CN108635570B - 一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒及其制备方法，属于生物医学领域。本发明的金纳米簇颗粒包括载体材料、葡萄糖响应的敏感开关因子、药物分子，其制备包括如下步骤：首先制备BSA包被的金纳米簇颗粒BSA‑GNCs，作为药物分子的载体材料；用戊二醛去除BSA分子上的氨基，并用甘氨酸将分子末端转换为羧基，将羧基活化后接枝修饰4‑氨基苯硼酸，作为葡萄糖响应的敏感开关因子；随后在其表面接枝上糖基化胰岛素，得到响应型血糖调节的金纳米簇颗粒。本发明的金纳米簇颗粒能够根据葡萄糖浓度响应而释放出胰岛素，本发明实现了实时响应葡萄糖浓度、迅速智能递释胰岛素、调控人体血糖的功效。

Description

一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的重大慢性代谢性疾病，人体内胰岛素相对不足或绝对不足、导致高血糖是发生糖尿病的根本原因。目前糖尿病已成为危害人类健康的第三大因素。据统计2016年全球有4.2亿糖尿病患者，至2045年，这一数字将增至6.29亿。
实时监测体内血糖浓度、并适时注射胰岛素是有效控制糖尿病的关键。目前，绝大多数糖尿病患者采用胰岛素治疗，即采用注射或口服的方式摄入胰岛素，起到调节血糖的作用。其具体治疗方式是，先进行血糖浓度监测，再根据情况注射胰岛素。然而，传统的血糖检测需要扎针采取手指血液，反复刺针采血给患者造成极大痛苦。目前胰岛素的主要给药方式是利用注射器或胰岛素笔进行皮下注射。长期频繁的皮下胰岛素注射，给患者带来严重的心理压力，影响其生活质量。同时，如果无法精确控制注射的剂量，容易造成高血糖或低血糖，从而诱发严重的并发症，或者是患者体内血糖浓度过低危害生命健康。并且采用这种方式治疗的患者往往要日复一日年复一年的每天定时注射或口服胰岛素。为了减少糖尿病患者的痛苦，一种可以根据血液中葡萄糖浓度(血糖浓度)而释放胰岛素的药物亟待开发。
因此研制有效的、能根据体内血糖浓度做出响应的智能胰岛素递释系统是治疗糖尿病的关键，近年来已成为糖尿病治疗领域的研究热点。
金纳米簇(gold nanoclusters,GNCs)是一种新颖的药物载体材料。金纳米簇作为药物载体具有高效，低毒的优点。前期的研究中发现，相对于传统的纳米材料载体而言，金纳米簇由于其超小的尺寸和超大的比表面积，具有几十甚至几百倍于传统药物载体的载药量。
金纳米簇是指粒径小于3nm的金纳米粒子，一般是几个到几十个金原子构成。因为其排列方式更像原子，也被认为是人工原子。由于GNCs中的自由电子被限制在很小的空间内，难以自由运动。表现出很明显的量子限域效应，正是由于这种特性，使得GNCs与传统金纳米材料有着截然不同的理化性质。GNCs所拥有的与半导体类似的电子结构也使得它具有一定的荧光性能，其表面的不饱和原子使GNCs具有很高的催化活性。因此GNCs现已广泛的应用于生物、医学、光电原件、检测、催化等领域，并且其还有尺寸小、表面积大、荧光稳定性好、荧光可调性、制备条件温和、无毒等优点，因此GNCs在生物成像、细胞标记、药物传递、生物分子检测方面有巨大潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒，该金纳米簇颗粒能够根据葡萄糖浓度响应智能控释胰岛素、调节血糖。本发明的目的还在于提供所述金纳米簇颗粒的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒，包括载体材料、葡萄糖响应的敏感开关因子、药物分子。所述载体材料表面接枝修饰葡萄糖响应的敏感开关因子，所述葡萄糖响应的敏感开关因子表面接枝药物分子。其中，所述载体材料为BSA(牛血清白蛋白)包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)；所述葡萄糖响应的敏感开关因子为苯硼酸或其衍生物，优选为4-氨基苯硼酸(PBA)；所述药物分子为胰岛素，优选为糖基化胰岛素。
