CN108624566A - 一种抗ct83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗CT83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株。本发明通过基因工程技术制备了高纯度的CT83重组蛋白，用该重组蛋白免疫Balb/c小鼠，筛选出产生CT83蛋白抗体最稳定的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO:C201834。该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，能够检测肿瘤细胞中的CT83蛋白。

Description

一种抗CT83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗CT83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株。

背景技术

肿瘤/睾丸抗原(cancer/testis antigen, CTA)是一类肿瘤抗原，只表达于正常睾丸、胎盘组织以及肿瘤组织中，有高度的组织限制性。它们与肿瘤的发生、发展以及肿瘤的转移等密切相关。大部分肿瘤-睾丸抗原都具有免疫原性，可诱发机体产生细胞免疫和体液免疫，从而发挥抗肿瘤作用。正因为CTA在正常的体细胞中低表达，而在多种肿瘤组织中过表达，使其成为靶向免疫治疗的热点，其中又以 MAGE-A 家族和 NY-ESO-1 的研究最为突出，它们过表达可诱导强大的T细胞反应，成为潜在的免疫治疗靶点。而另外一种新的肿瘤睾丸抗原 CT83最近也成为潜在的靶标。CT83又名KK-LC1，CXorf61，最先是从同种异体的肺癌细胞株来源的cDNA文库中筛选出来的，属于CTAs，后证实其编码基因位于Xq22，可编码合成113个氨基酸。

目前对CT83蛋白的研究甚少，其结构和功能尚未阐明，而且没有特异性检测的单克隆抗体。

发明内容

本发明针对现有技术中没有特异性检测新的肿瘤睾丸抗原 CT83蛋白这一潜在靶标的单克隆抗体的问题，提供一种可被广泛应用，可检测肿瘤组织中CT83蛋白的单克隆抗体及杂交瘤细胞株，该单克隆抗体可直接用于肿瘤细胞和血清中CT83蛋白的检测，有助于肿瘤免疫逃逸机制等的研究。

本发明通过分析获得人CT83蛋白的主要抗原表位区，克隆该区段基因；将克隆的基因插入表达载体，构建重组表达载体；用重组表达载体转化感受态大肠杆菌，诱导表达，纯化获得高纯度的CT83重组蛋白；用该重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从中筛选出产生抗CT83蛋白单克隆抗体最稳定的杂交瘤细胞株，其所产生的抗体即为所需的单克隆抗体。该单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，制备方法简单高效；可通过Western Blot、免疫组织化学染色技术直接用于肿瘤细胞中CT83蛋白含量的检测，也可用于制备ELISA检测试剂盒等。

本发明的第一个目的是提供一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO:C201834。

优选，所述的杂交瘤细胞株是采用SEQ ID NO.1所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠制备得到的。

本发明的第二个目的是提供一种由保藏编号为CCTCC NO:C201834的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

优选，所述的单克隆抗体是对SEQ ID NO.1所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供所述的单克隆抗体在制备检测CT83蛋白含量试剂盒中的应用。

优选，所述的单克隆抗体在制备检测肿瘤组织中CT83蛋白中的应用。

优选，所述的CT83蛋白的第21-113号氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明利用大肠杆菌表达系统成功表达了人CT83蛋白的主要抗原表位区的基因，并且得到了高纯度的表达蛋白，进而用于单克隆抗体的制备，并得到了一组特异性更强，亲和力更高的抗人CT83蛋白单克隆抗体。该抗体可直接用于肿瘤细胞和血清中CT83蛋白的检测。

本发明的杂交瘤细胞株10 605A于2018年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:C201834，分类命名为杂交瘤细胞株10 605A。

附图说明

图1为CT83蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析结果，方框中显示的是选用合成的蛋白序列。

图2为pET28a-CT83蛋白小量诱导表达SDS-PAGE电泳图，Marker为分子量标记，A为未经诱导总菌体裂解液，B为经IPTG诱导总菌体裂解液。

图3为pET28a-CT83诱导表达后菌液裂解上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图，Marker为分子量标记，A为未经诱导的总菌体裂解液，B为经IPTG诱导的总菌体裂解液，C为经IPTG诱导的菌液裂解上清，D为经IPTG 诱导的菌液裂解沉淀。

