CN108690834B - 貉细小病毒株及其应用、貉细小病毒灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

貉细小病毒株及其应用、貉细小病毒灭活疫苗及其制备方法，属于疫苗制备技术领域。本发明针对目前貉细小病毒灭活疫苗安全性以及免疫效果差的问题，提供了一种貉细小病毒株，所述病毒株为貉细小病毒RDPV‑HeB17毒株，保藏编号为：CGMCC NO.15483。将RDPV‑HeB17毒株接种于F81细胞，培养至细胞出现病变后，冻存即成病毒液，病毒经BEI灭活后，加入氢氧化铝胶制成灭活疫苗，可用于预防貉细小病毒性肠炎。

Description

貉细小病毒株及其应用、貉细小病毒灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种貉细小病毒株及其应用、貉细小病毒灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
貉细小病毒病又名貉细小病毒性肠炎，是貉的一种急性、高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率，常呈地方性和季节性流行，主要通过消化道和呼吸道传播，是貉的主要传染病。
1984年，貉细小病毒性肠炎在我国黑龙江省首次报道。1988年，夏咸柱等从不同地区肠炎病貉分离出3株貉细小病毒，2008年，刘双翼等在大庆貉养殖厂分离1株貉细小病毒，2009年闫喜军等在辽宁省、河北省等地分离到6株貉细小病毒。近年来，貉细小病毒性肠炎的流行愈演愈烈。目前，国内大多采用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗或犬细小病毒弱毒苗，虽有一定的免疫交叉保护作用，但存在交叉保护抗体不高、免疫原性差等缺点。
因此，开发安全、有效的貉细小病毒是预防貉细小病毒性肠炎的有效方法，具有广阔的市场途径。
发明内容
本发明针对目前貉细小病毒灭活疫苗安全性以及免疫效果差的问题，提供了一种貉细小病毒株，所述病毒株为貉细小病毒RDPV-HeB17毒株，保藏编号为：CGMCC NO.15483。
本发明所述的貉细小病毒株可用于制备貉细小病毒灭活疫苗，所述疫苗含有灭活后的貉细小病毒RDPV-HeB17毒株。
上述貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤:
1)F81细胞按正常传代后，接种RDPV-HeB17毒株，培养72-96h收获细胞培养液，冻融即成病毒液；
2)将病毒液经二乙烯亚胺(即BEI)灭活后，加入氢氧化铝胶制成貉细小病毒灭活疫苗。
优选地，步骤1)所述F81细胞培养于MEM培养基中，在37℃条件下培养3天后进行传代培养。
优选地，步骤1)所述RDPV-HeB17毒株是按照MOI为0.1～0.3的比例接种至F81细胞上，然后在37℃条件下培养。
优选地，步骤1)所述病毒液病毒含量≥106.0TCID50/ml。
优选地，步骤2)所述二乙烯亚胺在病毒液中的终浓度为0.003mol/L。
优选地，步骤2)所述的灭活，灭活温度为35℃，时间为24h。
优选地，步骤2)所述氢氧化铝在貉细小病毒灭活疫苗中的终浓度为5％，所述浓度为质量分数。
有益效果
1.本发明利用传代细胞F81，从貉细小病毒感染貉肠道中分离出5株貉细小病毒，经细胞连续传代和克隆纯化，5株貉细小病毒经BEI灭活后，加入氢氧化铝胶佐剂，制成灭活疫苗后，免疫接种貉进行免疫原性研究，筛选得到一株安全性好，免疫原性良好的貉细小病毒RDPV-HeB17株，用于制备貉细小病毒灭活疫苗，可预防貉细小病毒性肠炎。
2.本发明制备的貉细小病毒灭活疫苗，一次免疫接种6周龄以上貉，保护率为100％，一次免疫接种6个月后，貉对貉细小的保护率95％，具有良好的免疫效果。
3.本发明制备的貉细小病毒灭活疫苗，单剂量免疫组显示对免疫动物具有良好的安全性，免疫后可产生理想的免疫效果，在防治貉细小病毒性肠炎领域将具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明所述毒株RDPV-HeB17保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.15483。
F81细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。
所述MEM培养基：含谷氨酰胺的基础培养基，购自CORNING公司。
其他试剂或仪器如无特殊说明，均通过现有的商业化购买获得。
实施例1.貉细小病毒的分离鉴定。
从河北省发生肠炎的貉中采取肠道内容物，将内容物用0.2MPBS稀释5倍后，5000rpm离心30分钟，0.22um滤器过滤除菌，获得的滤液按照0.5％-1％的体积比接种传代后12小时内的F81细胞，T25细胞培养瓶，5瓶，每瓶接种0.5mL，接种2小时后将上清倒去，重新加入含8％血清的MEM新培养基进行培养，培养至4天时，可见拉网状细胞病变，将细胞瓶置-20℃冰柜冻存，冻融后，即为病毒液，将病毒液接种F81细胞，按上述方法进行传代，共传代2次，得到第三代培养物，即为F3代。将F3代培养物提取DNA，根据GenBank上已公布肉食兽细小病毒VP2基因序列，设计VP2基因全长PCR引物(P1:5’-CAACATCAAGACCAACAAAAC-3’；P2：5’-TAACAAACCTTCTAAATCCTA-3’),进行VP2全长基因的扩增。反应体系为：10×PCR buffer:5ul,dNTP(2.5mmol/L):4ul，上、下游引物各1uL，ExTaqDNA聚合酶0.5ul，病毒DNA1uL，灭菌去离子水37.5uL。以纯化水代替DNA模板作为阴性对照，反应程序为：94℃预变性5min，进入循环94℃1min，59℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，于72℃延伸15min。PCR扩增产物于浓度为0.9％琼脂糖凝胶中进行电泳，得到目的条带，按DNA凝胶纯化试剂盒进行凝胶回收，将回收的DNA片段5.5ul，Ligation Solution 6ul，pEASY-T1载体0.5ul，16℃连接过夜，将连接产物在感受态细胞刚刚解冻时于50ul Trans1-T1感受态混匀，冰浴30min。42℃热激45秒，立即置于冰上2分钟。加LB培养基1000uL,200转，37℃孵育1小时，取8ul，500mMIPTG,40ul，20mg/mL X-gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在37℃放置30min。待IPTG,X-gal被吸收后，取200ul菌液铺板，培养过夜。挑选白色克隆接种于LB/Amp+的液体培养基中，过夜培养，按小提质粒试剂盒说明书要求小量提取质粒，之后将提取的质粒用限制性内切酶EcoRV进行酶切，酶切鉴定反应体系为10uL：EcoRV 1uL，质粒4uL，10×K buffer1uL，灭菌去离子水:4uL,将鉴定的重组子送宝生物工程有限公司测序。得到序列进行分析鉴定，长度为1755bp,为貉细小病毒RDPV-VP2基因序列，确认得到5株貉细小病毒。
