CN108653312A

CN108653312A - 内质网受体蛋白sting的激活剂联合磷酸二酯酶enpp1的抑制剂抗肿瘤研究

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Publication number: CN108653312A
Application number: CN201810397399.XA
Authority: CN
Inventors: 谭瀛轩; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Hangzhou Star Bioscience Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Star Bioscience Co Ltd
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108653312B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，发明了一种联合抗肿瘤创新药物，该抗肿瘤联合药物包括内质网受体蛋白STING的激动剂（激活剂）和内质网膜上的磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂。该类联合抗肿瘤药物比单独使用内质网受体蛋白STING的激动剂／激活剂具有更好的免疫抗肿瘤药效。因此，这种新型联合抗肿瘤药物具有高效临床应用前景。

Description

内质网受体蛋白STING的激活剂联合磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂抗肿瘤研究

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种联合抗肿瘤创新药物，该抗肿瘤联合药物包括内质网受体蛋白STING的激动剂和内质网膜上的磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂。该类联合抗肿瘤药物比单独使用内质网受体蛋白STING的激动剂／激活剂具有更好的免疫抗肿瘤药效。

背景技术

肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。WHO专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2 000万人，死亡人数将达到1 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。肺癌、结/直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列。据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。

在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合DNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面有重要作用，cGAMP结合STING使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。

环二核苷酸合成酶(cGAS)是先天性免疫通路中重要的细胞质DNA感受器。cGAMP作为二级信使分子通过内质网膜上的STING蛋白通路诱导干扰素IFN-β和其他细胞因子的产生，调节下游蛋白质表达，诱导细胞生长停滞和凋亡，产生抗病毒效应。STING通路可以调节免疫原性肿瘤的先天免疫识别，促进干扰素的抗肿瘤作用。IFN-γ在体内通过TRAIL(tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand)发挥抗肿瘤作用，促进肿瘤细胞凋亡。cGAMP是先天免疫反应的关键刺激物，是STING的内源性激活剂，因此，cGAMP具有免疫抗肿瘤作用。

STING是内质网的跨膜受体蛋白，内质网上还具有一种磷酸二酯酶ENPP1。在细胞质中没有发现ENPP1活性。相反，它被发现在肝细胞中的质膜的基底侧表面上和肝脏的粗糙内质网部分。其催化结构域驻留在内质网空腔中，且需要高浓度钙离子供其活动。ENPP1水解酶可以降解2’3’-cGAMP。这个酶具有相当宽的底物特异性，包括ATP和NAD+，实验显示2'3'-cGAMP是良好的重组ENPP1的底物。因此，ENPP1的抑制剂可以抑制2’3’-cGAMP被水解，使2'3'-cGAMP药效利用度提高。另外，用脂质体包裹cGAMP或其衍生物激动剂药物联合ENPP1水解酶的抑制剂药物，可以更好地延长2'3'-cGAMP代谢时间，提高药效。且脂质体具有免疫佐剂的作用，可以进行肿瘤细胞靶向，提高药物利用率。

发明内容

本发明的目的在于提供一类联合抗肿瘤创新药物，该抗肿瘤联合药物包括内质网受体蛋白STING的激动剂和内质网膜上的磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂。该类联合抗肿瘤药物比单独使用内质网受体蛋白STING的激动剂／激活剂具有更好的免疫抗肿瘤药效。

本发明所述的环二核苷酸cGAMP，如不加说明，指的是2’3’-cGAMP 或 Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1：环二核苷酸cGAMP及其衍生物的制备

cGAMP 或其衍生物（环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Li P.W，et al., Immunity,2013, 39(6), 1019-1031.）

实施例2：脂质体包裹STING的激动剂联合ENPP1的抑制剂的制备方法

1、脂质体原料：卵磷脂（lipoid EPCs）、胆固醇（CH）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000－mal），均购买自Sigma公司。鼠源抗PD1、PDL1、VEGF 单克隆抗体购于Biolegend公司。

2、STING激动剂联合ENPP1抑制剂脂质体药物的制备方法

免疫脂质体制备

称取适量磷脂膜材,包括蛋黄卵磷脂（EPC），胆固醇（CH），DSPE-PEG2000-Mal，按摩尔比例（卵磷脂（EPC）: 胆固醇（CH）: DSPE-PEG-Mal=10:2:0.5）配料使用通常方法制备脂质体（Chen X., et al.,Int J Nanomedicine,2012,7:1139-1148; Waldrep J.C.,et al.,Int J Pharm, 1998, 160(2):239-249）。用脂质体挤出器减小脂质体粒径。

