CN108676060A - 从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质 - Google Patents

从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质 Download PDF

Info

Publication number
CN108676060A
CN108676060A CN201810524918.4A CN201810524918A CN108676060A CN 108676060 A CN108676060 A CN 108676060A CN 201810524918 A CN201810524918 A CN 201810524918A CN 108676060 A CN108676060 A CN 108676060A
Authority
CN
China
Prior art keywords
termite
extracting
protein
antiseptic
antiseptic protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810524918.4A
Other languages
English (en)
Inventor
叶新
刘军
殷建新
罗惠波
于川
黄丹
喻勇
王志平
许波
林俊
王洋
杨跃寰
李仁奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University of Science and Engineering
Original Assignee
Sichuan University of Science and Engineering
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University of Science and Engineering filed Critical Sichuan University of Science and Engineering
Priority to CN201810524918.4A priority Critical patent/CN108676060A/zh
Publication of CN108676060A publication Critical patent/CN108676060A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提供一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，包括以下步骤：称取白蚁粉末置于索氏提取器中，加入有机溶剂进行抽提以脱除所述白蚁粉末中的脂肪，经干燥后得到脱脂白蚁粉末；将所述脱脂白蚁粉末置于体积分数50～70％乙醇中进行浸提，分离后得到浸提液，蒸去所述浸提液中的乙醇后得到粗提液；利用串联柱层析色谱对所述粗提液进行分离纯化，得到提取液；利用抑菌实验对所述提取液进行筛选，得到所述抗菌蛋白质，本发明还提供了利用所述方法提取的抗菌蛋白质。本发明所述提取方法利用串联柱层析色谱法原理对提取的蛋白质进行分离，具有设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高的优点。

