CN108627484A - 一种自动锁相模块及荧光寿命检测方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自动锁相模块及荧光寿命检测方法和装置，其中，用于时间分辨测量的自动锁相模块，包括光斩波器、移动平台、透镜，可以同时控制两条光路的通断状态，因而起到自动锁相的作用。该模块可以用于搭建时间分辨的光谱颊侧设备和成像设备，无需其它锁相控制和脉冲光源。基于这种模块级相关的装置，基于时间门控测量的荧光或者磷光寿命检测方法，可实现在同一时间段内对所有像素点的寿命进行测量，相对于单光子计数的扫描寿命成像，该方法用于寿命成像，具有更快的成像速度。此外，本方法不需要高速相机，可以用普通的图像传感器实现寿命成像，仪器结构相对简单、成本较低。

Description

一种自动锁相模块及荧光寿命检测方法和装置

技术领域

本发明属于光学仪器制造领域，更具体地，涉及一种自动锁相模块及荧光寿命检测方法和装置。

背景技术

在荧光和磷光的测量中，一般需要构建两个光路：光路一是激发光照射样品的光路，即从光源发出的光会聚到样品上，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测器探测样品发光的光路，即样品发光经过透镜、光栅等部件后到达探测器。在稳态的测量过程中，光路一和光路二同时打开，即激发光一直照射样品的条件下测量，这种方式可以获得样品发光光谱和强度的信息，但是不能得到样品激发态寿命的信息。而时间分辨测量可以在光照结束后检测样品的延迟发光，即关闭光路一后，再打开光路二探测，因而降低了生物自身荧光和散射光干扰，显著增加信噪比，具有重要的应用。随着科学的发展，分子的激发态研究在基础科学和检测应用中越来约重要。人们已经发展出各种时间分辨检测仪器(参考中国专利CN201310392018.6、CN200510092520.0、CN201180017387.6、CN201110005032.7、CN2017100426281、CN2017100977867等)，用于光物理研究及生物检测成像。

现有的时间分辨成像的方法主要分为荧光寿命成像和时间门控成像(参考文献：K.Y.Zhang et al，Long-Lived Emissive Probes for Time-ResolvedPhotoluminescence Bioimaging and Biosensing，Chem.Rev.，2018，118，1770-1839)，其中荧光寿命成像的过程是逐个探测各个像素点的发光寿命，从而获得寿命的空间分布图像，由于是逐点探测，成像速度慢，其获取图像的时间随着被探测荧光寿命的增加而延长，难以实时观察。近些年发展了一些特殊的图像传感器，如单光子雪崩二极管(SADP)阵列、可记录相位的CMOS传感器等(参考文献M.Gersbach，et al.High frame-rate TCSPC-FLIMusing a novel SPAD-based image sensor，Proc.SPIE 2010，7780，77801H；R.Franke，G.A.Holst，Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system(pco.flim)based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor，Proc.SPIE 2015，9328，93281K)，同时测量所有像素点的光强，可以用于全局的荧光寿命成像，具有较快的成像速度。时间门控成像是在关闭激发光后经过一个延迟时间，再打开快门进行成像，由于是同时检测所有像素点的延迟发光信号，其成像速度较快，所获得的是延迟发光的强度信息，难以较准确获得发光寿命信息。此外，上述仪器需使用扫描成像系统、时间相关的单光子计数器(time-correlated single photon counting)或条纹相机(Streak Camera)、像增强器等特殊的高速相机，这些设备时间分辨率高，但是价格昂贵，难以普及。