(3)脂质体包裹STING激动剂和ENPP1的抑制剂

向磷脂膜中加入120mmol/L的硫酸铵溶液，振摇（120rpm、 5分钟）形成空白脂质体溶液，该空白脂质体溶液在超纯水中透析过夜。 cGAMP联合ENPP1抑制剂XST086溶解于超纯水中，加入到空白脂质体溶液中，65℃孵育20 分钟，水浴超声减小粒径，用超滤管（MWCO=3000Da）超滤除去未包封药物。

（4）联和抗肿瘤药物脂质体的性质表征

（a）粒径表征

利用动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）测量脂质体的粒径和粒径分布（PDI）。其基本原理为微小粒子悬浮在液体中会无规则地运动（布朗运动），光通过胶体时，粒子会将光散射，在一定角度下可以检测到光信号。大颗粒运动缓慢，散射光斑的强度也将缓慢波动；小粒子运动快速，散射光斑的密度也将快速波动，最后通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布。PDI表示粒径的均一度，是方差的概念。所制备的脂质体粒径约75 nm，PDI=0.424。

（b）Zeta电位

Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。一般用来评价或预测微粒分散体系的物理稳定性,一般Zeta电位绝对值越高,其粒子间的静电斥力也就越大,物理稳定性也就越好。一般Zeta电位绝对值达到30 mV就认为体系比较稳定。本发明制备的脂质体Zeta 电位绝对值为29 mV，稳定性较好。

实施例3：采用荷瘤鼠模型进行检测该联合抗肿瘤药物的抗肿瘤作用即对动物皮下移植瘤生长的抑制作用。

动物

种属、品系、性别、体重、来源、合格证

BALB/c普通小鼠、C57/BL6普通小鼠，雄性，体重20-23g， 7-8周龄， SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] 。

饲养条件

所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温（25±2）℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。

药物剂量设置

静脉注射小鼠，联合用药cGAMP／XST086设置1个剂量组：10 （mg/kg）/5（mg/kg）,

试验对照

阴性对照：生理盐水溶液

阳性对照：cGAMP，剂量10 mg/kg ；

给药方法

给药途径：尾静脉注射给药

给药体积：100 微升/只

给药次数：连续21天给药。

cGAMP,每天1次;

cGAMP/XST086, 每天1次；

cGAMP/XST086脂质体，每天1次；

每组动物数：10只

肿瘤细胞株

小鼠结直肠癌细胞株CT26，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，人黑色素瘤细胞株A375，人胃癌细胞株MNK-45，人卵巢癌细胞株SK-OV-3，均购自中国科学院细胞库。

试验主要步骤

1．肿瘤模型鼠的建立与干预

细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×10⁷)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液 (细胞数目为2.0×10⁶个/只)，10 天左右肿瘤长至直径约5 mm，致瘤成功，随机均分为4组。分别为A：阴性对照组（静脉注射生理盐水组）； B：cGAMP组(静脉注射cGAMP)10 mg/kg; C、D、组（静脉注射联合药cGAMP/XST086; 脂质体包裹联合药cGAMP/XST086）每天一次给药，每次10 mg/kg，连续给药21天；连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率=[1-实验组平均瘤重／A组平均瘤重)]×100％。

分别制备皮下移植瘤模型：小鼠结直肠癌细胞株CT26，移植到BalB/C普通小鼠；小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，移植到C57/BL6小鼠，观察抗肿瘤效果。

2．统计分析

数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。

结果

小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，联合抗肿瘤创新药明显抑制肿瘤生长，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组（P<0.05 ，P<0.01），联合抗肿瘤药优于cGAMP单独用药，表明联合抗肿瘤药具有更优的抗肿瘤作用。具体结果表1-表5：

表1、cGAMP/XST086联合抗肿瘤药对BalB/C小鼠结直肠癌细胞CT26皮下移植瘤的作用（n=10，mean±SD）

组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.260±0.243 （g） -

cGAMP组 0.742 ± 0.182 （g）** 67.0

联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.286 ± 0.125 （g）** 87.3

脂质体联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.262 ± 0.134 （g）** 88.4

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表2、cGAMP/XST086联合抗肿瘤药对C57小鼠肺癌Lewis瘤株 LL-2皮下移植瘤的作用（n=10，mean±SD）