Description

从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋 白质
技术领域
本发明涉及抗菌蛋白质的提取领域，具体是一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质。
背景技术
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入固定相凝胶颗粒中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和固定相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。葡聚糖凝胶指的是由一定平均相对分子质量的葡聚糖(dextran)和甘油基以醚桥形式相互交联而成，具有立体网状结构，应用面广的一类凝胶；交联度的大小，可通过控制交联剂(一般为环氧氯丙烷)和葡聚糖的配比以及反应条件来控制；交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍；葡聚糖凝胶理化性质稳定：其在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的；葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。葡聚糖凝胶因分子筛作用，广泛的应用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定等方面。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题，提供一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：
一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)称取白蚁粉末置于索氏提取器中，加入有机溶剂进行抽提以脱除所述白蚁粉末中的脂肪，经干燥后得到脱脂白蚁粉末；
(2)将所述脱脂白蚁粉末置于体积分数50～70％乙醇中进行浸提，分离后得到浸提液，蒸去所述浸提液中的乙醇后得到粗提液；
(3)利用串联柱层析色谱对所述粗提液进行分离纯化，得到提取液；
(4)利用抑菌实验对所述提取液进行筛选，得到所述抗菌蛋白质。
优选的，步骤(1)中所述有机溶剂为乙醚或石油醚。
优选的，步骤(1)中所述抽提的时间为6～12h。
优选的，所述步骤(2)中乙醇与脱脂白蚁粉末的比例为25～35mL/g。
优选的，所述步骤(2)中浸提温度为2～8℃，浸提时间为20～30h。
优选的，所述步骤(2)中利用旋转蒸发仪蒸去所述浸提液中的乙醇。
优选的，步骤(3)中所述串联柱层析色谱的固定相为交联葡聚糖SephadexG-25和G-15，流动相为0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液。
优选的，步骤(4)中所述抑菌实验的测试菌为大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌或肺炎克雷伯杆菌中的一种或几种。
一种上述从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法提取的抗菌蛋白质，所述抗菌蛋白质的分子量为1000～2500道尔顿。
本发明的有益效果是：本发明提供的从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法首先脱除所述白蚁粉末中的脂肪，再利用乙醇浸提所述脱脂白蚁粉末中的蛋白质，利用串联柱层析色谱，筛选出不同分子量大小的蛋白质，最后通过抑菌实验，能够简单有效地从白蚁中提取抗菌蛋白质，本发明所述提取方法利用串联柱层析色谱法原理对提取的蛋白质进行分离，具有设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高的优点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所述交联葡聚糖Sephadex G-25和G-15为市售试剂。
实施例1
(1)将白蚁样品干燥后用电粉碎机粉碎，称取10g白蚁粉末，用滤纸筒包好，再放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入乙醚至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在水浴中加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口，提取12h，再将滤纸筒内样品50℃充分干燥后得到脱脂白蚁粉末；
(2)按料液比l：35(m/V，g/mL)分别取脱脂白蚁粉末和体积分数50％乙醇/水混合液，在2℃下浸提24h后用滤纸过滤，将得到的提取液在4℃、6000～7000r/min条件下离心20min，利用旋转蒸发仪去除上清液中的乙醇，得到粗提液；
(3)利用串联柱层析色谱对所述粗提液进行分离纯化，色谱固定相为交联葡聚糖Sephadex G-25和G-15，流动相为0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别装填Sephadex G-25色谱柱和Sephadex G-15色谱柱；将G-25和G-15色谱柱串联起来，其中G-25在上方；将所述粗提液上柱G-25进行层析分离，在G-15柱子下用自动收集器收集洗脱液即为提取液，设定15min收集1管，每管3～5ml，做好编号；
(4)将所述提取液进行抑菌实验，筛选抗菌蛋白质，以大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯杆菌为测试菌，用牛津杯发做抑菌实验，计算抑菌圈直径实验重复3次，计算平均值，有抑菌作用的收集管里的物质即为抗菌蛋白质，将其置放于-20℃保存。
实施例2
(1)将白蚁样品干燥后用电粉碎机粉碎，称取10g白蚁粉末，用滤纸筒包好，再放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在水浴中加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口，提取10h，再将滤纸筒内样品50℃充分干燥后得到脱脂白蚁粉末；
(2)按料液比l：25(m/V，g/mL)分别取脱脂白蚁粉末和体积分数70％乙醇/水混合液，在4℃下浸提24h后用滤纸过滤，将得到的提取液在4℃、6000～7000r/min条件下离心20min，利用旋转蒸发仪去除上清液中的乙醇，得到粗提液；
(3)利用串联柱层析色谱对所述粗提液进行分离纯化，色谱固定相为交联葡聚糖Sephadex G-25和G-15，流动相为0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别装填Sephadex G-25色谱柱和Sephadex G-15色谱柱；将G-25和G-15色谱柱串联起来，其中G-25在上方；将所述粗提液上柱G-25进行层析分离，在G-15柱子下用自动收集器收集洗脱液即为提取液，设定15min收集1管，每管3～5ml，做好编号；
(4)将所述提取液进行抑菌实验，筛选抗菌蛋白质，以大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯杆菌为测试菌，用牛津杯发做抑菌实验，计算抑菌圈直径实验重复3次，计算平均值，有抑菌作用的收集管里的物质即为抗菌蛋白质，将其置放于-20℃保存。
实施例3
(1)将白蚁样品干燥后用电粉碎机粉碎，称取10g白蚁粉末，用滤纸筒包好，再放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入乙醚至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在水浴中加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口，提取8h，再将滤纸筒内样品50℃充分干燥后得到脱脂白蚁粉末；
(2)按料液比l：30(m/V，g/mL)分别取脱脂白蚁粉末和体积分数60％乙醇/水混合液，在8℃下浸提30h后用滤纸过滤，将得到的提取液在4℃、6000～7000r/min条件下离心20min，利用旋转蒸发仪去除上清液中的乙醇，得到粗提液；
(3)利用串联柱层析色谱对所述粗提液进行分离纯化，色谱固定相为交联葡聚糖Sephadex G-25和G-15，流动相为0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别装填Sephadex G-25色谱柱和Sephadex G-15色谱柱；将G-25和G-15色谱柱串联起来，其中G-25在上方；将所述粗提液上柱G-25进行层析分离，在G-15柱子下用自动收集器收集洗脱液即为提取液，设定15min收集1管，每管3～5ml，做好编号；
(4)将所述提取液进行抑菌实验，筛选抗菌蛋白质，以大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯杆菌为测试菌，用牛津杯发做抑菌实验，计算抑菌圈直径实验重复3次，计算平均值，有抑菌作用的收集管里的物质即为抗菌蛋白质，将其置放于-20℃保存。
本发明所述抗菌蛋白质对大肠埃希氏杆菌和肺炎克雷伯杆菌具有抑制作用，其中对大肠埃希氏杆菌的最小抑菌浓度为2.86mg/L,对肺炎克雷伯杆菌的最小抑菌浓度为8.35mg/L。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取白蚁粉末置于索氏提取器中，加入有机溶剂进行抽提以脱除所述白蚁粉末中的脂肪，经干燥后得到脱脂白蚁粉末；
(2)将所述脱脂白蚁粉末置于体积分数50～70％乙醇中进行浸提，分离后得到浸提液，蒸去所述浸提液中的乙醇后得到粗提液；
(3)利用串联柱层析色谱对所述粗提液进行分离纯化，得到提取液；
(4)利用抑菌实验对所述提取液进行筛选，得到所述抗菌蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，步骤(1)中所述有机溶剂为乙醚或石油醚。
3.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，步骤(1)中所述抽提的时间为6～12h。
4.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(2)中乙醇与脱脂白蚁粉末的比例为25～35mL/g。
5.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(2)中浸提温度为2～8℃，浸提时间为20～30h。
6.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(2)中利用旋转蒸发仪蒸去所述浸提液中的乙醇。
7.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，步骤(3)中所述串联柱层析色谱的固定相为交联葡聚糖SephadexG-25和G-15，流动相为0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法，其特征在于，步骤(4)中所述抑菌实验的测试菌为大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌或肺炎克雷伯杆菌中的一种或几种。
9.一种权利要求1～8任一项所述的从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法提取的抗菌蛋白质，其特征在于，所述抗菌蛋白质的分子量为1000～2500道尔顿。
CN201810524918.4A 2018-05-28 2018-05-28 从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质 Pending CN108676060A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810524918.4A CN108676060A (zh) 2018-05-28 2018-05-28 从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810524918.4A CN108676060A (zh) 2018-05-28 2018-05-28 从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108676060A true CN108676060A (zh) 2018-10-19