为了降低成本，人们将光斩波器应用到时间分辨的测量中。光斩波器简称斩光器，可以把连续光源发出的光，调制成脉冲或交变的光信号。(参考专利公开说明书CN200710025960.3、CN201310342971.X、CN200410093016.8，中国专利申请号201520771676.0、CN2016111625369等。)传统斩光器主要部件之一是斩光盘，也叫斩光片，斩光盘上分布着几个或多个通光孔，通常这些通光孔以轴心为中心成中心对称分布。当电机控制斩光盘，在一定转速下，连续光源经过斩光盘上的通光孔后，即被调制成一定频率的周期性脉冲光。除了调制脉冲光，还可以作为快门应用于时间门控的发光成像仪器中(参考文献Anal.Chem.2011，83，2294-2300，专利CN201610409306.1)。其中近期发展的一种时间门控的发光成像显微镜(参考文献Auto-phase-locked time-gated luminescencedetection for background-free upconversion spectra measurement and true-colorbiological imaging，Sensors and Actuators B 2018，260，289-294)利用一个斩波器同时用于脉冲光调制和快门控制，通过调节激发和探测光路相对于斩光盘的空间位置，实现两条光路的相位分离和自动锁定，并用于毫秒级的时间门控上转换发光成像。该方法不需要高速相机和复杂的锁相电路，简化了仪器并降低了成本。然而其时间分辨率较低，受斩波器电机转速的限制，还难以用于微秒级延迟发光的探测。此外，这些时间门控检测设备难以获知发光寿命的信息。

由此可见，现有技术存在荧光寿命成像仪器成本高、许多检测寿命的仪器成像速度慢、难以获得发光寿命信息的技术问题。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种自动锁相模块及荧光寿命检测方法和装置，由此解决现有技术存在荧光寿命成像仪器成本高、许多检测寿命的仪器成像速度慢、难以获得发光寿命信息的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种自动锁相模块，包括光斩波器、移动平台和四个透镜；

所述光斩波器固定在移动平台上，所述光斩波器的斩光盘与移动平台的移动方向平行；所述四个透镜均分为两组透镜，所述四个透镜均平行于斩光盘，所述两组透镜同轴放置在斩光盘的两侧，所述两组透镜分别将激发光路和探测光路聚焦于斩光盘；各透镜间的相对位置固定，但是独立于移动平台外，不随移动平台的移动而改变。

按照本发明的另一方面，提供了一种时间分辨光谱检测装置，包括准直光源、反射镜、聚焦透镜、样本架、物镜、光谱仪和上述自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中的激发光路后，被反射镜反射，然后经过聚焦透镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光经过物镜，再经过自动锁相模块中的探测光路后，进入光谱仪。

进一步地，光谱仪为光纤光谱仪，所述光纤光谱仪包括光纤和准直透镜，所述光纤光谱仪在工作时，检测的光经过准直透镜收集到光纤内，经过光纤导入到光纤光谱仪内部进行光谱检测。

按照本发明的另一方面，提供了一种时间分辨成像装置，包括准直光源、反射镜、二向色镜、物镜、样本架、照相机和上述自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中的激发光路后，依次被反射镜、二向色镜反射，然后经过聚焦透镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光依次经过物镜、二向色镜，再经过自动锁相模块中的探测光路后，进入照相机。

按照本发明的另一方面，提供了另外一种自动锁相模块，包括光斩波器、移动平台、三个透镜和光纤；

所述光斩波器固定在移动平台上，所述光斩波器的斩光盘与移动平台的移动方向平行；所述三个透镜中的两个透镜为一组，同轴放置在斩光盘的两侧，平行于斩光盘；所述三个透镜中的另外一个透镜与光纤为一组，放置在斩光盘的两侧，所述光纤的一个端面位于透镜焦点附近，使透镜聚焦的光收集到光纤内部。

按照本发明的另一方面，提供了一种时间分辨光谱检测装置，包括准直光源、样本架、物镜、光谱仪和上述自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中与光纤一组的透镜聚焦到光纤中，从光纤另外一端射出的光照射在样本架的样本上；样本发出的荧光或磷光经过物镜，再经过自动锁相模块中的另外一条光路后，进入光谱仪。

进一步地，光纤光谱仪包括光纤和准直透镜，所述光纤光谱仪在工作时，检测的光经过准直透镜收集到光纤内，经过光纤导入到光纤光谱仪内部进行光谱检测。

按照本发明的另一方面，提供了一种时间分辨成像装置，包括准直光源、透镜、二向色镜、物镜、样本架、照相机和上述的自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中与光纤一组的透镜聚焦到光纤中，从光纤另外一端射出的光经过透镜后，被二向色镜反射，然后经过物镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光依次经过物镜、二向色镜，再经过自动锁相模块中的另外一条光路后，进入照相机。