貉细小病毒的免疫原性研究：
将上述每株貉细小病毒液进行病毒含量滴定，将滴定后的病毒均调整至106.0TCID50/ml，将病毒液加入终浓度为0.003mol/L的二乙烯亚胺BEI，35℃灭活24h，灭活后加入BEI使用量的10％(体积分数)的1mol/L硫代硫酸钠中和BEI，将中和后的病毒液进行灭活检验，接种F81细胞，所述灭活检验，是指将病毒液接种至F81细胞，按前述细胞培养的条件进行传代培养，观察是否有病变，未出现拉网状细胞病变细胞即为病毒已灭活。灭活检验合格的病毒液加入终浓度(质量分数)为5％的氢氧化铝胶配制成灭活疫苗，参照2015版中华人民共和国兽药典进行无菌检测、参照下述方法进行安全检验，结果表明上述灭活的疫苗均合格。
安全检验方法：用健康易感貉(貉细小病毒HI抗体效价≤1∶4)5只，各肌肉接种疫苗5ml(5个免疫剂量)，分4点注射，观察10日，精神、食欲、体温与粪便应无异常变化。
将5株毒株制成的疫苗分别免疫貉细小病毒中和抗体阴性健康貉10只，每只免疫1ml，免疫21天后采血，分离血清，测定每组中每只貉的HI抗体(测定方法为微量血凝抑制检测法)，结果其中3株毒株免疫的3组貉中HI抗体≥1:32的均未达到100％；另2株HI抗体均≥1:32，其中一株毒株免疫的貉中的HI抗体均≥1:64，HI抗体平均达1:256，将该毒株作为疫苗毒，命名为RDPV-HeB17株。
实施例2.貉细小病毒的安全性研究。
貉细小病毒灭活疫苗的制备：
1)将RDPV-HeB17株按照MOI为0.1的比例接种于传代后12小时内的F81细胞中，在37℃条件下，于含8％新生牛血清(体积分数)的MEM培养基中培养72-96h后，可见细胞出现拉网状病变，将细胞培养液于-20℃下冻存，所述培养液中含有RDPV-HeB17毒株，冻融后，获得RDPV-HeB17病毒液。
2)将病毒液进行滴定调整至106.0TCID50/ml后加入二乙烯亚胺BEI，35℃灭活24h，所述二乙烯亚胺在病毒液中的终浓度为0.003mol/L；然后加入氢氧化铝胶配制成灭活疫苗，所述氢氧化铝在灭活疫苗中的终浓度(质量分数)为5％。
按上述方法制备3批疫苗，分别进行单剂量免疫，单剂量重复免疫，和超剂量免疫试验。
1.单剂量免疫组，免疫健康易感貉(貉细小病毒HI抗体≤1:4)10只，后肢内侧肌肉接种，1ml/只，接种后连续观察15日，观察全身临床症状和接种局部变化，并在接种后10日，每日上午记录体温变化。第15日每组剖杀3只貉，每只貉取注射部位及周围肌肉组织制备病理切片，检查接种部位有无组织病理学变化。
2.单剂量重复免疫组，免疫健康易感貉(貉细小病毒HI抗体≤1:4)10只；两次接种时间间隔15日后肢内侧肌肉接种，两次接种均1ml/只，继续观察15日。观察全身临床症状和接种局部变化，并在接种后10日，每日上午记录体温变化。第15日每组剖杀3只貉，每只貉取注射部位及周围肌肉组织制备病理切片，检查接种部位有无组织病理学变化。
3.超剂量免疫组：接种健康易感貉(貉细小病毒HI抗体≤1:4)10只，后肢内侧肌肉接种，3ml/只，分三点注射，接种后连续观察15日，观察全身临床症状和接种局部变化，并在接种后10日，每日上午记录体温变化。第15日每组剖杀3只貉，每只貉取注射部位及周围肌肉组织制备病理切片，检查接种部位有无组织病理学变化。
4.安全性试验对照组，对照组健康易感貉(貉细小病毒HI抗体≤1:4)注射生理盐水，数量为5只，与上述试验同步进行。
安全性研究结果：
1.单剂量免疫组：通过15日观察，接种貉体温、外观和精神状态正常，食欲和粪便均正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应；选择3只貉剖杀后切开注射部位皮肤观察貉接种部位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，病理切片观察免疫组和对照组貉注射部位肌肉组织均正常，肌纤维细胞和细胞核形态正常，未发现炎症细胞和其它脓性渗出物。
2.单剂量重复免疫组：通过15日观察，接种貉体温、外观和精神状态正常，食欲和粪便均正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应；选择3只貉剖杀，切开注射部位皮肤，貉接种部位皮下无异常变化，接种部位肌肉组织正常，病理切片观察免疫组和对照组貉注射部位肌肉无组织病理学变化，肌纤维细胞和细胞核形态正常，无炎症细胞。
3.超剂量免疫组：通过15日观察，接种水貂体温、外观和精神状态正常，食欲和粪便均正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身不良反应。选择3只剖杀，切开注射部位皮肤，接种部位皮下无异常变化，接种部位肌肉组织正常，病理切片观察对照组肌肉组织均正常，肌纤维细胞和细胞核形态正常，未发现炎性细胞。
说明由RDPV-HeB17毒株制备的貉细小病毒灭活疫苗对貉具有较好的安全性。
实施例3.貉细小病毒的效力研究。
将RDPV-HeB17株上述方法制备成3批疫苗，进行免疫效力试验。
3批灭活疫苗分别免疫未接种任何疫苗的健康易感貉，每批疫苗肌肉接种貉20只，每只1ml，免疫后21日采血，分离血清测定貉细小病毒HI抗体效价，同时取5只免疫貉，连同对照组健康易感貉5只分别用106.5TCID50/ml的RDPV-HeB17株进行攻毒，每只1ml，进行灌服，观察15日。
结果：3批疫苗的免疫组HI抗体效价均为1:128～1:2048，平均为1:652，3批疫苗免疫后攻毒，免疫组5/5保护，对照组5/5发病。
另于免疫后3个月，6个月，采血监测HI抗体。
结果为：免疫后3个月，3批疫苗免疫组HI抗体效价为：1:64～1:512，平均：1:269。
免疫后6个月，3批疫苗免疫组HI抗体效价为：1:32～1:128，平均：1:83。
说明疫苗对貉具有较好的免疫效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 貉细小病毒株及其应用、貉细小病毒灭活疫苗及其制备方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> RDPV-VP2基因全长
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agagtggttg taaataatat ggataaaact gcagttaatg gaaacatggc tttagatgat 300
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tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgaattgca tttagttagt 420
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<400> 3
taacaaacct tctaaatcct a 21