图4为CT83重组蛋白经纯化后的SDS-PAGE电泳图，Marker为分子量标记，A为超声沉淀用尿素溶解液、B为流穿、C为NTAU-10洗脱液、D为NTAU-20洗脱液、E为NTAU-50洗脱液、F为NTAU-200洗脱液、G为NTAU-500洗脱液洗脱收集的蛋白。

图5为CT83蛋白定量电泳图，Marker为分子量标记，A为1μg BSA标准品，B为2μgBSA标准品，C为4μg BSA标准品，D为1μl CT83蛋白，E为2μl CT83蛋白。

图6为4只小鼠第5次免疫后血清效价检测。

图7为单克隆抗体纯度检测的SDS-PAGE电泳图。

图8为免疫印迹检测肿瘤细胞中CT83的表达情况。

图9为免疫组织化学检测肿瘤组织中CT83的表达情况（400×）。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：重组人CT83蛋白的制备与纯化

1、基因克隆

在NCBI中查找人CT83蛋白氨基酸序列，利用DNAStar软件分析CT83蛋白的免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明人CT83蛋白21-113号氨基酸序列抗原性、亲水性及表面可及性较强，见图1，人CT83蛋白21-113号氨基酸的具体序列如SEQ ID NO.1所示。利用基因合成技术合成编码此段蛋白的目的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。设计该基因PCR引物序列如下：

上游引物：5’-CTGGATCCTATCGTCGTTTTCAGCGTAAC-3’;

下游引物：5’-GCCTCGAGTTAGGTACTTTTACGATGCG-3’。

以合成的目的基因为模板，PCR扩增该基因。将原核表达载体pET28a和扩增的目的基因片段分别用BamH I和Xho I双酶切，利用T4 DNA连接酶连接酶切片段，获得重组表达载体pET28a-CT83，转化E.coli DH5α，挑选阳性克隆提取质粒DNA，进行酶切与测序鉴定。序列完全正确的克隆即可采用。

2、蛋白小量诱导表达

取出E.coli strain BL21（DE3）感受态菌室温放置半融状态，加入5μL测序正确的pET28a-CT83重组质粒，轻搅至混匀，冰浴30min；42℃热休克45-50s，冰浴2min；加入500μL无抗LB液体培养基，37℃摇床培养30min；取菌液100μL涂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml 抗生素（卡那霉素）的3mL LB 培养液的试管中，37℃ 220rpm振摇过夜；次日按1:100接种于含50μg/ml抗生素（卡那霉素）的30ml LB 培养液中，37℃ 220rpm 摇振至菌体OD600为0.6-0.8；取出1ml 培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃ 220rpm振摇4 h，诱导蛋白表达；取出1ml 培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；进行15%SDS-PAGE 分析，见图2。如图2中所示，CT83重组蛋白于14kD附近有一条诱导带。

3、蛋白大量诱导表达与纯化

挑取单菌落于10ml LB培养基（含50μg/ml卡那霉素）中，37℃ 250rpm，过夜；转接1%过夜菌于1000ml LB培养基（含50μg/ml卡那霉素），37℃ 250rpm 3h，然后加入0.5mM IPTG 20℃诱导12h；收集菌液，4℃，5000g，离心15min收集沉淀，-70℃保存。每200ml 菌液离心所得沉淀以10ml破菌缓冲液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂及PMSF至终浓度1mM；超声破碎细菌（300W,10s超声，15s间隔，30次）；将细菌破碎液以10000rpm，10min，4℃离心，离心后分别收集沉淀和上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀；分别取10μl 上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包涵体还是上清表达。其余置于-70℃保存。取3ml 镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10倍体积NTAU缓冲液平衡；将沉淀用尿素溶解，离心取溶解上清，上样于预先平衡好的NTA纯化柱，收集流穿液；样品上样完成后，使用NTAU-0缓冲液洗柱10个柱体积；顺序使用不同咪唑浓度的NTAU-X缓冲液(NTAU-10,20,50,200,500mM)各洗柱1个柱体积，分管收集洗脱液；使用平衡缓冲液洗柱10个柱体积，灌满10-20%乙醇，4℃保存；分步收集不同组分并电泳检测，最终将含目的蛋白的组分混合在一起，蛋白定量电泳确定目的蛋白浓度。蛋白超声破碎电泳图见图3，结果显示，目的蛋白的表达在包涵体沉淀内。蛋白纯化电泳图见图4，CT83蛋白在变性条件下与 NTA 柱结合效果较好，在50-500mM 咪唑处可洗脱获得目的蛋白。蛋白定量电泳图见图5，由图中所示，CT83蛋白浓度约为1.0mg/ml，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2：杂交瘤细胞系的建立

1、免疫

将实施例1中纯化的蛋白用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，按每只小鼠60μg蛋白的量，皮下注射初次免疫4只SPF级Balb/c雌性小鼠，编号为：1,2,3,4。初次免疫过后分别于第14天，第28天，第42天，第56天进行加强免疫，蛋白用弗氏非完全佐剂（Sigma）乳化免疫剂量为每次30μg/只。最后一次免疫过后第9天进行眼眶取血，收集小鼠血清，将小鼠血清从200开始2倍梯度稀释，空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清200倍稀释。用间接ELISA方法进行血清效价测定，效价为大于最大OD/2的最小OD读数所对应的稀释度。选取血清效价最高的小鼠于融合前3天进行冲击免疫，剂量为50μg。4只小鼠第5次免疫后血清效价检测见图6。免疫小鼠用的抗原为CT83重组蛋白。

2、细胞融合

将超免3天后的小鼠脊椎脱臼处死后摘取脾脏，冲洗研磨出脾细胞，将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞用PEG1500（Sigma公司）作为融合剂进行细胞融合，再加入制备好的胸腺细胞于半固体培养基（含HAT）中进行筛选培养。

3、挑克隆

培养10天后，挑10板*93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板中（提前用胸腺细胞铺板，100μl/孔）。

4、间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

4天后用CT83蛋白包板，采用间接ELISA方法对细胞上清液进行效价测定。将筛选出的阳性细胞株再次采用间接ELISA方法，筛选出阳性细胞株。

实施例3：细胞株建立与腹水诱生法制备单克隆抗体

1、细胞株建立

经第一次间接ELISA实验筛选，得到14株阳性杂交瘤细胞株。将14株阳性的细胞株，采用间接ELISA实验做第二次筛选，得到3株阳性杂交瘤细胞株。选取其中一株扩大培养，命名为杂交瘤细胞株10 605A，分别用于液氮冻存和单克隆抗体腹水的制备。此杂交瘤细胞株10605A于2018年2月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为杂交瘤细胞株10 605A，其保藏编号为CCTCC NO:C201834。

2、腹水制备

用生理盐水悬浮处于对数生长期的杂交瘤细胞，调整细胞密度为5×10⁵个/ml。将悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠；7天后开始收集腹水，取出的腹水5000rpm离心10min；小心吸出中间的腹水收集于离心管中，-20℃保存。

3、单克隆抗体的纯化

用偶联缓冲液以1:3稀释腹水，12000rpm 4℃离心10min，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，过Protein A亲和层析柱，洗脱液进行洗脱，收集于EP管中。SDS-PAGE胶鉴定纯度。以IPTG诱导表达的CT83蛋白为电泳样品，进行SDS-PAGE电泳，按常规方法将凝胶蛋白带转移到PVDF膜（Millipore公司）上。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中封闭30min。加入单克隆抗体4℃过夜。用TBST洗膜后，加入1:5000稀释的羊抗鼠二抗（碧云天）室温孵育1h。再次TBST洗膜，加入化学发光液（Millipore公司），在可见荧光成像系统(Azure C400)中进行化学发光图像数据的采集。单克隆抗体纯化后的浓度为1.5mg/mL。单克隆抗体纯化的SDS-PAGE电泳图见图7，分子量为15kD。

实施例4：单克隆抗体的鉴定

1、单克隆抗体亚类鉴定

采用Southern Biotech公司SBA Clonotyping System-HRP试剂盒（IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM 、λ、κ）对阳性细胞株产生的单克隆抗体进行鉴定，方法为间接ELISA 法，实验步骤按照说明书进行。结果显示本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

2、亲和常数测定

用包被液稀释CT83重组蛋白，终浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，PBST洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBST洗涤3次。纯化的单克隆抗体从1:200开始2倍梯度稀释，最后1孔为空白对照，37℃孵育1h，PBST洗3次。加入稀释20000倍的二抗，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。每孔加入100μl显色液，5min后加50μl硫酸溶液终止反应。

用酶标仪测定每孔的OD值，如表1所示，画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出上平台1/2OD值所对应的抗体稀释倍数A，然后利用下列公式计算出亲和常数为2.8×10⁹。该计算公式为：亲和常数≈150000×A/抗体浓度。

表1 OD值结果

抗体稀释倍数	200	400	800	1600	3200	6400	12800	25600	51200	102400	204800	空白
													OD值	1.05	1.048	1.001	0.99	0.886	0.799	0.669	0.542	0.437	0.277	0.188	0.094

实施例5：单克隆抗体用于检测

1、免疫印迹技术检测单克隆抗体的特异性

提取人结肠癌细胞株RKO和SW1116、肺癌细胞株NCI-H1299、肝癌细胞株HuH-7、宫颈癌细胞株HeLa、乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231、鼻咽癌细胞株HNE-1和CNE-2、人胚胎肾细胞293T细胞中的总蛋白，加入计算量的上样缓冲液后，将上述蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后于250mV，1.5h条件下电转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1h后，TBST洗涤3次。用纯化的单克隆抗体作为一抗，按1:1000稀释后，4℃震荡孵育过夜，TBST洗涤3次后。用1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP作为二抗，室温孵育1h，TBST洗涤3次后，加入适量发光液于PVDF膜上，置于Azure C400成像系统中进行发光检测。结果如图8所示。免疫印迹结果显示以上肿瘤细胞均表达CT83蛋白，而293T细胞并不表达CT83蛋白。

2、免疫组织化学技术检测单克隆抗体的特异性

①将人肺癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、子宫内皮样腺癌组织石蜡切片浸泡于二甲苯中，微波炉加热5min；再次将石蜡切片浸泡入二甲苯中，微波炉加热5min；再分别浸泡于无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇溶液中5min两次；然后用自来水进行冲洗。②将切片至3%H₂O₂溶液中室温孵育10min，用PBST洗涤3次。将切片浸泡至柠檬酸盐缓冲液中，高压修复10min后，用PBST洗涤3次。将切片浸泡至5%BSA溶液中封闭20min。将切片上液体甩掉，用免疫组化笔将切片上的组织画圈后，滴加50 μL一抗（已经纯化的抗CT83蛋白单克隆抗体1:200稀释）于组织上，于4℃孵育过夜。用PBST洗涤切片3次后，再在组织处加IgG-HRP二抗，于室温孵育1h后，PBST洗涤3次。滴加DAB显色液于组织上，显色时间5min左右。将切片用流水冲洗后，用苏木素复染1min；再次用流水冲洗后，用1%盐酸酒精分化，用流水冲洗；再次浸泡于75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇溶液中5分钟两次，于二甲苯溶液中浸泡5min两次后，用中性树胶封片。显微镜下观察染色结果并拍摄图像。如图9所示，免疫组织化学检测了人肺癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、子宫内皮样腺癌共9中组织，结果显示CT83蛋白着色主要定位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆中。

虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 广东医科大学

<120> 一种抗CT83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 93

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Tyr Arg Arg Phe Gln Arg Asn Thr Gly Glu Met Ser Ser Asn Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ala Leu Val Arg Pro Ser Ser Ser Gly Leu Ile Asn Ser Asn

20 25 30

Thr Asp Asn Asn Leu Ala Val Tyr Asp Leu Ser Arg Asp Ile Leu Asn

35 40 45

Asn Phe Pro His Ser Ile Ala Arg Gln Lys Arg Ile Leu Val Asn Leu

50 55 60

Ser Met Val Glu Asn Lys Leu Val Glu Leu Glu His Thr Leu Leu Ser

65 70 75 80

Lys Gly Phe Arg Gly Ala Ser Pro His Arg Lys Ser Thr

85 90

<210> 2

<211> 279

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

tatcgtcgtt ttcagcgtaa caccggcgaa atgagcagta atagtaccgc actggcactg 60

gttcgtccga gtagcagcgg tctgattaat agcaacaccg ataacaacct ggccgtttac 120

gatctgagcc gcgatattct gaacaacttc ccgcatagca ttgcgcgtca aaaacgcatt 180

ctggtcaacc tgagcatggt cgagaacaaa ctggtcgaac tggaacatac cctgctgagt 240

aaaggttttc gcggcgcttc tccgcatcgt aaaagtacc 279

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:C201834。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株是采用SEQIDNO.1所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠制备得到的。

3.一种由保藏编号为CCTCC NO:C201834的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是对SEQ IDNO.1所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。

5.权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测CT83蛋白含量试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是所述的单克隆抗体在制备检测肿瘤组织中CT83蛋白中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的CT83蛋白的第21-113号氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。