化；和与交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的第三可检测的标签。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在将参考本发明的详细描述以及附图，其中：
图1A是通过DLS表征的HA纳米颗粒的尺寸分布图(左图)，并且图1B是SEM图。
图2A-2D显示体外靶向正常的和活化的软骨细胞的靶向CD44的HA颗粒。图2A和2C为显示靶向CD44的探针孵育的初始的和活化的(LPS-处理的)软骨细胞的荧光图像。图2B显示靶向CD44的探针孵育的初始的和活化的(LPS-处理的)软骨细胞的荧光图像强度。图2D显示活化的软骨细胞的数目。
图3A-3D显示靶向CD44的探针诊断人关节炎软骨组织的离体评估。图3A是比较关节炎软骨组织与健康软骨组织的荧光图像，图3B显示了量化的组织相关荧光强度。图3C是拍摄并随后与比较关节炎软骨组织与健康软骨组织的细胞核图像重叠的组织横截面图像，图3D显示关节炎软骨组织和健康软骨组织上的CD44+细胞的定量数目。
图4A和4B显示了靶向FA受体的探针检测发炎细胞的体外评估。图4A显示相对于采用初始细胞对照，LPS-处理的活化的巨噬细胞上的靶向FA受体的探针的荧光强度增加。图4B是显示细胞缔合的荧光强度与活化的巨噬细胞数目之间的线性关系的图。
图5是显示靶向FA受体的探针诊断关节炎组织的评估的图像。在用探针孵育后，我们发现在关节炎组织上(左侧)比在健康组织上(右侧)显著更高的探针积累。
图6A和6B是显示基于HA颗粒的探针的体外细胞毒性的图，显示了HA分子量的影响(图6A交联密度：1:1)；交联密度的影响(图6B分子量：60k)。
图7A和7B是在小鼠关节内注射模型中，基于HA颗粒的探针引发对组织的最小毒性的图像，H&E染色(图7A)和炎性细胞计数(图7B)。
图8A和8B分别是大鼠软骨损伤的体内成像及其定量分析。数据表明基于HA颗粒的探针(靶向CD44的探针)对机械创伤损伤的软骨比对对照(健康软骨)具有更高的亲和力。
图9A和9B显示基于HA颗粒的探针的体外降解。HA分子量的影响(图9A交联密度：1:1)；交联密度的影响(图9B分子量：60k)。
图10A显示离体的靶向CD44的探针可以用于通过优先积累在损伤的软骨组织的区域，快速地识别软骨组织损伤和损坏的区域。图10B是在不同时间点定量的关节炎软骨上积累的探针量的图。
图11A和11B显示使用靶向FA受体的探针诊断机械损伤的软骨。图11A是显示靶向FA受体的探针优先积累在机械损伤的组织上(顶部)而不是健康组织上(底部)的图像。图11B是定量并然后比较在损伤的和健康组织两者上积累的探针量的图(右)。
图12A-12C显示了使用靶向CD44的探针诊断机械损伤的剑突。图12A显示在机械损伤的软骨上而非健康的软骨上积累的靶向CD44的探针(上部)。对在损伤的组织和健康组织上积累的探针量进行定量，然后进行比较(下部)。图12B显示离体结果，图12C显示定量荧光。
图13A是1mm直径大小的软骨损伤的图像，而图13B是1mm直径大小的软骨损伤的量化图。发现靶向CD44的基于HA的探针优先积累于损伤的部位。
图14是靶向CD44的探针的大小对其被内化的机会的影响的图表。我们的数据发现>250nm的探针主要通过受体相互作用积累在关节炎组织上。然而，小探针(如50nm直径)通过内化积累在关节炎组织上，其不能使用EDTA清洗去除。
图15是显示由释放的SDF1、SDF1β和Epo诱导的人软骨细胞迁移的图。
图16是显示由各种生长因子诱导的BMSC迁移及定量分析的图。
图17是分别由对照EPO、从HA颗粒释放的EPO和培养基诱导的BMSC迁移的图。
图18A是由释放的TGFβ1和TGFβ3引发的BMSC分化的图像，图18B是其定量分析。
图19A是未治疗和使用HA支架/探针治疗的人关节炎软骨的图像。图19B是使用或不使用HA支架体外治疗2周的关节炎软骨的修正的Mankin评分的图。
图20A是未治疗和使用Epo负载的HA支架和间充质干细胞治疗的人关节炎软骨的图像。图20B是比较未治疗和使用Epo负载的HA支架和间充质干细胞体外治疗2周的关节炎软骨的修正的Mankin评分的图。
实施方案的描述
尽管在下面详细讨论了本发明的各种实施方案的形成和使用，但应该理解的是，本发明提供了许多可以体现在许多具体上下文中的可用的发明构思。本文讨论的具体实施方式仅仅是说明形成和使用本发明的具体方式，并不限定本发明的范围。
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语例如“一(a)”，“一(an)”和“所述(the)”不意在仅指代单数实体，而是包括可以使用特定实例来说明的大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方式，但是它们的使用不限定本发明，除非在权利要求书中列明。
生物相容的和可降解的聚合物可以用于制造纳米或微米支架。为了说明这种能力，透明质酸(HA)被用作支架制造的模型材料。
如其中所使用的术语“微米/纳米颗粒”、“纳米颗粒”、“微米颗粒”、“支架”、“损坏/损伤的软骨的靶向探针”、“聚合物靶向探针”、“探针”及其变体是可互换的并且用于表示通过乙烯砜交联的生物相容的透明质酸聚合物，并且在一些实施方案中可以包括配体、可检测的标签和/或一种或多种活性剂。
HA微米/纳米颗粒的制造。HA微米/纳米颗粒可以使用微乳体系制造。简言之，通过将HA(60mg，700K)溶于3ml的NaOH(0.2M)溶液来制备水相；通过将0.2M Aerosol OT和0.04M1-庚醇溶于异辛烷(50ml)来制备有机相。将水溶液逐滴加到有机相中，然后将混合物立即均质化10分钟。随后将乙烯砜(100μl)加到微乳，并将混合物再次均质化以分散DVS。剧烈搅拌下使反应在环境温度下进行1小时。通过在丙酮中沉淀来收集HA颗粒。将沉淀的HA颗粒团粒重新分散到去离子水中，然后以1000rpm离心10分钟以去除微米尺寸的HA。最后，通过以5000rpm离心上清液来收集HA纳米颗粒。收集的HA纳米颗粒用水、乙醇和丙酮充分洗涤，然后在37℃下干燥过夜。为了制备靶向CD44的光学纳米探针，将50mg制备好的HA纳米颗粒和1mg CFTM 647染料(Biotium，CA)依次分散到PBS缓冲液(pH：4.5；3.0ml)中，然后将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(染料与EDC的摩尔比为1:10)加到混合物中以引发染料结合到HA纳米颗粒中。24小时后，将反应溶液用去离子水彻底透析，收集纯化的CFTM647标记的HA纳米颗粒并干燥以备将来使用。染料的结合效率使用紫外可见分光光度计估算为每毫克干燥的HA颗粒10毫微摩尔。通过动态光散射(DLS)和扫描电子显微镜(SEM)(App.1)表征制备好的靶向CD44的探针(或HA颗粒)的大小，HA颗粒的平均直径为约500nm。HA颗粒的ζ电位为约-41mv。SEM图像显示由于用于SEM测量的样品制备期间与干燥有关的颗粒收缩导致的粒径减小(～300nm)。颗粒的物理化学特性如尺寸和表面特性在细胞摄取中起着关键作用。根据膜理论的“包裹时间(wrapping time)”，较大尺寸的颗粒在细胞内化过程中需要更强的驱动力和额外的能量，而尺寸更大(>150nm)的颗粒将大部分被排除在非吞噬细胞内化之外。以前的研究揭示非吞噬细胞有利于较小颗粒的摄取。另一方面，由于NP和细胞膜之间的静电排斥力增加，带负电的颗粒减少细胞摄取。因此，制备好的HA颗粒探针非特异地结合到非靶向细胞/组织的机会较少，从而导致较高的成像分辨率。因此，此处使用的HA颗粒探针适合用于靶向细胞膜上的CD44受体。