按照本发明的另一方面，提供了一种可同时用于光谱检测和时间分辨成像的装置，包括准直光源、透镜、二向色镜、物镜、样本架、照相机、分光镜、光谱仪和上述自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中与光纤一组的透镜聚焦到光纤中，从光纤另外一端射出的光经过透镜后，被二向色镜反射，然后经过物镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光依次经过物镜、二向色镜，再经过自动锁相模块中的另外一条光路后，被分光镜分为两束光，其中一束进入照相机，另外一束进入光谱仪。

按照本发明的另一方面，提供了一种荧光和磷光寿命检测方法，所述检测方法使用上述任意一种装置进行检测，检测过程如下：

检测经过自动锁相模块的激发光路和探测光路的相位差随位移距离的变化，在位移距离小于位移阈值时，将相位差对位移距离进行线性拟合；

保持其它测量条件一致，调节移动平台，在不同相位差的条件下检测荧光或者磷光信号的强度；

根据拟合的结果和斩波周期，将相位差换算成延迟时间；

利用荧光或者磷光信号的强度和延迟时间作图，对图进行指数拟合，得到荧光或者磷光寿命。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明中自动锁相模块的锁相原理与斩波器自动锁相的原理一致，在时间分辨检测中，当这两个光路同时经过斩波器的不同位置时，信号是周期性通过斩波器，所以在时间上存在相位差，由于两条光路的相对于斩光盘的位置是可以固定的，因而相位差是自动锁定的。这种锁相方式的优势在于，仪器结构简单，不需要电路控制，并且即使频率抖动，相位差也基本不变。

(2)本发明中自动锁相模块的另外一个特点是使用透镜将经过斩光盘的光束聚焦于斩光盘盘面附近，缩小了光路的直径，便于提高斩光盘更快地开合光路，可显著降低光信号的上升时间，相对于没有透镜的斩波器，该模块具有更高的时间分辨率。

(3)实际的测量中，激发光路和探测光路的固定位置可能不够理想，需要通过调节斩光盘的相对位置来调节相位差，因而本发明中自动锁相模块的中的移动平台起到关键作用，通过调节移动平台，使斩光盘在切向发生位移，因而改变了两个光路经过斩光盘的位置，也就改变了相位差。经过数学运算可以证明，当平台的移动距离远小于斩光半径时，相位差的改变量与平台移动的距离近似成正比，其中斩光半径是指光路经过斩光盘的位置到斩光盘圆心的距离。

(4)本发明中自动锁相模块的的优势在于，使用光纤将较强的激发光限制在纤芯内部传播，极大降低了激发光在系统内部的散射干扰；其次，光纤可以弯曲，便于将激发光以任意角度激发样本。

(5)实际的测量中，通过斩波器的光信号存在上升和下降时间，即便上升和下降时间所占周期比例较大，亦可以通过本发明方法进行拟合得到荧光或磷光寿命。相对于传统的寿命测量方法，本发明方法通过时间门控的测量方式实现荧光磷光寿命的测量，可实现在同一时间段内对所有像素点的寿命进行测量，相对于单光子计数的扫描寿命成像，该方法用于寿命成像，具有更快的成像速度。此外，本发明方法不需要高速相机，可以用普通的图像传感器实现寿命成像，仪器结构相对简单、成本较低。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一维移动平台调节相位差的原理图；