所述响应型血糖调节的金纳米簇颗粒的制备方法，包括如下步骤：首先制备BSA包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)，然后在其表面接枝修饰4-氨基苯硼酸(PBA)分子作为葡萄糖响应的敏感开关因子，随后在其表面接枝上糖基化胰岛素，形成根据葡萄糖浓度响应智能控释胰岛素的金纳米簇颗粒，即本发明响应型血糖调节的金纳米簇颗粒。其中，BSA-GNCs表面的氨基需先转化为羧基，并将羧基活化，以利于接枝4-氨基苯硼酸(PBA)。氨基转化为羧基的方法为：用戊二醛去除BSA分子上的氨基，并用甘氨酸将分子末端转换为羧基；具体为：往BSA-GNCs溶液中加入戊二醛，利用醛基和氨基生成席夫碱的反应使BSA表面的氨基与戊二醛上的一个醛基反应，再加入甘氨酸，使甘氨酸上的氨基与戊二醛上的另一个醛基反应，使得BSA表面的氨基转换为羧基；羧基活化优选为使用含1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和吗啉乙磺酸(MES)的活化液进行活化。接枝修饰4-氨基苯硼酸利用羧基与氨基间的特异反应，接枝糖基化胰岛素利用苯硼酸上的二醇基团。
优选的，所述响应型血糖调节的金纳米簇颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备BSA包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)
含HAuCl4、BSA混合溶液在pH≥12的条件下反应得到BSA包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)。该步骤中反应的条件优选为35-40℃反应10-18h，进一步优选为37℃反应12h。
(2)将BSA表面的氨基转换为羧基
先在BSA-GNCs溶液中加入戊二醛，使BSA表面的氨基与戊二醛上的一个醛基反应，再加入甘氨酸(pH优选为8)，使甘氨酸上的氨基与戊二醛上的另一个醛基反应，得到表面不含氨基、仅含羧基的金纳米簇颗粒(GNCs)。该步骤中，加入戊二醛后反应的条件优选为24-26℃反应3-5h，进一步优选为25℃反应4h；加入甘氨酸后反应的条件优选为24-26℃反应20-40min，进一步优选为25℃反应30min。
(3)活化GNCs表面的羧基
将GNCs加入到含EDC、NHS和MES的溶液反应，活化GNCs上的羧基。该步骤中反应的条件优选为24-26℃反应15min-30min，进一步优选为25℃反应15min。
(4)将4-氨基苯硼酸(PBA)接枝到羧基活化后的GNCs
往羧基活化后的GNCs溶液中加入4-氨基苯硼酸反应，得到PBA修饰的金纳米簇颗粒(GNC-PBA)。该步骤中反应的条件优选为24-26℃反应12-18h，进一步优选为25℃反应15h。该步骤的反应是利用氨基和羧基间的特异性缩合反应。
(5)GNC-PBA上接枝糖基化胰岛素
将糖基化胰岛素(Insulin)加入到GNC-PBA溶液中，进行反应，得到金纳米簇-PBA-胰岛素纳米颗粒GNC-PBA-Insulin，即本发明响应型血糖调节的金纳米簇颗粒。该步骤中反应的条件优选为24-26℃反应18-30h，进一步优选为25℃反应24h。该步骤中糖基化胰岛素与PBA的带电荷形式反应，形成可逆的环酯。
所述响应型血糖调节的金纳米簇颗粒在制备糖尿病治疗药物中的应用。
本发明的响应型血糖调节的金纳米簇颗粒在高浓度的葡萄糖溶液中，葡萄糖与糖基化胰岛素竞争苯硼酸上的结合位点，将胰岛素从纳米颗粒上取代下来，释放出胰岛素，降低葡萄糖浓度，进而可使得血糖恢复到正常水平。本发明实现了实时响应葡萄糖浓度、迅速智能递释胰岛素、调控人体血糖的功效。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明以BSA包被的金纳米簇颗粒作为载体材料，其具有超小的尺寸、超大的比表面积，具有几十甚至几百倍于传统药物载体的载药量；以苯硼酸及其衍生物作为敏感开关因子，可实现根据葡萄糖浓度响应智能释放胰岛素、调节血糖的目的，达到可控降低糖尿病中高血糖的效果。制备方法简单，反应条件十分温和(常温，常压，水相)，极大地保护了药物的活性。
附图说明
图1是BSA包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)的合成示意图。
图2是制备得到的BSA-GNCs溶液图，其颜色为深棕色。
图3是BSA-GNCs的TEM图。
图4是BSA-GNCs表面的氨基转换为羧基的示意图。
图5是响应型血糖调节的金纳米簇颗粒GNC-PBA-Insulin的制备过程(步骤①-③)及其血糖调节原理(步骤④)示意图。
图6是不同浓度(3.7mM，14.8mM)的葡糖糖溶液中GNC-PBA-Insulin调节血糖的效果图，图中灰色区间代表人体正常的血糖范围(3.9mM到11.1mM之间)。