图1A是通过DLS表征的HA纳米颗粒的尺寸分布图(左图)，并且图1B是SEM图。图2显示体外靶向正常的和活化的软骨细胞的靶向CD44的HA颗粒。图2A和2C是显示靶向CD44的探针孵育的初始的和活化的(LPS处理的)软骨细胞的荧光图像。图2B显示靶向CD44的探针孵育的初始的和活化的(LPS-处理的)软骨细胞的荧光图像强度。图2D显示细胞相关荧光强度随着活化软骨细胞数目的增加而增加。使用牛软骨细胞研究HA颗粒体外靶向软骨细胞上的CD44受体的能力。LPS处理(50ng/ml，24小时)用于活化软骨细胞以表达CD44受体。在37℃下，将初始的和活化的软骨细胞(2×105/孔)与CFTM647染料标记的靶向CD44的HA颗粒(0.1mg/ml)一起孵育1小时。用2X PBS洗涤后，使用荧光显微镜观察细胞表面上的HA纳米颗粒积累，并使用读板器记录细胞相关的荧光强度。荧光图像(图2A、2C)显示LPS处理的软骨细胞与大量的靶向CD44的HA颗粒缔合。定量分析进一步揭示来自LPS处理的软骨细胞的荧光强度是对照的～4倍(图2B)。这是因为HA颗粒与在活化的软骨细胞上高度上调的CD44受体相互作用(图2D)。此外，荧光强度和活化的软骨细胞数目之间存在线性关系。我们的结果表明HA颗粒可以用于靶向表达CD44的软骨细胞，并且靶向CD44的探针可以用于评估CD44+关节炎细胞的数目。
图3显示靶向CD44的探针诊断人关节炎软骨组织的离体评估。图3A是关节炎软骨组织与健康软骨组织的荧光图像比较，图3B显示了量化的组织相关荧光强度。图3C是拍摄并随后与比较关节炎软骨组织与健康软骨组织的细胞核图像重叠的组织横截面图像，图3D显示关节炎软骨组织和健康软骨组织两者上的CD44+细胞的定量数目。众所周知，发炎的、损伤的或关节炎软骨表达高水平的CD44受体。在体外评估靶向CD44的探针(HA颗粒)靶向关节炎软骨的能力。将患病组织和健康组织均放置在6孔板中。向每孔中加入CFTM647-结合的靶向CD44的探针(1.0mg/ml)，然后在37℃下孵育30分钟。在此研究中使用全膝关节或髋关节置换术后丢弃的人关节炎和发炎软骨。使用柯达成像系统定量靶向CD44的探针靶向关节炎和发炎软骨的能力。我们的数据显示，患病(关节炎)组织积累的靶向CD44的探针是对照组织(健康软骨)的4倍。IHC染色(CD44染色)显示在关节炎软骨组织中CD44的表达增强。在关节炎软骨组织中的CD44是健康软骨组织中的约3.8倍。这些结果证实了靶向CD44的探针(HA颗粒)可用于检测关节炎软骨组织的结论。
叶酸受体靶向探针用于诊断关节炎软骨。许多报道已经显示，损伤的、损坏的或患病的软骨具有上调的叶酸(FA)受体。通过靶向FA受体，我们已开发了新型探针来检测损伤的、损坏的或患病的软骨。已经显示在软骨组织上的活化的巨噬细胞和发炎细胞在其表面上具有高水平的FA受体表达。通过检测FA受体表达细胞的程度，我们将能够诊断关节炎软骨。FA受体对叶酸及其片段具有高亲和力。可以使用多种材料制造探针，包括透明质酸(HA)、聚乙二醇等。使用的颗粒包括但不限于透明质酸微米尺寸或纳米尺寸颗粒、壳聚糖颗粒、明胶颗粒、胶原颗粒、白蛋白颗粒、PLGA/PLA颗粒和聚乙二醇纳米颗粒等。对于叶酸受体靶向性质，探针的表面必须具有叶酸(folate)/叶酸(folic acid)的整个分子或片段。为了可视化/可视诊断，探针应该与诸如FITC、
Figure BDA0001675034920000121
和
Figure BDA0001675034920000122
等荧光染料结合。
可以用与FA和FA衍生物结合的荧光染料标记的颗粒来制备用以检测FA受体阳性的发炎细胞的成像探针。为了制备FA受体靶向探针，首先通过EDC化学过程将FA偶联到胺-PEG-胺(Mw：5K)的一端上来获得。将70mg的FA-PEG-NH2和10mg的CFTM647标记的HA纳米颗粒分散到5ml的PBS缓冲液(pH：4.5)中。加入EDC(FA与EDC的摩尔比为1:10)开始将FA结合到CFTM647标记的HA颗粒上。24小时后，将反应溶液用去离子水彻底透析，并收集FA受体靶向探针并干燥以备将来使用。FA的结合效率使用紫外可见分光光度计估算为每毫克干燥的HA颗粒0.12微摩尔。
图4A和4B显示靶向FA受体的探针检测发炎细胞的体外评估。图4A显示相比采用初始细胞的对照，LPS-处理的活化的巨噬细胞上的靶向FA受体的探针的荧光强度增加。图4B是显示细胞相关荧光强度与活化的巨噬细胞数目之间的线性关系的图。滑膜巨噬细胞在介导关节炎早期的炎症和软骨损伤中起关键作用。先前的研究已表明，这些软骨周围的活化的巨噬细胞参与骨关节炎样病理的发生。另外，已知活化的巨噬细胞表达FA受体。因此，我们相信测量在关节内间隙处的软骨上的FA受体表达细胞将提供诊断早期关节炎的直接手段。为了检验这个假设，我们使用靶向FA受体的探针(FA-结合的HA颗粒)和鼠Raw 264.7巨噬细胞。使用LPS处理(1.0μg/ml，4小时)活化巨噬细胞，同时使用PBS培养基作为对照。在37℃下，将初始的和活化的巨噬细胞(6.0x106/孔)与CFTM647染料标记的靶向FA受体的探针(0.1mg/ml)一起孵育1小时。用3X PBS洗涤后，使用荧光显微镜观察细胞表面上的靶向FA受体的探针的积累，并使用读板器记录细胞相关的荧光强度。通过测量细胞相关的荧光强度，我们发现LPS处理的巨噬细胞与大量的靶向FA受体的探针缔合(图4A)。定量分析进一步揭示来自LPS处理的巨噬细胞的荧光强度是来自PBS处理的巨噬细胞的～1.5倍(图4B)。结果表明，由于巨噬细胞活化时叶酸受体的上调，FA的存在增强了HA颗粒对活化的巨噬细胞的亲和力。此外，通过将靶向FA受体的探针与各种数目的活化的巨噬细胞一起孵育，可以观察到活化的巨噬细胞的数目与荧光强度之间的线性关系(图4B)。这些结果显示靶向FA受体的探针可用于体外定量活化的MΦ的数目。
图5是显示靶向FA受体的探针诊断关节炎组织的评估的图像。在用探针孵育后，我们发现在关节炎组织上(左侧)比在健康组织上(右侧)显著更高的探针积累。此外，在全膝关节置换术期间恢复丢弃的人关节软骨用于探索靶向FA受体的探针诊断关节炎软骨组织的能力。从丢弃的组织中分离出患病的软骨和健康组织两者，而不与患者的身份相关联。如预期的，靶向FA受体的探针对关节炎组织(图5左)比对在健康组织上的那些(图5右)具有更高的亲和性。这些发现表明靶向FA受体的探针可用于诊断关节炎软骨组织(具有强烈的染料相关荧光)并识别关节炎软骨的区域，以用于局部和靶向治疗。
通过关节内注射成像探针诊断关节炎软骨。没有开发成像探针以诊断关节内部的软骨表面上的损坏或损伤。所有之前的探针都开发为通过注射和/或经由血流递送探针来检测关节炎。这些方法只能检测骨/软骨界面处血管附近的炎症应答。由于软骨组织几乎没有血管，因此当前的方法不能用于评估关节内部的软骨组织表面上的细胞损伤的程度。我们的探针被设计为用于诊断软骨组织表面上的损伤和损坏。为了确保探针仅靶向损伤的软骨表面组织，探针被设计为关节内注射，其中所有组分来源于滑膜液或与滑膜细胞生物相容。