Family

ID=63808914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810524918.4A Pending CN108676060A (zh) 2018-05-28 2018-05-28 从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108676060A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928745A (zh) * 2010-08-12 2010-12-29 武汉太极三丰生物科技有限公司 蚂蚁多肽的制备方法及用途
US20180020678A1 (en) * 2016-04-01 2018-01-25 Michael E. Scharf Methods, compositions, and molecular targets that exploit synergies and symbioses in the termite gut

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928745A (zh) * 2010-08-12 2010-12-29 武汉太极三丰生物科技有限公司 蚂蚁多肽的制备方法及用途
US20180020678A1 (en) * 2016-04-01 2018-01-25 Michael E. Scharf Methods, compositions, and molecular targets that exploit synergies and symbioses in the termite gut

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENJI MATSUURA 等: "The Antibacterial Protein Lysozyme Identified as the Termite Egg Recognition Pheromone", 《PLOS ONE》 *
于小磊 等: "蚂蚁蛋白提取及氨基酸营养液制备的研究", 《中国农学通报》 *
宋玉涛 等: "Spinigerin α抗菌肽的分离纯化及其活性研究", 《经济动物学报》 *
李仁奇 等: "野生大黑蚁中抗菌肽类物质的分离纯化及其耐热性", 《生物资源》 *
王振宇: "《生物活性成分分离技术》", 31 May 2015, 哈尔滨工业大学出版社 *
苏翔: "蚂蚁抗菌肽的分离纯化及其活性的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 *
谢寿安: "《森林昆虫学研究方法与技术导论》", 30 November 2013, 西北农林科技大学出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hoff et al. A method for determination of tannins in foods by means of immobilized protein
Afzali et al. A novel method for high preconcentration of ultra trace amounts of B1, B2, G1 and G2 aflatoxins in edible oils by dispersive liquid–liquid microextraction after immunoaffinity column clean-up
Lee et al. Comparative analysis of tea catechins and theaflavins by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis
Sun et al. Isolation and purification of dimeric and trimeric procyanidins from grape seeds
Zhao et al. Preliminary separation and purification of rutin and quercetin from Euonymus alatus (Thunb.) Siebold extracts by macroporous resins
CN105148558B (zh) 一种净化真菌毒素的固相萃取柱及其应用
Ranatunge et al. Development of a rapid and simple method to remove polyphenols from plant extracts
Xu et al. Characterization and determination of isomers in plants using trace matrix solid phase dispersion via ultrahigh performance liquid chromatography coupled with an ultraviolet detector and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry
Kong et al. Chitosan-based adsorption and freeze deproteinization: Improved extraction and purification of synthetic colorants from protein-rich food samples
Nave et al. Use of solid-supported liquid–liquid extraction in the analysis of polyphenols in wine
JPH069607A (ja) 茶カテキン類の製造方法
Ziaková et al. Application of different preparation techniques for extraction of phenolic antioxidants from lemon balm (Melissa officinalis) before HPLC analysis
CN103183616B (zh) 一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法
Woitke et al. HPLC determination of lipophilic photosynthetic pigments in algal cultures and lake water samples using a non-endcapped C18-RP-column
CN104256640B (zh) 一种从人心果叶子提取天然抗氧化物质的方法
Stack et al. Determination of sterigmatocystin in corn and oats by gel permeation and high-pressure liquid chromatography
Chaimbault The Modern art of identification of natural substances in whole plants
JP2006337222A (ja) 還元物質の分析方法
CN108676060A (zh) 从白蚁中提取抗菌蛋白质的方法及由该方法提取的抗菌蛋白质
Ma et al. Soxhlet-assisted matrix solid phase dispersion to extract flavonoids from rape (Brassica campestris) bee pollen
Papetti Isolation and characterization of antimicrobial food components
CN104327026B (zh) 一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法
CN109265494B (zh) 从滇山茶中提取山奈酚葡萄糖苷类化合物的方法
CN107936265A (zh) 植物缩合单宁高聚体的提取方法
KR20200060685A (ko) 오미자 및 칠해목 혼합 추출물의 지표성분 동시분석 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181019

RJ01 Rejection of invention patent application after publication