图7是不同浓度(3.7mM，14.8mM)的葡糖糖溶液中GNC-PBA-Insulin的降糖效果图。
图8是在不同浓度(3.33mM，13.33mM)的葡萄糖溶液中不同种类的金纳米簇颗粒对葡萄糖的调节效果对比图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
(1)制备BSA包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)
在通风厨内，用王水清洗待用的磁子和圆底烧瓶，用水和酒精清洗，烘干待用。
配制25mL 10mM的氯金酸(HAuCl4)溶液，配制25mL 50mg/mL小牛血清白蛋白(BSA)，将二者按体积比1:1混合，则溶液中HAuCl4的浓度为5mM，BSA浓度为25mg/mL(即0.375mM)。将混合溶液加热至37℃，加入微量NaOH溶液调节pH值到12。在37℃恒温水浴加热，以500rpm的转速搅拌，避光反应12h。溶液颜色从亮黄色变成浅棕色，最终变成深棕色，形成BSA包被的金纳米簇颗粒(BSA-GNCs)(图1)。制备得到的BSA-GNCs溶液颜色为深棕色(图2)。制备得到的BSA-GNCs溶液在4℃下避光保存。
用透射电子显微镜(TEM)观察BSA-GNCs颗粒的大小和形貌(图3)。从TEM照片分析得到BSA-GNCs直径为2.36±0.41nm。
(2)将BSA表面的氨基转换为羧基
上述(1)反应得到的BSA-GNCs溶液中，用茚三酮显色法测量氨基的含量为37.6mM。
取上述BSA-GNCs溶液9.3mL，其中加入1mL 3.5％(即350mM)戊二醛，即溶液中，BSA-GNCs表面氨基浓度为33.95mM，戊二醛的羧基含量为67.96mM。将上述混合溶液置于室温下500rpm转速搅拌反应4h，利用醛基和氨基生成席夫碱的反应，使BSA表面的氨基与戊二醛上的一个醛基反应(图4-①)。反应完成后，将产物放入分子截留量3000的超滤管，常温以6000rpm超滤离心超滤20min，加水，重悬，再次重复超滤两次，如此将未反应的戊二醛滤除。重悬至9.3mL，加入1mL 350mM甘氨酸/柠檬酸钠溶液(10mM柠檬酸钠溶液，pH＝8)，于常温下500rpm搅拌反应30min，使甘氨酸上的氨基(33.98mM)与戊二醛上的另一个醛基反应(图4-②)，使得BSA表面的氨基最终转换为羧基，将产物以分子截留量3000的超滤管，常温以6000rpm超滤离心超滤20min，反复三次，将多余的甘氨酸去除，调节体积至9.3mL，得到表面仅含羧基的金纳米簇颗粒(命名为GNCs)。
利用酸碱滴定法测定溶液中GNCs表面羧基浓度为75.01mM。
(3)活化金纳米簇颗粒(GNCs)上的-COOH
称取0.3450g 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC，200mM)、0.1035gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS，100mM)和0.1757g吗啉乙磺酸(MES，100mM)，加入到9mL水中，搅拌至完全溶解，形成活化液，待用。
取20mL棕色玻璃试剂瓶1只，加入8mL活化液，再加入8mL上述(2)得到的GNCs溶液，常温下以500rpm转速搅拌15min进行反应，使GNCs上的羧基活化(图5-①)，准备与4-氨基苯硼酸(PBA)上的氨基反应。以MWCO3000的超滤管超滤离心，去掉未反应的小分子试剂，调节体积至8mL(活化的羧基浓度为75.01mM)。
(4)活化后的GNCs上接枝PBA
取20mL棕色玻璃试剂瓶1只，加入8mL上述(3)活化后的GNCs溶液(活化的羧基浓度为75.01mM)，再加入8mL 100mM的4-氨基苯硼酸(PBA)溶液(氨基浓度为100mM)，常温下以500rpm搅拌，避光反应15h，利用氨基和活化羧基之间的反应，将PBA接枝到活化的GNCs上，反应原理见图5-②。将反应后的溶液用分子截留量为3kd的超滤离心管中进行离心，在常温下以5000rpm转速离心20分钟，加水，混匀，再离心2次，如此去除未反应的化学试剂。得到的产物命名为GNC-PBA，调节体积至20mL，使得GNC-PBA的PBA端基浓度为30mM。
(5)接枝糖基化胰岛素