HA颗粒被制造成探针的基部。简言之，通过将HA(60mg，700K)溶于3ml的NaOH(0.2M)溶液中来制备水相；通过将0.2M Aerosol OT和0.04M 1-庚醇溶于异辛烷(50ml)中来制备有机相。将水溶液逐滴加入有机相中，然后将混合物立即均质化10分钟。随后将乙烯砜(100μl)加到微乳，并将混合物再次均质化以分散DVS。剧烈搅拌下使反应在环境温度下进行1小时。通过在丙酮中沉淀来收集HA颗粒。将沉淀的HA颗粒团粒重新分散到去离子水中，然后以1000rpm离心10分钟以去除微米尺寸的HA。最后，通过以5000rpm离心上清液来收集HA纳米颗粒。收集的HA纳米颗粒用水、乙醇和丙酮充分洗涤，然后在37℃下干燥过夜。使用不同的配方来研究以下几个参数对粒度、粘度和缓释特性的影响：HA的分子量和交联密度(HA羟基与DVS的乙烯基的比例)和HA浓度。
图6A和6B是显示基于HA颗粒的探针的体外细胞毒性的图，显示了HA分子量的影响(图6A交联密度：1:1)；交联密度的影响(图6B分子量：60k)。在体外和体内研究了这些基于HA颗粒的探针的毒性。在体外测试中，在人软骨细胞上使用Alamar Blue测定法评价HA颗粒的细胞毒性。简言之，在Alamar Blue的存在下，将接种的细胞(每孔5000个细胞)与在不同条件下制备的不同浓度的探针一起孵育24小时。我们发现使用不同分子量或交联密度制备的探针在浓度高达5mg/ml时对细胞没有明显毒性。对兔滑膜细胞已经进行了类似的实验，并显示出与对人软骨细胞进行实验相同的趋势。这些结果表明基于HA颗粒的探针具有良好的细胞相容性。
为了评价基于HA颗粒的探针的组织相容性，使用小鼠皮下植入模型和小鼠关节内注射模型进行体内测试。对于小鼠皮下植入模型，将各种HA颗粒以及用作对照的PLAG颗粒皮下植入来自Taconic Farms(Germantown，NY，USA)的Balb/c小鼠(雄性，约20g体重)中。简言之，将颗粒(每只小鼠6mg/100μl)给予到背上的皮下间隙中。植入3天和14天后，回收植入物和周围组织，冷冻切片，然后进行组织学分析。炎症细胞浸润和囊厚度用作用于评估组织对不同探针反应程度的生物标志物。我们发现，不论分子量或交联密度如何，所有的基于HA颗粒的探针的生物相容性与PLGA颗粒的相当甚至更好。PLGA是FDA批准的材料，因此这些制备好的HA颗粒可用于动物的体内研究。
图7A和7B是在小鼠关节内注射模型中，基于HA颗粒的探针引发对组织的最小毒性的图像，H&E染色(图7A)和炎性细胞计数(图7B)。此外，使用小鼠关节内注射模型进行对基于HA颗粒的探针的组织应答。我们发现我们制备的所有探针显示对关节组织没有毒性/有最小毒性。代表性的结果如图7A和7B中所示。根据H&E染色，使用各种分子量制备的探针引发与盐水引发的相似的炎性细胞募集。将体外和体内结果综合起来，我们可以得出基于HA颗粒的探针对细胞和组织是安全的结论。
图8A是大鼠软骨损伤的体内成像及其定量分析(图8B)。数据表明基于HA颗粒的探针(靶向CD44的探针)对机械创伤的损伤的软骨比对照(健康软骨)具有更高的亲和力。
最后，采用软骨损伤大鼠模型研究颗粒探针是否可以用于检测体内软骨损伤。首先，使用22G针在大鼠(n＝3)的左膝盖中造成股骨软骨损伤，而留下未损伤的右膝盖作为对照。关节内注射100μl的基于HA颗粒的探针(1mg/ml)。30分钟后，使用柯达体内成像系统捕获体内成像，并且结果呈现于图8中。可以观察到强荧光信号与机械损伤的软骨相关联，而在对照膝盖中见到非常弱的信号(图8A)。定量分析显示损伤的软骨中的颗粒积累高出约4倍(图8B)。结果表明基于HA颗粒的探针(靶向CD44的探针)可以关节内给予以检测体内软骨损伤。我们的探针可以检测损伤和损坏的软骨，而无需通过血流。
具有可降解特性的探针。为确保人体使用的安全性并避免潜在的异物反应，通过使用生物可降解的材料制备探针，将关节炎诊断探针设计为具有生物可降解的特性。使用不同的生物可降解的材料制备探针，所述材料包括透明质酸(HA)、聚乙二醇、壳聚糖颗粒、明胶颗粒、胶原颗粒、白蛋白颗粒、PLGA/PLA颗粒和聚乙二醇纳米颗粒等。
图9A和9B显示基于HA颗粒的探针的体外降解。HA分子量的影响(图9A交联密度：1:1)；交联密度的影响(图9B分子量：60k)。在透明质酸酶(50单位/ml)的存在下，在体外测试制备好的基于HA颗粒的探针的降解。可以观察到在透明质酸酶存在下，基于HA颗粒的探针的降解曲线取决于HA分子量或交联密度。以较高分子量制备的HA探针比以较低分子量制备的探针降解更快，并且增加交联密度降低了基于HA颗粒的探针的降解速率。这可能是因为以较高分子量或较低交联密度制备的基于HA颗粒的探针显示较高的溶胀比，这使得酶更容易地渗透到微型支架中切割网络。这些结果表明我们的成像探针可以在体内降解，并且在多次注射后，我们的探针没有在体内积累的风险。
用于快速检测的探针(<15分钟)。关节炎诊断探针被设计为提供快速的疾病诊断。为此，探针设计为对患病软骨具有高亲和力并提供对疾病组织的快速可视化。当前，没有可以用于在小于12小时内检测软骨损伤和损坏的成像探针。为了克服这个缺点，我们的探针被开发为在关节内给予，并在滑膜液中循环并最终积累在损伤的软骨的表面上。为此，我们已经选择透明质酸(HA)作为探针的组分，因为HA是滑膜液中的主要组分之一。
图10A显示离体的靶向CD44的探针可以通过优先积累在损伤的软骨组织的区域，用于快速地识别软骨组织损伤和损坏的区域。图10B是在不同时间点定量的关节炎软骨上积累的探针量的图。研究了基于HA颗粒的探针(靶向CD44的探针)诊断关节炎软骨的能力。为此，将人关节炎软骨组织放置在6孔板中。对于每个孔，将6ml含CFTM647染料标记的靶向CD44的探针的DMEM培养基(终浓度：100或300μg/ml)加入孔板中并在37℃下孵育。在不同的时间点，将孔板置于便携式近红外成像系统中以记录组织的荧光强度(激发：630nm；发射：700nm)。结果显示，无论探针浓度如何，靶向CD44的探针可以快速积累在关节炎软骨组织中-组织的右上角(图10A)。孵育10分钟后，荧光强度没有随时间显著增加。在这个时间点，关节炎软骨组织引发的探针累积大约为健康组织的3倍。靶向叶酸受体的探针观察到类似的结果。总体而言，我们的结果已表明，我们的探针可以用于快速识别关节炎软骨区域(<15分钟)。
图11A和11B显示使用靶向FA受体的探针诊断机械损伤的软骨。图11A是显示靶向FA受体的探针优先积累在机械损伤的组织上(顶部)而不是健康组织上(底部)的图像。图11B是定量并随后比较在损伤的和健康组织两者上积累的探针量的图(右)。
用于机械或压迫创伤的探针。关节炎可以由不同的机制引起。虽然一些检测方法已被开发用于关节炎症，但没有开发用于检测由机械和/或压迫创伤引起的软骨损伤的方法。为了克服这种缺陷，这里开发的探针被设计为靶向CD44和/或叶酸受体，CD44和/或叶酸受体是机械和/或压迫损伤的软骨的标志。