Claims (10)

1.一种貉细小病毒株，其特征在于，为貉细小病毒RDPV-HeB17毒株，保藏编号为：CGMCCNO.15483。
2.权利要求1所述的貉细小病毒株在制备貉细小病毒灭活疫苗中的应用。
3.一种貉细小病毒灭活疫苗,其特征在于，所述疫苗含有灭活后的貉细小病毒RDPV-HeB17毒株；所述貉细小病毒RDPV-HeB17毒株的保藏编号为CGMCC NO.15483。
4.一种权利要求3所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
1)F81细胞按正常传代后，接种RDPV-HeB17毒株，培养72-96h收获细胞培养液，冻融即成病毒液；
2)将病毒液经二乙烯亚胺BEI灭活后，加入氢氧化铝胶制成貉细小病毒灭活疫苗。
5.根据权利要求4所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)所述F81细胞培养于MEM培养基中，在37℃条件下培养3天后进行传代培养。
6.根据权利要求4所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)所述RDPV-HeB17毒株是按照MOI为0.1～0.3的比例接种至F81细胞上，然后在37℃条件下培养。
7.根据权利要求4所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)所述病毒液病毒含量≥106.0TCID50/ml。
8.根据权利要求4所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)所述二乙烯亚胺在病毒液中的终浓度为0.003mol/L。
9.根据权利要求4所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的灭活，灭活温度为35℃，时间为24h。
10.根据权利要求4所述的貉细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)所述氢氧化铝在貉细小病毒灭活疫苗中的终浓度为5％，所述浓度为质量分数。
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