取上述(4)得到的GNC-PBA溶液2mL(GNC-PBA的PBA端基浓度为30mM)。称量0.0454g糖基化胰岛素(MW 7513g/mol)溶解到2mL pH＝2的稀盐酸溶液中(糖基化胰岛素浓度为3mM)。将上述两种溶液以体积比1:1混合(确保糖基化胰岛素完全反应)，常温下以500rpm搅拌，避光反应24h，将糖基化胰岛素接枝到GNC-PBA上，得到响应型血糖调节的金纳米簇颗粒GNC-PBA-Insulin(反应原理见图5-③)。得到的GNC-PBA-Insulin溶液中接枝的胰岛素浓度为1.5mM。
(6)对葡萄糖浓度响应智能释放胰岛素的效果评价
分别配制高浓度(22.22mM)和低浓度(5.55mM)葡萄糖溶液各10mL，待用。
设计实验，检验响应型纳米颗粒GNC-PBA-Insulin对葡萄糖浓度的调节变化。取6只干净的容量为1.5mL的离心管，并编号为1、2、3、4、5、6号，其中分别加入：
1号：1mL低浓度葡萄糖溶液+0.5mL GNC-PBA-Insulin溶液，
2号：1mL低浓度葡萄糖溶液+0.5mL Insulin溶液(pH＝2，1.5mM)，
3号：1mL低浓度葡萄糖溶液+0.5mL H2O，
4号：1mL高浓度葡萄糖溶液+0.5mL GNC-PBA-Insulin溶液，
5号：1mL高浓度葡萄糖溶液+0.5mL Insulin溶液(pH＝2，1.5mM)，
6号：1mL高浓度葡萄糖溶液+0.5mL H2O。
其中，1-3号溶液中的葡萄糖浓度为3.7mM，4-6号的葡萄糖浓度为14.8mM。以3号作为对照，评价在低浓度葡萄糖溶液中(3.7mM)，金纳米簇颗粒释放胰岛素的效果及降低血糖的能力(1-3号)。以6号作为对照，评价在高浓度葡萄糖溶液中(14.8mM)，金纳米簇颗粒释放胰岛素的效果及降低血糖的能力(4-6号)。
溶液中葡萄糖浓度的监测：打开血糖仪开关，将血糖试纸插入到血糖仪中，将血糖试纸的采样端浸入到待测溶液中，等待10秒，读数，记录数据，每个样品分别记录三次数据、并取平均值。
在低浓度葡萄糖溶液中，低浓度的葡萄糖很难将糖基化胰岛素从GNC-PBA-Insulin纳米颗粒上取代下来，金纳米簇颗粒不发挥降糖作用(葡萄糖浓度下降不明显)；而在低浓度的葡萄糖溶液中直接加入胰岛素的对照组中，葡萄糖浓度显著下降，大大低于人体正常的血糖范围(图6，图7)。
在且仅在高浓度葡萄糖溶液中(模拟糖尿病中高血糖)，高浓度的葡萄糖与糖基化胰岛素竞争结合位点，将糖基化胰岛素从GNC-PBA-Insulin纳米颗粒上取代下来(原理见图5-④)。一方面，葡萄糖以结合物的形式存在，降低了游离的葡萄糖的浓度；另一方面，被取代释放下来的胰岛素能进一步降低游离葡萄糖的浓度(从14.8mM下降至8.6mM)。因此，在高浓度的葡萄糖溶液中，合成的金纳米簇颗粒能发挥出色的降糖作用(图6，图7)，将葡萄糖浓度降低到正常血糖的范围内(图6)。相较之下，对照组中游离的胰岛素的使用，由于胰岛素的降糖过程不可控，可能导致低血糖事件的发生(图6左)。
(7)不同种类的响应型金纳米簇颗粒的葡萄糖调节效果评价
分别配制高浓度(20mM)和低浓度(5mM)葡萄糖溶液各10mL，待用。
设计实验，对比本发明的响应型金纳米簇颗粒(记为BSA-GNC-PBA-Insulin)与公开号为108079282A的名称为“一种智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒及其制备方法”的专利申请中的金纳米簇颗粒(分别记为CR9-GNC-PBA-Insulin和CR9-GNC-FPBA-Insulin)对葡萄糖浓度的调节变化。取8只干净的容量为1.5mL的离心管，并编号为1、2、3、4、5、6、7、8号，其中分别加入：
1号：1mL 5mM葡萄糖溶液+0.5mL BSA-GNC-PBA-Insulin溶液，
2号：1mL 5mM葡萄糖溶液+0.5mL CR9-GNC-PBA-Insulin溶液，
3号：1mL 5mM葡萄糖溶液+0.5mL CR9-GNC-FPBA-Insulin溶液，
4号：1mL 5mM葡萄糖溶液+0.5mL Insulin溶液(pH＝2，1.5mM)，
5号：1mL 20mM葡萄糖溶液+0.5mL BSA-GNC-PBA-Insulin溶液，
6号：1mL 20mM葡萄糖溶液+0.5mL CR9-GNC-PBA-Insulin溶液，
7号：1mL 20mM葡萄糖溶液+0.5mL CR9-GNC-FPBA-Insulin溶液，