人体关节中的健康软骨在体内反复受到高达15-20MPa的正常机械冲击。较高的物理冲击可以导致组织损伤并最终引起软骨退化。软骨损伤的早期检测对于防止使用非手术治疗的不可逆的软骨退化至关重要。根据先前的研究，使用机械损伤的牛软骨外植体的体外模型来研究靶向FA受体的探针是否可以用于检测由机械负荷产生的软骨损伤。简言之，从2周龄的牛犊的股髌沟槽获得软骨外植盘(8×4mm，1mm厚)。软骨外植体在DMEM培养基中培养7天后。其中，通过使用止血钳夹住外植体或以14-20MPa将不锈钢棒置于软骨组织的顶部持续2.0分钟，将一些外植体用来产生损伤的外植体。在37℃下，将机械损伤的组织和对照健康组织置于每孔含有3ml DMEM(CFTM647染料标记的靶向FA受体的探针，0.4mg/ml)的6孔板的孔中15分钟至数小时。最后，使用便携式成像仪捕获这些组织的离体成像。结果显示从损伤的组织观察到的荧光强度比从非损伤的组织观察到的荧光强度强得多(图11A)。对软骨外植体的机械冲击引发的靶向FA受体的探针的积累为约4倍(图11B)。靶向CD44受体的探针观察到类似的结果。这些结果表明靶向FA受体的探针和靶向CD44的探针都可以用于检测机械冲击相关的软骨损伤。
图12A-12C显示了使用靶向CD44的探针诊断机械损伤的剑突。图12A显示在机械损伤的软骨上而非健康的软骨上积累的靶向CD44的探针(上部)。对在损伤和健康组织上积累的探针量进行定量，然后进行比较(下部)。图12B显示离体结果，图12C显示定量荧光。使用已建立的剑突损伤模型测试靶向CD44的探针检测机械损伤的软骨的能力。在14-20MPa下用止血钳压迫2.0分钟使剑突损伤。损伤24小时后，将靶向CD44的探针注射到腹膜间隙中(没有循环血液的密闭空间)。探针注射24小时后，然后使用柯达体内成像系统对动物进行成像。我们的结果已发现靶向CD44的探针可以在活体动物体内诊断机械损伤的软骨组织。
用于小损伤(1毫米或更大)的探针。迄今尚未开发出方法来检测并随后治疗与小面积损伤或损坏的软骨有关联的早期关节炎。我们的探针被设计成诊断早期关节炎，其通常是由通过机械或压迫力导致的软骨上的小和局部的损伤引起的。机械力将导致细胞损伤和活化，以不同程度地表达CD44受体和/或叶酸(FA)受体。通过识别具有高水平的CD44受体或FA受体的区域，我们的探针可以用于识别非常小且局部的机械或压迫力诱导的损伤。
图13A是1mm直径大小的软骨损伤的图像，而图13B是1mm直径大小的软骨损伤的量化图。发现靶向CD44的基于HA的探针优先积累于损伤部位。使用靶向CD44受体的探针(使用CFTM647染料标记)来检测由不锈钢棒(1mm直径)以20Mpa持续2分钟引起的软骨表面损伤。然后将探针溶液(0.4mg/ml)置于整个组织的顶部15分钟。然后使用便携式成像仪记录组织的荧光图像。我们发现在软骨的损伤部位可以观察到强烈的荧光信号。我们的结果已表明，我们的探针能够检测到软骨表面上小至1mm直径的损伤。这种能力使我们能够将治疗仅递送到损伤软骨的区域，以改善治疗效果。
用于表面分子的没有最小内化的探针(>200纳米)。所有现有的探针均是以纳米尺寸(<100nm)制造的。不幸的是，具有这种小尺寸的探针很容易被细胞内化。这种性质将影响损伤诊断的准确性，因为难以区分探针的积累是由细胞表面靶向引起的还是由细胞内化引起的。为了克服这样的缺点，我们的探针被以亚微米尺寸制造，其被内化(或被细胞吞噬)的可能性小得多。
我们使用螯合剂(EDTA)释放颗粒：细胞受体相互作用。但是，一旦探针被细胞内化，这种处理就不能将探针洗掉，并且细胞将保留探针的荧光强度。
图14是靶向CD44的探针的大小对其被内化的机会的影响的图表。我们的数据发现>250nm的探针主要经由受体相互作用积累在关节炎组织上。然而，小探针(如50nm直径)经由内化积累在关节炎组织上，其不能使用EDTA洗涤去除。将人关节炎软骨组织放置在6孔板中。对于每孔，将6ml的DMEM培养基在37℃下孵育60分钟，所述DMEM培养基含有300μg/ml的两种不同大小的CFTM647染料标记的靶向CD44的探针(250纳米直径相对于50纳米直径)。然后将组织与含有0.05％EDTA的DMEM培养基一起孵育。在不同的时间点，将孔板置于柯达体内成像系统中以记录组织的荧光强度(激发：630nm；发射：700nm)，结果如图14所示。
我们发现与250纳米探针孵育的组织相比，50纳米大小的探针孵育的组织保持它们的荧光强度好得多。这些结果表明较大尺寸的探针可以减少内化的机会，并且比小尺寸探针更有机会用于关节炎诊断。因此，我们所有的探针均以大于200nm的尺寸制造。
用于募集软骨细胞的探针。我们的目标是引发软骨细胞向软骨损伤部位的募集。随后，软骨细胞的存在将有助于修复损伤的软骨组织和细胞。靶向损伤的软骨组织/细胞的HA颗粒负载有软骨细胞特异性趋化因子。通过在损伤的组织部位释放，释放的趋化因子将产生趋化因子梯度以引导软骨细胞向软骨组织损伤的部位募集。
与来自HA支架的释放的生物分子有关的软骨细胞迁移的研究。图15是显示由释放的SDF1、SDF-1β和Epo诱导的人软骨细胞迁移的图。将释放的EPO、SDF-1α和SDF-1β添加到700μl无血清的软骨细胞生长培养基中(EPO、SDF-1α和SDF-1β终浓度为10单位/ml、10ng/ml和10ng/ml)，然后将条件培养基转移到transwell的底部室中。将在200μl无血清软骨细胞生长培养基中的2x105个人软骨细胞置于顶部室中。孵育24小时后，用Wright-Geimsa将迁移的软骨细胞染色并在显微镜下计数。结果在图15中显示。有趣的是，还发现释放的趋化因子可以促进人软骨细胞的迁移。定量分析显示，细胞迁移是对照培养基约4.9、3.7和4.2倍。这些结果表明，通过在损伤的软骨细胞的部位释放趋化因子，HA支架可以促进干细胞、软骨细胞或两种类型的细胞向损伤部位的募集。这种“红利”可以进一步增强损伤的软骨组织的再生。
用于募集干细胞的探针。我们的目标是引发干细胞向软骨受损部位的募集。干细胞的存在将随后有助于修复损伤的软骨组织和细胞。靶向损伤的软骨组织/细胞的HA颗粒负载有干细胞特异性趋化因子。通过在损伤的组织部位释放，释放的趋化因子将产生趋化因子梯度以引导干细胞向软骨组织损伤部位的募集。
由各种生长因子引发的干细胞迁移的研究。图16是显示由各种生长因子诱导的BMSC迁移及其定量分析的图。使用五种生长因子(SDF、EPO、VEGF、CCL2和CCL16)。通过研究，将选择2-3种可以募集最大量的干细胞的生长因子。为此，使用Transwell(8μm聚碳酸酯，6.5mm插入物，Costar)进行细胞迁移试验。用PBS洗涤人骨髓基质细胞(BMSC)三次，然后在RPMI中铺板过夜。在所有实验中，将5×104个细胞重悬于RPMI(100μl)中，分别与rHuEPO(100单位/ml)、CCL2(30ng/ml)、CCL16(30ng/ml)、SDF(9ng/ml)和VEGF(0.8μg/ml)一起孵育。将细胞加至每个迁移室的顶部，并允许在下部室中存在10％FCS的情况下迁移至室的下侧14小时。将过滤器的上表面的细胞擦净，然后通过浸入100％的甲醇中固定过滤器，并用Giemsa染色15分钟。使用明场显微镜捕获迁移的细胞。使用ImageJ软件对捕获图像中的迁移细胞进行计数。结果显示在App.16中。可以观察到，EPO和SDF引发的BMSC迁移比CCL16、CCL2和VEFG多得多。定量分析显示，与对照相比，CCL16、CCL2、VEGF、SDF和EPO分别引发5.2、7.6、7.8、18和19倍的细胞迁移。因此，EPO和SDF(1α和1β)能够用于募集细胞迁移。