图2为本发明实施例提供的光路1和光路2的与斩光盘的位置关系示意图；

图3为本发明实施例提供的一个测量周期中，发光强度随时间变化示意图；

图4为本发明实施例提供的一种自动锁相模块的部分结构图；

图5为本发明实施例提供的一种自动锁相模块的部分结构图；

图6为本发明实施例提供的一种时间分辨的光谱检测装置示意图；

图7为本发明实施例提供的一种时间分辨成像装置示意图；

图8为本发明实施例提供的一种时间分辨光谱仪和成像装置示意图；

图9为本发明实施例提供的样本BTZ-DMAC的时间分辨的光谱；

图10为本发明实施例提供的激发光路和检测光路的信号强度的周期性变化图；

图11为本发明实施例提供的相位差与相对位移距离的关系图；

图12为本发明实施例提供的样本4CzIPN的稳态荧光成像图；

图13为本发明实施例提供的样本4CzIPN的时间门控成像图；

图14为本发明实施例提供的图像灰度值总和随时间的变化图；

图15为本发明实施例提供的样本4CzIPN的荧光寿命分布图；

图16为本发明实施例提供的样本4CzIPN的荧光寿命平面图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

为实现上述目的，本发明公开一种用于时间分辨测量的自动锁相模块，其作用是分隔激发光路和探测光路，并调节、固定二者的相位。包括一个光斩波器、一个一维移动平台和四个透镜，

其中，光斩波器固定在一维移动平台上，且斩光盘与平台移动方向平行；四个透镜分为两组，每两个透镜为一组，均平行于斩光盘，且每组中的两个透镜同轴放置在斩光盘的两侧，各组透镜各自用于两条不同的光路(激发光路和探测光路)聚焦于斩光盘处；各透镜间的相对位置固定，但是独立于一维移动平台外，不随移动平台的移动而改变。

该模块的锁相原理与斩波器自动锁相的原理一致，在时间分辨检测中，当这两个光路同时经过斩波器的不同位置时，信号是周期性通过斩波器，所以在时间上存在相位差，由于两条光路的相对于斩光盘的位置是可以固定的，因而相位差是自动锁定的。这种锁相方式的优势在于，仪器结构简单，不需要电路控制，并且即使频率抖动，相位差也基本不变。

实际的测量中，激发光路和探测光路的固定位置可能不够理想，需要通过调节斩光盘的相对位置来调节相位差，因而上述模块中的一维移动平台起到关键作用，如附图1所示，通过调节移动平台，使斩光盘在切向发生位移，因而改变了两个光路经过斩光盘的位置，也就改变了相位差。经过数学运算可以证明，当平台的移动距离远小于斩光半径时，相位差的改变量与平台移动的距离近似成正比，其中斩光半径是指光路经过斩光盘的位置到斩光盘圆心的距离。推理过程如下：

假设初始状态斩光盘和两条光路的相对位置如附图2所示，其中光路1和光路2垂直经过斩光盘上的点，夹角θ与光路各自的高度有如下关系：

在此基础上，如果斩光盘的向上移动了一个高度h，则两条光路构成的圆心角变化值Δθ为：

根据反正切函数求导公式：

即只要x变化量足够小，

当h＜＜l₁，l₂时，即可以利用上述近似化简公式(2)：

相位差的计算公式：

其中n为斩光盘的孔数，公式5表明相位差与位移值h成正比。

实际测量中，使用的斩光盘的半径在数厘米以上，而位移台的移动精度可以达到微米级，在毫米级的移动过程中，位移值h远小于厘米级的斩光半径，因而可以用上述近似公式实现相位差的线性调节。

将上述模块用于时间分辨的光谱检测的方法为，使激发光穿过其中一条光路，用于激发样本，使样本发出的荧光或磷光穿过另外一条光路，进入探测器，然后调节移动平台，使两条光路产生合适的相位差，在斩波器转动条件下，便可以测量时间分辨的荧光或磷光信号。其中，如果所用探测器为照相机，便可以用于时间分辨的成像，如果所用探测器为光谱仪，则可以用于时间分辨的光谱检测。

在一些光学应用中，使用光纤导光可能更加方便，为此本发明还公开一种类似的自动锁相模块，包括一个光斩波器、一个一维移动平台、两个透镜、一条光纤和光纤准直透镜；

其中，光斩波器固定在一维移动平台上，且斩光盘与平台移动方向平行；两个透镜为一组，同轴放置在斩光盘的两侧，平行于斩光盘；另外一个透镜为光纤准直透镜与光纤为一组，放置在斩光盘的两侧，并且该光纤的一个端面位于准直透镜焦点附近，使准直透镜聚焦的光收集到光纤内部。