8号：1mL 20mM葡萄糖溶液+0.5mL Insulin溶液(pH＝2，1.5mM)。
其中，1-4号溶液中的葡萄糖浓度为3.33mM，5-8号的葡萄糖浓度为13.33mM。1-8号溶液中药物浓度均为1.5mM/1.5*0.5＝0.5mM。分别评价在低浓度葡萄糖溶液(3.33mM)和高浓度葡萄糖溶液中(13.33mM)中，各类金纳米簇颗粒调节血糖的能力。
在低浓度葡萄糖溶液中，低浓度的葡萄糖很难将糖基化胰岛素从响应型纳米颗粒上取代下来，金纳米簇颗粒不发挥降糖作用(葡萄糖浓度下降不明显)；而在低浓度的葡萄糖溶液中直接加入胰岛素的对照组中，葡萄糖浓度显著下降，大大低于人体正常的血糖范围(图8左)。
在且仅在高浓度葡萄糖溶液中(13.33mM，模拟糖尿病中高血糖)，高浓度的葡萄糖与糖基化胰岛素竞争结合位点，将糖基化胰岛素从响应型金纳米簇颗粒上取代下来，降低葡萄糖浓度，将葡萄糖浓度降低到正常血糖范围内(图8右)。相比之下，BSA-GNC-PBA-Insulin的降低葡萄糖浓度的效果更明显(从13.33mM下降至8.9mM)，降糖作用优于CR9-GNC-PBA-Insulin和CR9-GNC-FPBA-Insulin金纳米簇颗粒(图8右)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种响应型血糖调节的金纳米簇颗粒，其特征在于：包括载体材料、葡萄糖响应的敏感开关因子、药物分子；所述载体材料表面接枝修饰葡萄糖响应的敏感开关因子，所述葡萄糖响应的敏感开关因子表面接枝药物分子；所述载体材料为BSA包被的金纳米簇颗粒；所述葡萄糖响应的敏感开关因子为4-氨基苯硼酸；所述药物分子为胰岛素。
2.根据权利要求1所述的金纳米簇颗粒，其特征在于：所述药物分子为糖基化胰岛素。
3.权利要求1或2所述的金纳米簇颗粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：首先制备BSA包被的金纳米簇颗粒，然后在其表面接枝修饰4-氨基苯硼酸分子作为葡萄糖响应的敏感开关因子，随后在其表面接枝上糖基化胰岛素，得到响应型血糖调节的金纳米簇颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：BSA包被的金纳米簇颗粒表面的氨基需先转化为羧基，并将羧基活化。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：氨基转化为羧基的方法为：用戊二醛去除BSA分子上的氨基，并用甘氨酸将分子末端转换为羧基。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：氨基转化为羧基的方法为：往BSA包被的金纳米簇颗粒溶液中加入戊二醛，利用醛基和氨基生成席夫碱的反应使BSA表面的氨基与戊二醛上的一个醛基反应，再加入甘氨酸，使甘氨酸上的氨基与戊二醛上的另一个醛基反应，使得BSA表面的氨基转换为羧基。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：羧基活化为使用含1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉乙磺酸的活化液进行活化。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）制备BSA包被的金纳米簇颗粒
含HAuCl4、BSA混合溶液在pH≥12的条件下反应得到BSA包被的金纳米簇颗粒BSA-GNCs；
（2）将BSA表面的氨基转换为羧基
先在BSA-GNCs溶液中加入戊二醛，使BSA表面的氨基与戊二醛上的一个醛基反应，再加入甘氨酸，使甘氨酸上的氨基与戊二醛上的另一个醛基反应，得到表面不含氨基、仅含羧基的金纳米簇颗粒GNCs；
（3）活化GNCs表面的羧基
将GNCs加入到含EDC、NHS和MES的溶液反应，活化GNCs上的羧基；
（4）将4-氨基苯硼酸接枝到羧基活化后的GNCs
往羧基活化后的GNCs溶液中加入4-氨基苯硼酸反应，得到4-氨基苯硼酸修饰的金纳米簇颗粒GNC-PBA；
（5）GNC-PBA上接枝糖基化胰岛素
将糖基化胰岛素加入到GNC-PBA溶液中，进行反应，得到响应型血糖调节的金纳米簇颗粒。
9.权利要求1或2所述的金纳米簇颗粒在制备糖尿病治疗药物中的应用。
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