与由HA支架的释放的生物分子有关的干细胞迁移的研究。图17是分别由对照EPO、从HA颗粒释放的EPO和培养基诱导的BMSC迁移的图。以两种方式将生物分子负载到HA支架中：物理吸附和化学结合。对于物理吸附，将1mg HA支架(直径500nm)与7μg EPO在200μl的PBS缓冲液中在4℃下孵育过夜。通过离心收集上清液并测量游离的EPO的量以确定EPO的负载效率。对于化学结合，将1.0mg HA支架(直径500nm)和7μg EPO依次分散到200μl PBS缓冲液(pH：4.5)中，然后将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(EPO与EDC的摩尔比为1:10)加入混合物中以引发EPO结合到HA支架中。孵育24小时后，负载EPO的HA支架通过用去离子水彻底透析进行纯化。使用类似的方法还制备了SDF-1α/SDF-1β负载的HA支架。
例如，使用负载EPO的HA颗粒引发干细胞迁移。为此目的，通过物理方法将EPO负载到HA颗粒中。将含有200单位EPO的0.1mg的HA颗粒加入RPMI培养基中，然后将负载EPO的HA培养基在37℃下孵育2天。通过离心收集上清液并经由transwell迁移试验用于干细胞迁移的研究。新鲜的EPO(200单位)和培养基被用作对照。结果显示在App.17中。可以观察到，释放的EPO可以引发干细胞迁移，但是相对于新鲜的EPO，迁移的干细胞略微减少(～8％)。这种迁移干细胞的减少可能是由于EPO从HA颗粒不完全释放。
用于引导成软骨分化的支架。众所周知，干细胞可以使用不同的试剂/混合物分化为软骨细胞。通过在软骨损伤部位释放软骨形成剂，制备靶向损伤软骨的探针以促进募集的干细胞的成软骨分化。靶向损伤软骨的探针(物理地或化学地)负载有成软骨分化剂，以产生成软骨分化的微环境以促进募集的干细胞分化为软骨细胞。
与从HA支架的释放的生物分子有关的干细胞分化的研究。图18A是由释放的TGFβ1和TGFβ3引发的BMSC分化的图像，图18B是其定量分析。还进行了进一步的研究以评价负载趋化因子的HA支架加速迁移的干细胞的成软骨分化的能力。将迁移的BMSC与作为对照的培养基、从HA(直径500nm)释放的浓度为10ng/ml的TGF-β1和TGF-β3一起孵育。培养3周后，然后使用甲苯胺蓝染色定量分析软骨基质形成的程度。结果显示在图18中。TGF-β1引发的干细胞的成软骨分化略高于TGF-β3。这些结果表明，通过释放趋化因子试剂，如TGF-β1和TGF-β3，软骨或滑膜干细胞可以迁移到损伤的软骨并使组织再生。
靶向损伤软骨的HA支架对软骨组织再生的研究。将关节炎软骨组织与HA颗粒支架一起孵育2周的时间。然后将组织切片并使用番红O(Safranin-O)染色。然后基于修正的Mankin分类系统对软骨损伤的程度定量。图19A是对照损伤组织的图像和HA颗粒治疗的损伤组织的图像。图像显示HA颗粒的治疗可以促进软骨细胞和组织的再生。修正的Mankin评分(图19B)表明HA支架治疗可能通过引发软骨再生显著减少了软骨损伤。靶向损伤软骨的HA颗粒支架的积累可以促进从周围健康组织迁移的软骨细胞迁移至损伤部位。
负载有EPO并与间充质干细胞(MSC)一起孵育的靶向损伤软骨的HA支架对软骨组织再生的研究。将关节炎软骨组织与HA颗粒支架一起孵育两周的时间。然后将组织切片并使用番红O染色。然后基于修正的Mankin分类系统对软骨损伤的程度进行量化。图20A是对照损伤组织的图像和HA颗粒治疗的损伤组织的图像。图像显示HA颗粒的治疗可以促进软骨细胞和组织的再生。修正的Mankin评分(图20B)表明负载EPO的HA支架和MSC的联合治疗可能通过引发干细胞介导的软骨再生大大减少软骨损伤。HA颗粒支架很可能可以靶向损伤的软骨，然后释放导致MSC在损伤的软骨上累积的EPO。结果，治疗显著改善了干细胞的软骨细胞应答和之后的软骨再生。
如在本说明书和(多项)权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包含性的或开放式的，并且不排除其他未列出的要素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含”可以被“基本上由......组成”或“由......组成”代替。如本文所用，短语“基本上由......组成”要求指定的(多个)整体或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的特征或功能的那些。如本文所使用的，术语“组成”用于表示仅存在所述整体(例如特征、要素、特性、性质、方法/处理步骤或限定)或整体群组(例如(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、方法/处理步骤或(多个)限定)。
如本文所使用的，如但不限于“大约”、“实质上”或“基本上”的近似词语是指当被如此修饰时被理解为不一定是绝对的或完备的，但被认为对于本领域普通技术人员而言足够接近于保证指定条件存在的条件。描述可以变化的程度将取决于可以进行并且仍然使本领域的普通技术人员将修饰的特征认可为仍具有未修饰的特征所需的特征和能力的改变的程度。一般来说，但是根据前面的讨论，这里通过诸如“约”的近似词修饰的数值可以由所述值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。

Claims (19)

1.一种纳米颗粒，其用作药物以靶向和/或治疗关节炎软骨，其中所述纳米颗粒包含：
生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中所述生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且所述生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且所述交联的生物聚合物具有大于200nm的直径以调节内化；
与所述交联的生物聚合物接触的配体，其中所述配体是与叶酸受体相互作用的叶酸；和
与所述交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中所述可检测的标签是荧光染料、放射性标签、金属、另外的纳米颗粒或其组合。
2.权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含：
生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中所述生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且所述生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且所述交联的生物聚合物具有大于200nm的直径以调节内化；
与所述交联的生物聚合物接触的配体，其中所述配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用，其中所述配体是叶酸；和
与所述交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中所述可检测的标签是荧光染料、放射性标签、金属、纳米颗粒或其组合；和
使疑似被损坏的软骨与权利要求1中定义的纳米颗粒接触，并检测所述纳米颗粒。