组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.652±0.386 （g） -

cGAMP组 0.780 ± 0.141 （g）** 70.4

联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.289 ± 0.131 （g）** 89.1

脂质体联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.278 ± 0.141 （g）** 89.5

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表3、 cGAMP/XST086联合抗肿瘤药对人黑色素瘤细胞株A375鼠皮下移植瘤的作用（n=10，mean±SD）

组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2 .678 ± 0.145 （g） -

cGAMP组 0.766 ± 0.152 （g）** 71.3

联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.271 ± 0.122 （g）** 89.8

脂质体联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.263 ± 0.134 （g）** 90.1

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表4、 cGAMP/XST086联合抗肿瘤药对人胃癌细胞株MNK-45鼠皮下移植瘤的作用（n=10，mean±SD）

组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.662±0.176 （g） -

cGAMP组 0.783±0.164 （g）** 70.5

联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.273 ± 0.121 （g）** 89.7

脂质体联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.265 ± 0.132 （g）** 90.0

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表5、 cGAMP/XST086联合抗肿瘤药对人卵巢癌细胞株SK-OV-3鼠皮下移植瘤的作用（n=10，mean±SD）

组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.732±0.212 （g） -

cGAMP组 0.762±0.151 （g）** 71.8

联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.278 ± 0.123 （g）** 89.8

脂质体联合抗肿瘤药（cGAMP/XST086）组 0.266 ± 0.138 （g）** 90.2

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

实施例4 cGAMP/XST086联合抗肿瘤药的急性毒性研究

实验材料

ICR 小鼠20 只（购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] ），雌雄各半，体重20～24g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。

联合抗肿瘤药由实施例2制备，用生理盐水配制成浓度为200 mg/mL 的溶液。

实验方法

ICR小鼠按体重单次尾静脉注射200mg/kg 的cGAMP/XST086联合抗肿瘤药，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次尾静脉注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。

实验结果

上述急性毒性实验结果表明，静脉注射给药最大耐受量MTD 不低于200mg/Kg，说明cGAMP/XST086联合抗肿瘤药的急性毒性低。

附图1. XST086（左）及其衍生物（右）的结构式。

Claims

1.内质网受体蛋白STING的激动剂／激活剂联合磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂在抗肿瘤中的作用及其在制备抗肿瘤药物中的应用，

（1A） STING的激动剂／激活剂包括但不限于，环二核苷酸cGAMP/硫代cGAMP或这些环二核苷酸的衍生物；

（1B）磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂包括但不限于XST-086、XST-086的衍生物、硫代乙酰胺衍生物、噻二唑并吡喃酮衍生物、噻唑并苯并咪唑酮衍生物等。

2.XST-086 及其衍生物的结构组成（见附图1）。

3.由脂质体包裹的STING的激动剂／激活剂联合磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂在

抗肿瘤作用及其在制备抗肿瘤药物中的应用，

（1A）该脂质体主要由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000－mal）构成；但不限于以上三种物质，也包括其它磷脂、胆固醇和聚乙二醇构成的脂质体，

（1B）STING的激动（活）剂包括STING通路的激活剂、激动剂，如环二核苷酸cGAMP及其各种各样的衍生物，也包括通过高通量筛选和优化的STING的激活剂或激动剂，但不局限于STING通路的激活剂、激动剂，也包括其它种类的具有抗肿瘤作用的天然免疫通路激活剂、激动剂，

（1C）磷酸二酯酶ENPP1的抑制剂包括但不限于XST-086、XST-086的衍生物、硫代乙酰胺衍生物、噻二唑并吡喃酮衍生物、噻唑并苯并咪唑酮衍生物等。

4.根据权利要求1-2，该类联合抗肿瘤药物，包括但不限于在制备抗肿瘤药物

中的应用，该类药物也可应用于其它基于免疫调节的疾病适治疗药物，如

神经退行性疾病、心脑血管疾病、糖尿病、类风湿关节炎、多发性硬化症

等及其在制备治疗这些疾病药物中的应用。

5.根据权利要求1-3所述的联合抗肿瘤药物和适用于其它适应症的治疗药物，其特征在于：它包含不同规格的单位制剂及药学上可接受的载体制备的药物制剂，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种）等中的一种或多种给药途径进行肿瘤及其直接相关疾病的预防或治疗。