相对于先前的模块，该模块的优势在于，使用光纤将较强的激发光限制在纤芯内部传播，极大降低了激发光在系统内部的散射干扰；其次，光纤可以弯曲，便于将激发光以任意角度激发样本。

该模块同样可以应用于时间分辨的光谱测量和成像中。

上述时间分辨的光谱和成像装置的主要的检测原理如下：由于一个斩光盘同时控制激发光路和探测光路，因而实现了两条光路的自动锁定，调节移动平台，使两条光路的相位错开，就可以使斩波器在切断激发光后，经历一个延迟时间再打开探测光路进行检测，为时间门控的方法。

基于这些装置，本发明公开一种荧光寿命的测量方法，其特征在于，使用前面所述的任意一种装置进行测量，测量过程如下：

检测经过自动锁相模块的两条光路的相位差随位移距离的变化，在较小的位移范围内，将相位差对位移值进行线性拟合；

保持其它测量条件一致，调节一维移动平台，在不同相位差的条件下检测发光信号的强度；

根据拟合的结果和斩波周期，将相位差换算成延迟时间；

然后，用发光强度对相对延迟时间作图，并经过指数拟合，可得到发光的寿命。

下面详细论证上述寿命测量的原理。通常情况下当激发光关闭后，荧光磷光强度符合指数衰减规律，使用传统的装置测量荧光寿命的方法之一是直接测量荧光强度随时间衰减，并按下面公式拟合得到寿命值：

在本方法中，当激发光路被挡住后，荧光强度趋势亦符合上述指数衰减，如附图3所示，与传统测量方法不同的是，本发明方法中，每个周期中测得的荧光强度是快门开启的时间中各时刻荧光强度的总和。快门开启的这段时间可以看作无数小段时间组成，总的光强为各小段时间内光强的加和；由于其中任意一小段时间的光强符合指数衰减，因而总光强可以看成无数小段符合指数衰减的荧光信号在某个快门时间的加和；在同一个周期下测量同一个样本时，只要激光光路和检测光路不同时打开，各小段时间对总的荧光强度所贡献的权重是不变的，因而改变相位差等于将各小段的延迟时间同等改变，即总的荧光强度随着延迟时间的增加也呈指数衰减，因而通过对快门时间内总光强值对延迟时间进行指数拟合就可以得到荧光寿命值。

以单指数衰减的情况来证明上述测量寿命的原理，在某个时刻，延迟时间为t_i，发光强度可以用以下公式描述：

在某个相位下测量经过快门的光强，光强可以分为n各小时间段内光强的总和，如附图3所示，计算如下：

然后移动位移平台，使延迟时间改变了，，此时，光强依然可以分为n个小时间段内光强的总和，计算如下：

由上述公式可知：不管各小段的延迟时间和光强权重是多少，经过快门的总光强随着延迟时间呈指数衰减。该结论同样可以推广到多指数衰减的情况中。

经过前面的数学论证，相位差与斩波器的位移值在一定范围内近似为线性关系，且由于延迟时间与相位差为线性关系，因而经过计算可以将位移值换算成相对延迟时间；进一步，通过改变位移距离可以实现在不同延迟时间下测量经过快门的总光强，因而使用指数拟合就可以得到发光寿命值。

实际的测量中，光信号存在上升和下降时间，即便上升和下降时间所占周期比例较大，亦可以通过上述方法进行拟合得到荧光或磷光寿命。

相对于传统的寿命测量方法，本方法通过时间门控的测量方式实现荧光磷光寿命的测量，可实现在同一时间段内对所有像素点的寿命进行测量，相对于单光子计数的扫描寿命成像，该方法用于寿命成像，具有更快的成像速度。此外，本方法不需要高速相机，可以用普通的图像传感器实现寿命成像，仪器结构相对简单、成本较低。

以上所有时间分辨检测和成像装置的另外一些优势是，可以搭配廉价的准直光源用于测试，例如980nm、808nm等近红外激光器，用于上转换材料或近红外发射材料的时间分辨的成像。

实施例1

一种自动锁相的模块，包括斩波器、透镜(202、203、204、205)、一维移动平台，附图4显示了该模块的主要结构，四个透镜(202、203、204、205)分为两组用于将两条光路聚焦于斩光盘201附近。该模块在使用过程中：一条光路经过透镜202聚焦后穿过斩光盘201，再经过透镜203；另外一条光路经过透镜204聚焦后穿过斩光盘201，再经过透镜205。当斩光盘匀速转动时，可以对两条光路的开关状态进行周期性调制，使二者调制的周期信号的相位相对锁定，因而是自动锁相模块。该图省略了斩光盘相连的电机以及一维移动平台。一维移动平台可选用升降台，如附图1所示，可以用于调节斩光盘相对于光路的高度，从而改变两条光路间的相位差。

第二种自动锁相的模块的主要结构如附图5所示，与附图4的结构类似，所不同的是，附图4中的透镜203被附图5中的光纤206所代替，光纤206用于收集透镜203聚焦的光，优选的，光纤选自石英多模光纤。该模块在使用过程中，可以将准直光源调制成脉冲光并经过光纤输出。其锁相的原理和相位差调节的方式与第一种模块一样。

以上两种模块所用斩光盘的孔数不限，脉冲占空比小于50％。斩光盘上的通光孔可以是一层或两层，根据具体情况选择合适的斩光盘使用。

实施例2

一种时间分辨的光谱检测装置，如附图6所示，使用附图4的模块搭建的装置，激发光路为：从准直光源301射出的光线经过透镜202、斩光盘201、透镜203后，被反光镜302反射，再被透镜303聚焦到样品管308上。检测光路为：样本发出的光相继经过物镜304、透镜204、斩光盘201、透镜205、光纤准直透镜305、光纤306，进入光谱仪307。

实施例3

一种时间分辨的成像装置，如附图7所示，使用附图5的模块搭建的装置，激发光路为：从准直光源301射出的光线经过透镜202、斩光盘201、光纤206、透镜303后，被二向色镜211和反光镜212相继反射，再经过物镜304聚焦到载玻片214上的样品上。检测光路为：样本发出的光经过物镜304后，被反光镜212反射，再相继经过透镜204、斩光盘201、透镜205，进入照相机213。

该装置的激发光从下往上激发样本，适用于倒置荧光成像。根据类似的原理，调节反光镜212，使激发光向下反射，并将物镜移到反光镜下方，可以用落射式的正置荧光成像。

实施例4

一种时间分辨的光谱仪和成像装置，如附图8所示，使用附图5的模块搭建的装置，激发光路为：从准直光源301射出的光线经过透镜202、斩光盘201、光纤206、透镜303后，被二向色镜211和反光镜212相继反射，再经过物镜304聚焦到载玻片2014上的样品上。检测光路为：样本发出的光经过物镜304后，被反光镜212反射，再相继经过透镜204、斩光盘201、透镜205，然后被分光镜215分为两束，其中透射的光束进入照相机213，反射的光束经过透镜216聚焦到光纤306中，最后进入光谱仪307。

实施例5

时间分辨光谱检测，使用实施实例2附图6所示的装置进行检测，所用准直光源为405nm半导体激光器，功率约80mW，所选用的斩光盘的直径约102mm，有10个通光孔，占空比为0.2，物镜为5倍显微镜物镜，光谱仪为上海复享PG2000型光纤光谱仪。待测样品为一种具有延迟荧光的固体粉末：BTZ-DMAC，参考文献制备(F.Ni，et al.J.Mater.Chem.C，2017，5，1363-1368.)。将样本装在透明的样品管308中，调节与斩波器连接的位移平台，使两条光路的相位错开，然后在不同斩波频率下测量光谱，结果如附图9所示，频率从100到1000Hz，时间分辨的荧光强度显示从无到有的增长过程，说明了该方法的可行性。同时光谱中405nm附近的没有显著信号，说明该方法完全消除的散射光干扰。