3.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中通过向损坏的软骨募集干细胞、软骨细胞或两者治疗损坏的软骨，其中所述纳米颗粒包含：
提供纳米颗粒，其包含生物相容的透明质酸聚合物，所述生物相容的透明质酸聚合物通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中所述生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且所述生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，其中所述交联的生物聚合物具有大于200nm的直径以调节内化；
与所述交联的生物聚合物接触的配体，其中所述配体为与叶酸受体相互作用的叶酸；
与所述纳米颗粒缔合的选自SDF 1、SDF 1β、Epo、CCL2、CCL16、VEGF、TGF-β1和TGF-β3的一种或多种趋化因子，其中所述一种或多种趋化因子被释放以募集干细胞、软骨细胞或两者；和
与所述交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中所述可检测的标签是荧光染料、放射性标签、金属、纳米颗粒或其组合。
4.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其适用于增加成软骨分化，其中所述纳米颗粒包含：
生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中所述生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且所述生物相容的聚合物：交联剂的交联比为4:1至1:4，并且所述交联的生物聚合物具有大于200nm的直径以调节内化；
与所述交联的生物聚合物接触的配体，其中所述配体是与叶酸受体相互作用的叶酸；
与所述纳米颗粒缔合的选自TGF-β1和TGF-β3的一种或多种TGF活性剂，其中所述一种或多种TGF活性剂被释放以引发较高的成软骨分化；和
与所述交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中所述可检测的标签是荧光染料、放射性标签、金属、纳米颗粒或其组合。
5.权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述损坏的软骨来自物理创伤、炎性损坏或其组合。
6.权利要求5所述的纳米颗粒，其中所述物理创伤为机械创伤或压迫创伤。
7.权利要求5所述的纳米颗粒，其中所述炎性损坏为关节炎损坏。
8.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的分子量为10K、60K、700K或1.5M。
9.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述交联比为1:4、1:3、1:2、1:1、1:3.9、1:3.5、1:2.3、4:1、3:1或2:1。
10.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是生物可降解的。
11.权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种趋化因子结合到所述交联的生物聚合物，放置于所述交联的生物聚合物中，喷涂在所述交联的生物聚合物上或其组合。
12.权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述结合到所述交联的生物聚合物是可释放地缔合到所述交联的生物聚合物。
13.权利要求4所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种TGF活性剂结合到所述交联的生物聚合物，放置于所述交联的生物聚合物中，喷涂在所述交联的生物聚合物上或其组合。
14.权利要求13所述的纳米颗粒，其中所述结合到所述交联的生物聚合物是可释放地缔合到所述交联的生物聚合物。
15.权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述交联的生物聚合物包含一个或多个孔，并且所述一种或多种趋化因子被放置于所述一个或多个孔中，用于随时间缓释，并且其中所述一个或多个孔的直径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29nm或小于1nm或大于29nm。
16.权利要求4所述的纳米颗粒，其中所述交联的生物聚合物包含一个或多个孔，并且所述一种或多种TGF活性剂被放置于所述一个或多个孔中，用于随时间缓释，并且其中所述一个或多个孔的直径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29nm或小于1nm或大于29nm。
17.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在少于15分钟内接触所述靶点以实现在15分钟内的快速检测。
18.权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含：
生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联的生物聚合物，其中所述生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且所述生物相容的HA聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且所述交联的生物聚合物具有大于200nm的直径以调节内化；
与所述交联的生物聚合物接触的配体，其中所述配体是与叶酸受体相互作用的叶酸；和
与所述交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中所述可检测的标签可以在损坏的软骨处检测到，并且用于生成损坏的软骨的图像。
19.权利要求1或2所述纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还包含：
成软骨分化纳米颗粒，其用作药物以通过增加成软骨分化来治疗损坏的软骨，其中所述成软骨分化纳米颗粒包含：生物相容的透明质酸聚合物，其通过乙烯砜交联剂交联以形成交联生物聚合物，其中所述生物相容的透明质酸聚合物具有10K至1.5M的分子量，并且所述生物相容的聚合物：乙烯砜的交联比为4:1至1:4，并且所述交联的生物聚合物具有大于200nm的直径以调节内化；与所述交联的生物聚合物接触的配体，其中所述配体与一种或多种细胞表面靶点相互作用；与所述纳米颗粒缔合的选自TGF-β1和TGF-β3的一种或多种TGF活性剂，其中所述一种或多种TGF活性剂被释放以引发较高的成软骨分化；和与所述交联剂、第一生物相容的聚合物、配体或其组合接触的可检测的标签，其中所述可检测的标签是荧光染料、放射性标签、金属、纳米颗粒或其组合。
CN201680069894.7A 2015-10-05 2016-10-05 用于软骨损伤的检测和治疗的微米和纳米装置 Active CN108697804B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562237217P 2015-10-05 2015-10-05
US62/237217 2015-10-05
PCT/US2016/055552 WO2017062493A1 (en) 2015-10-05 2016-10-05 Micro-and nano-device for cartilage injury detection and treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108697804A CN108697804A (zh) 2018-10-23
CN108697804B true CN108697804B (zh) 2022-11-15

Family

ID=58488515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680069894.7A Active CN108697804B (zh) 2015-10-05 2016-10-05 用于软骨损伤的检测和治疗的微米和纳米装置

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20180296706A1 (zh)
EP (1) EP3359200B1 (zh)
JP (1) JP6800984B2 (zh)
CN (1) CN108697804B (zh)
WO (1) WO2017062493A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102018102807A1 (de) * 2018-02-08 2019-08-08 Stefan Eggli Mittel zum Clustern von Rezeptoren
CN110006790B (zh) * 2019-04-09 2024-05-07 中国人民解放军总医院 软骨渗透性测量装置及测量方法
CN113440626A (zh) * 2020-03-30 2021-09-28 复旦大学附属华山医院 一种针对关节软骨损伤的靶向纳米磁共振造影剂及其制备和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001231401A (ja) * 2000-02-23 2001-08-28 Japan Science & Technology Corp 人工的に誘発された変形性関節症モデル齧歯目動物
CN1543353A (zh) * 2001-08-14 2004-11-03 ���������ϱ� 用于治疗关节软骨损伤的组合物
JP2009544690A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド Ｃｃｌ２を含む医薬組成物および炎症の処置のためのその使用
CN101952325A (zh) * 2007-12-19 2011-01-19 诺维信生物制药丹麦公司 乳液中交联的透明质酸
CN103690971A (zh) * 2013-12-20 2014-04-02 中国科学院过程工程研究所 一种具有类风湿性关节炎部位靶向作用的超顺磁性颗粒、制备方法及其用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE469654T1 (de) * 2003-12-30 2010-06-15 Augustinus Bader Verwendung des erythropoietins zur regeneration von lebergewebe
CN101415732B (zh) * 2006-03-02 2011-10-12 诺维信生物制药丹麦公司 芳基/脂族烃基乙烯基砜透明质酸衍生物
KR20090102552A (ko) * 2008-03-26 2009-09-30 한양대학교 산학협력단 히알루론산을 포함하는 연골 손상 질환 치료용도의미세천공 부위 도포용 조성물
WO2010054321A2 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disorders and/or inflammatory disorders
US7829118B1 (en) * 2009-07-30 2010-11-09 Carbylan Biosurgery, Inc. Modified hyaluronic acid polymer compositions and related methods
JP5830882B2 (ja) * 2010-04-08 2015-12-09 東ソー株式会社 酸化亜鉛系透明導電膜、その製造方法及びその用途
US20110256628A1 (en) * 2010-04-20 2011-10-20 The University Of Washington Through Its Center For Commercialization Adaptive tissue engineering scaffold
CA2833739A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Carbylan Biosurgery, Inc. In-situ gel forming compositions
CA2846033A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd Composition for regeneration of cartilage

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001231401A (ja) * 2000-02-23 2001-08-28 Japan Science & Technology Corp 人工的に誘発された変形性関節症モデル齧歯目動物
CN1543353A (zh) * 2001-08-14 2004-11-03 ���������ϱ� 用于治疗关节软骨损伤的组合物
JP2009544690A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド Ｃｃｌ２を含む医薬組成物および炎症の処置のためのその使用
CN101952325A (zh) * 2007-12-19 2011-01-19 诺维信生物制药丹麦公司 乳液中交联的透明质酸
CN103690971A (zh) * 2013-12-20 2014-04-02 中国科学院过程工程研究所 一种具有类风湿性关节炎部位靶向作用的超顺磁性颗粒、制备方法及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP3359200B1 (en) 2023-08-02
EP3359200A4 (en) 2018-10-24
CN108697804A (zh) 2018-10-23
WO2017062493A1 (en) 2017-04-13
EP3359200A1 (en) 2018-08-15
JP6800984B2 (ja) 2020-12-16
EP3359200C0 (en) 2023-08-02