实施例6

荧光寿命检测和时间分辨成像的应用，使用实施实例3附图7所示的装置进行检测，所用准直光源为405nm半导体激光器，功率约80mW；所选用的斩光盘的直径约102mm，有50个通光孔，占空比为0.25；光纤为直径125微米石英多模光纤，其中纤芯直径105微米；二向色镜为长波通二向色镜，用于反射405nm激光，并使470nm以上波长透过；物镜为20倍显微镜物镜；照相机为14bit的制冷彩色CCD相机，像素140万。

在测量实际样品之前，先得测量相位差和位移距离的换算关系，即测量两条光路的相位差随斩光盘高度的变化情况，测量方法如下：使用一个硅光电二极管检测从光纤206出射的激发光，用于检测激发光信号；使用另外一个硅光电二极管拦截透过二向色镜211、透镜204和斩光盘201的光信号，同时，在载玻片214上方增加一个532nm激光光源，使光穿过物镜304，经反射镜212反射，再透过过二向色镜211、透镜204和斩光盘201照射在硅光电二极管上。由于532nm激光与检测光路重叠，因而可以代表检测光路。将2个硅光电二极管并联接入示波器中，即可以观测光电流的情况。测量时，斩波器转速调节为40转/秒，在不同的高度下，示波器显示的光电流信号如附图10所示，相位差随着位移值增大而增大，并且在大概1mm的位移范围中，相位差与位移值成线性关系，如附图11所示，R平方为0.99941，说明线性度非常好，从实验上证实了相位差的计算公式(5)。

以一种延迟荧光材料4CzIPN(参考文献C.Adachi et al.Nature 2012，492，234-238)的固体粉末为样本(购买自西安宝来特)，进行成像测量。样本置于载玻片214上，载玻片位于一个三维移动平台上，用于调节样本到物镜焦点的位置。在稳态的成像过程中，调节斩光盘高度，使两条光路的相位重叠，在斩光盘静止时成像，结果如附图12所示。

在时间分辨的成像过程中，启动斩波器，使斩光盘以100转/秒匀速转动，调节斩光盘高度，在不同相位差的条件下进行成像，每张图片曝光时间为0.8秒，得到一组图片，其中相位差在0.31左右时的成像结果如附图13所示。选取相位差在0.3到0.4之间的图片，计算图像矩阵中绿色通道的灰度值总和，作为发光强度，将相位差换算成延迟时间，以发光强度对延时时间作图，结果如附图14所示，使用单指数函数拟合得到寿命约2.9微秒。

使用matlab软件处理上述方法获得的一组图片，逐点对各像素的灰度值进行单指数拟合，同时忽略灰度值太低的像素点，得到荧光寿命的空间分布图，如附图15所示，荧光寿命平面图如附图16所示，从两张图中可以看到大部分发光的像素点的寿命在2-3微秒之间，在文献(C.Adachi et al.Nature 2012，492，234-238)报道的4CzIPN在固态条件下的荧光寿命范围内。

这种方法仅仅使用100转/秒的斩波器就实现了微秒级的荧光寿命成像，通过微米精度的位移控制，可以实现延迟时间在微秒范围的连续变化，这种可调的时间范围低于普通图像传感器的延迟和快门。使用更高的斩波器转速可以进一步提高时间分辨率。得益于该方法固有的自动锁相机制，即使斩波器的机械振动导致了较多的频率抖动，也不会引入额外的散射光干扰。相对于单光子计数的扫描成像方法，该方法为全局荧光寿命成像，具有较快的成像速度。在较长荧光寿命的时间分辨成像中更具有实用价值。

将同样的测量方法和数据处理方法应用于附图6和8等时间分辨的光谱检测装置，可实现光谱分辨的荧光寿命检测，即同时检测不同发射波长的荧光寿命。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种自动锁相模块，其特征在于，包括光斩波器、移动平台和四个透镜；

所述光斩波器固定在移动平台上，所述光斩波器的斩光盘与移动平台的移动方向平行；所述四个透镜均分为两组透镜，所述四个透镜均平行于斩光盘，所述两组透镜同轴放置在斩光盘的两侧，所述两组透镜分别将激发光路和探测光路聚焦于斩光盘；各透镜间的相对位置固定，但是独立于移动平台外，不随移动平台的移动而改变。

2.一种时间分辨光谱检测装置，其特征在于，包括准直光源、反射镜、聚焦透镜、样本架、物镜、光谱仪和如权利要求1所述的自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中的激发光路后，被反射镜反射，然后经过聚焦透镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光经过物镜，再经过自动锁相模块中的探测光路后，进入光谱仪。

3.如权利要求2所述的一种时间分辨光谱检测装置，其特征在于，所述光谱仪为光纤光谱仪，所述光纤光谱仪包括光纤和准直透镜，所述光纤光谱仪在工作时，检测的光经过准直透镜收集到光纤内，经过光纤导入到光纤光谱仪内部进行光谱检测。

4.一种时间分辨成像装置，其特征在于，包括准直光源、反射镜、二向色镜、物镜、样本架、照相机和如权利要求1所述的自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中的激发光路后，依次被反射镜、二向色镜反射，然后经过聚焦透镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光依次经过物镜、二向色镜，再经过自动锁相模块中的探测光路后，进入照相机。

5.一种自动锁相模块，其特征在于，包括光斩波器、移动平台、三个透镜和光纤；

所述光斩波器固定在移动平台上，所述光斩波器的斩光盘与移动平台的移动方向平行；所述三个透镜中的两个透镜为一组，同轴放置在斩光盘的两侧，平行于斩光盘；所述三个透镜中的另外一个透镜与光纤为一组，放置在斩光盘的两侧，所述光纤的一个端面位于透镜焦点附近，使透镜聚焦的光收集到光纤内部。

6.一种时间分辨光谱检测装置，其特征在于，包括准直光源、样本架、物镜、光谱仪和如权利要求5所述的自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中与光纤一组的透镜聚焦到光纤中，从光纤另外一端射出的光照射在样本架的样本上；样本发出的荧光或磷光经过物镜，再经过自动锁相模块中的另外一条光路后，进入光谱仪。

7.如权利要求6所述的一种时间分辨光谱检测装置，其特征在于，所述光谱仪为光纤光谱仪，所述光纤光谱仪包括光纤和准直透镜，所述光纤光谱仪在工作时，检测的光经过准直透镜收集到光纤内，经过光纤导入到光纤光谱仪内部进行光谱检测。

8.一种时间分辨成像装置，其特征在于，包括准直光源、透镜、二向色镜、物镜、样本架、照相机和如权利要求5所述的自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中与光纤一组的透镜聚焦到光纤中，从光纤另外一端射出的光经过透镜后，被二向色镜反射，然后经过物镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光依次经过物镜、二向色镜，再经过自动锁相模块中的另外一条光路后，进入照相机。

9.一种可同时用于光谱检测和时间分辨成像的装置，其特征在于，包括准直光源、透镜、二向色镜、物镜、样本架、照相机、分光镜、光谱仪和如权利要求5所述的自动锁相模块，

所述装置在工作时，准直光源发出的光经过自动锁相模块中与光纤一组的透镜聚焦到光纤中，从光纤另外一端射出的光经过透镜后，被二向色镜反射，然后经过物镜聚焦在样本架上的样本上；样本发出的荧光或磷光依次经过物镜、二向色镜，再经过自动锁相模块中的另外一条光路后，被分光镜分为两束光，其中一束进入照相机，另外一束进入光谱仪。

10.一种荧光和磷光寿命检测方法，其特征在于，所述检测方法使用如权利要求1至9中任意一种装置进行检测，检测过程如下：

检测经过自动锁相模块的激发光路和探测光路的相位差随位移距离的变化，在位移距离小于位移阈值时，将相位差对位移距离进行线性拟合；

保持其它测量条件一致，调节移动平台，在不同相位差的条件下检测荧光或者磷光信号的强度；

根据拟合的结果和斩波周期，将相位差换算成延迟时间；

利用荧光或者磷光信号的强度和延迟时间作图，对图进行指数拟合，得到荧光或者磷光寿命。