US20180296706A1 (en) 2018-10-18
JP2018530607A (ja) 2018-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Poinard et al. Polydopamine coating enhances mucopenetration and cell uptake of nanoparticles
Li et al. The effect of a nanofiber-hydrogel composite on neural tissue repair and regeneration in the contused spinal cord
Zhang et al. Stromal cell-derived factor-1α-encapsulated albumin/heparin nanoparticles for induced stem cell migration and intervertebral disc regeneration in vivo
Yang et al. Urine‐Microenvironment‐Initiated Composite Hydrogel Patch Reconfiguration Propels Scarless Memory Repair and Reinvigoration of the Urethra
Brown et al. Effects of cartilage-targeting moieties on nanoparticle biodistribution in healthy and osteoarthritic joints
KR102138152B1 (ko) 주사가능한 실크 피브로인 입자 및 그의 용도
Wei et al. TGF-β1-supplemented decellularized annulus fibrosus matrix hydrogels promote annulus fibrosus repair
Zhang et al. Polyethylenimine‐coated albumin nanoparticles for BMP‐2 delivery
Li et al. Bioinspired polysaccharide hybrid hydrogel promoted recruitment and chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells
CN108697804B (zh) 用于软骨损伤的检测和治疗的微米和纳米装置
Liu et al. Regulation of the inflammatory cycle by a controllable release hydrogel for eliminating postoperative inflammation after discectomy
Kwon et al. Injectable extracellular matrix hydrogel developed using porcine articular cartilage
Xu et al. An injectable acellular matrix scaffold with absorbable permeable nanoparticles improves the therapeutic effects of docetaxel on glioblastoma
Chen et al. Adhesive and injectable hydrogel microspheres for inner ear treatment
Meimandi-Parizi et al. Role of tissue engineered collagen based tridimensional implant on the healing response of the experimentally induced large Achilles tendon defect model in rabbits: a long term study with high clinical relevance
Freitas et al. Development of mucoadhesive sericin/alginate particles loaded with ibuprofen for sustained drug delivery
Wang et al. X-ray synthesized PEGylated (polyethylene glycol coated) gold nanoparticles in mice strongly accumulate in tumors
Lawson et al. Nanotechnology and osteoarthritis. Part 1: clinical landscape and opportunities for advanced diagnostics
Asghar et al. PLGA micro-and nanoparticles loaded into gelatin scaffold for controlled drug release
Gan et al. Mesenchymal stem cell exosomes encapsulated oral microcapsules for acute colitis treatment
Qian et al. DLP printed hDPSC-loaded GelMA microsphere regenerates dental pulp and repairs spinal cord
Zhuang et al. A 3D-printed bioactive polycaprolactone scaffold assembled with core/shell microspheres as a sustained BMP2-releasing system for bone repair
Cao et al. A nanoparticle‐coupled T2 peptide induces immune tolerance and ameliorates chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) in mice model
Chen et al. Kartogenin (KGN)/synthetic melanin nanoparticles (SMNP) loaded theranostic hydrogel scaffold system for multiparametric magnetic resonance imaging guided cartilage regeneration
CN113995891B (zh) 一种自更新水合润滑载药水凝胶微球及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant